金元昌，陳 壯，李玉峰，袁志棟

(1.湖南科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湘潭 411201； 2.廣西大學(xué) 養(yǎng)禽與禽病研究所，南寧 530004)

抗性選育協(xié)同疫苗免疫對雞羽囊馬立克病毒載量的影響

金元昌1，2*，陳 壯1，李玉峰1，袁志棟1

(1.湖南科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湘潭 411201； 2.廣西大學(xué) 養(yǎng)禽與禽病研究所，南寧 530004)

為了研究馬立克病(MD)火雞皰疹病毒(HVT)疫苗接種和抗性選育對雞馬立克病毒(MDV-1)攻毒后羽囊中病毒載量的影響，選擇普通霞煙雞及其MD抗性品系，利用MDV-1攻毒后第7、14、21、28和35 天(DPI)五次采集并分離的全部試驗(yàn)雞的羽囊為材料，采用Real-time FQ-PCR技術(shù)對這些材料中meq基因進(jìn)行絕對定量分析以確定其病毒載量，用來分析比較MDV-1在MD抗性/普通雞及HVT疫苗免疫/HVT疫苗未免疫雞體內(nèi)的增殖情況。結(jié)果顯示：1)從MD抗性對病毒載量的影響看，一方面，普通非免疫攻毒組(F組)的MDV-1含量于14、21DPI時(shí)顯著(P<0.05)高于MD抗性非免疫攻毒組(T組)；另一方面，MD抗性免疫攻毒組(R組)的MDV-1含量總體上卻和普通免疫攻毒組(G組)相當(dāng)。2)從HVT疫苗免疫對病毒載量的影響看，一方面，MD抗性非免疫攻毒組(T組)的MDV-1含量于28 DPI時(shí)顯著(P<0.05)高于MD抗性免疫攻毒組(R組)；另一方面，普通非免疫攻毒組(F組) 的MDV-1含量于14、21 DPI時(shí)顯著(P<0.05)高于普通免疫攻毒組(G組)。3)從MD抗性協(xié)同HVT疫苗免疫對病毒載量的影響看，普通非免疫攻毒組(F組)的MDV-1含量于14(P<0.05)、28(P<0.01)、35(P<0.05)DPI時(shí)顯著高于MD抗性免疫攻毒組(R組)。結(jié)果表明，雞MD抗性選育協(xié)同HVT疫苗接種可顯著降低雞羽囊的病毒載量，這將會降低MDV-1傳播風(fēng)險(xiǎn)，并提高雞的存活機(jī)會。

馬立克病毒；羽囊；實(shí)時(shí)定量PCR；抗性選育；絕對定量

馬立克病(Mark’s disease，MD)是由馬立克病病毒(Mark’s disease virus，MDV)引起的一種惡性T淋巴細(xì)胞腫瘤，病毒經(jīng)空氣傳播，傳染力強(qiáng)，被感染雞表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、腫瘤和死亡，是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的三種主要疾病之一。

在被MDV感染的雞的所有組織中，只有雞羽毛囊上皮細(xì)胞可產(chǎn)生大量有囊膜的、完全具有感染性的病毒粒子，因而羽囊在MDV傳播中起重要作用。雞羽毛囊上皮細(xì)胞中的病毒粒子有囊膜，隨角化細(xì)胞脫落，成為傳染性很強(qiáng)的無細(xì)胞病毒。能夠?qū)τ鹉抑蠱DV進(jìn)行檢測是非常有用的，因?yàn)橛鹉夷軌蛟诓灰髿⑺离u的情況下，在一定的時(shí)間段內(nèi)簡便地作為樣本以便對MDV的定性[1-2]及定量檢測。對潛入雞個(gè)體羽囊中MDV含量的測定能有助于判定疫苗對雞是否有效，也能用于協(xié)助確定疫苗使用的最佳路線、接種疫苗的最佳時(shí)間等。對于被MDV感染的雞，羽囊中的病毒負(fù)載量可能也是發(fā)病情況以及傳染能力的一個(gè)有用的預(yù)測器。

在對MDV基因組DNA 70～80個(gè)特異區(qū)域或基因進(jìn)行的生物學(xué)功能研究中，共計(jì)46個(gè)MDV特異性多肽得到鑒定，將它們分成三類：糖蛋白基因(gB等)，致瘤相關(guān)基因(132-bpr序列、meq和pp38)及其他基因。1992年，meq基因首次由D.Jones等[3]鑒定，更重要的是發(fā)現(xiàn)它在MDV導(dǎo)致的T淋巴細(xì)胞瘤中高度表達(dá)。J.L.Liu等[4]通過meq基因的結(jié)構(gòu)以及制備單克隆抗體對meq基因進(jìn)行了較全面的研究，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果推斷，meq是一個(gè)多功能的轉(zhuǎn)錄因子，可能對MDV和宿主細(xì)胞的基因表達(dá)有調(diào)控作用。

作者利用Real-time FQ-PCR絕對定量法，通過對MDV-1攻毒后MD抗性與普通霞煙雞meq基因拷貝數(shù)的絕對定量，從而對羽囊中MDV-1含量進(jìn)行檢測，以分析比較MDV-1在MD抗性雞組/普通雞組，及HVT疫苗免疫雞組/HVT疫苗未免疫雞組體內(nèi)的增殖情況。

1 材料與方法

1.1 病毒和實(shí)驗(yàn)動物

MDV-1強(qiáng)毒株YL040920/C6株為廣西大學(xué)養(yǎng)禽與禽病研究所分離[5-6]并保存。7日齡健康霞煙雞來自廣西容縣科技局實(shí)驗(yàn)雞場保種的霞煙雞MD抗性品系核心群[7-10]的后代。

1.2 主要試劑和儀器

SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real-Time)購自TaKaRa公司；Light Cycle2.0 型PCR 儀為德國 ROCHE 公司產(chǎn)品。

1.3 雞攻毒試驗(yàn)

利用YL040920/C6攻毒的DEF細(xì)胞培養(yǎng)物，按每羽0.3 mL對實(shí)驗(yàn)雞進(jìn)行腹腔注射，1個(gè)月后翼下采集抗凝血，并分離雞的外周血淋巴細(xì)胞，經(jīng)禽腫瘤病三重PCR診斷技術(shù)[11]檢測呈單一MDV-1攻毒后，采集雞翅靜脈抗凝血(經(jīng)病毒蝕斑計(jì)數(shù)每0.4 mL血液含2 500 PFU的MDV-1)作為攻毒材料。試驗(yàn)分組：74羽普通霞煙雞分為E組(未攻毒、未免疫的空白對照組，20羽)、F組(未免疫、MDV-1攻毒組，24羽)和G組(HVT免疫、MDV-1攻毒組，30羽)三組；77羽MD抗性霞煙雞分為S組(未攻毒、未免疫的空白對照組，20羽)、T組(未免疫、MDV-1攻毒組，30羽)和R組(HVT免疫、MDV-1攻毒組，27羽)三組。7 d齡時(shí)取準(zhǔn)備好的攻毒材料腹腔(0.4 mL·羽-1)注射F、G、T、R組雞，于第7、14、21、28、35天(DPI)采集所有試驗(yàn)雞有髓質(zhì)的羽囊，按常規(guī)方法將試驗(yàn)雞隔離飼養(yǎng)，期間要記錄攻毒后死亡雞及存活雞的腫瘤發(fā)生及其檢測結(jié)果。

1.4 羽囊總DNA的提取

采集有髓質(zhì)的試驗(yàn)雞的羽囊，擠壓出羽髓并剪下羽毛根，研磨后按1∶5(W/V)加入PBS，反復(fù)凍融3 次，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min；取300 μL 上清，加入等體積的組織裂解液及5 μL蛋白酶K(20 mg·mL-1)，50 ℃消化2 h，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min；吸取上清，加入等體積的Tris 飽和酚，充分振蕩混勻，4 ℃ 12 000 r·min-1離心 10 min；取上層的水相加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混勻后，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min；取上層的水相加入2 倍體積預(yù)冷的無水乙醇和1/10 體積的3 mol·L-1乙酸鈉，在-20 ℃放置2 h；4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min；小心傾棄上清，沉淀用70%乙醇1 mL 于4 ℃ 8 500 r·min-1離心 5 min 漂洗后，傾棄上清，室溫風(fēng)干15 min，用40 μL 含RNase A(終濃度為20 μg·mL-1)的TE 緩沖液溶解，放置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 羽囊中meq基因Real-time FQ-PCR

以上述提取的試驗(yàn)雞羽囊(分別于7、14、21、28 和 35 DPI)的DNA為模板，每個(gè)樣本的模板重復(fù)2孔，利用已建立的檢測meq基因的Real-time FQ-PCR方法[12]擴(kuò)增并檢測熒光，得到模板起始拷貝數(shù)所對應(yīng)的Ct值。

1.6 數(shù)據(jù)表示和統(tǒng)計(jì)分析

Real-time FQ-PCR反應(yīng)后，將得到的各樣品模板的起始拷貝數(shù)所對應(yīng)的Ct值代到meq基因標(biāo)準(zhǔn)曲線公式[12](Ct值即y值)：y=-3.32x+34.94中，計(jì)算每個(gè)樣品中所含meq基因的拷貝數(shù)，再計(jì)算出MDV-1基因組的拷貝數(shù)(每個(gè)MDV基因組含兩個(gè)meq基因)。采用t檢驗(yàn)對每組MDV-1基因組含量進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié) 果

未攻毒的兩個(gè)對照組(S、E組)羽囊中均無MDV-1檢出。試驗(yàn)雞的各攻毒組羽囊中 MDV-1在攻毒后第7天就開始被檢測到，但是第7天只能檢測到極少的量，在第14天達(dá)到最高峰，然后在第21、28、35天逐漸減少(表1)。

2.1 MD抗性品系羽囊中病毒載量的動態(tài)變化比較

在MDV-1攻毒后不同時(shí)間，測定MD抗性雞的免疫攻毒組(R組)和非免疫攻毒組(T組)羽囊中MDV-1含量，結(jié)果見表1，T組的MDV-1含量于14、35 DPI時(shí)高于(P>0.05)R組，于28 DPI時(shí)顯著高于(P<0.05)R組，于21 DPI時(shí)稍低于(P>0.05)R組。結(jié)果表明，對于MD抗性雞，T組的MDV-1含量部分高于R組。

組別Group接種后不同時(shí)間(DPI)的病毒載量(log10/106個(gè)細(xì)胞)LoadofMDV-1indifferentdaypostinfection(log10/106cells)714212835T0±02.789±0.078b2.725±0.062bc2.396±0.049a2.071±0.062abR0±02.756±0.128b2.797±0.145ab2.305±0.045bc1.981±0.032bcF0±02.963±0.040a2.917±0.037a2.406±0.045aA2.149±0.110aG0±02.813±0.035b2.774±0.039b2.354±0.025ab2.104±0.076ab

同列中含相同字母肩注表示差異不顯著(P>0.05)；肩注小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；肩注大小寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)

In the same column，the same letter means no significant difference between treatments (P>0.05)；different small letters mean significant difference (P<0.05)；the different capital and small letters mean extremely significant difference (P<0.01)

2.2 普通品系雞(F/G)組內(nèi)羽囊中病毒載量的動態(tài)變化比較

在MDV-1攻毒后不同時(shí)間，測定普通雞的免疫攻毒組(G組) 和非免疫攻毒組(F組)羽囊中MDV-1含量，結(jié)果見表1，F(xiàn)組的MDV-1含量于14、21 DPI時(shí)顯著高于(P<0.05)G組，于28、35 DPI時(shí)高于(P>0.05)G組。結(jié)果表明，對于普通雞，F(xiàn)組的MDV-1含量部分高于G組。

2.3 普通雞(F/G)和MD抗性雞(T/R)組間羽囊中病毒載量的動態(tài)變化比較

在MDV-1攻毒后不同時(shí)間，MD抗性非免疫攻毒組(T組)和普通非免疫攻毒組(F組)羽囊中MDV-1含量結(jié)果見表1，F(xiàn)組的MDV-1含量于14、21DPI時(shí)顯著高于(P<0.05)T組，于28、35 DPI時(shí)高于(P>0.05)T組。結(jié)果表明，F(xiàn)組的MDV-1含量部分高于T組。

在MDV-1攻毒后不同時(shí)間，MD抗性免疫攻毒組(R組)和普通免疫攻毒組(G組)羽囊中MDV-1含量見表1，G組的MDV-1含量于14、28、35 DPI時(shí)高于(P>0.05) R組，于21 DPI時(shí)稍低于(P>0.05) R組。結(jié)果表明，G組的MDV-1含量總體上和R組相當(dāng)。

在MDV-1攻毒后不同時(shí)間，測定MD抗性非免疫攻毒組(T組)和普通免疫攻毒組(G組)羽囊中MDV-1含量，結(jié)果見表1，G組的MDV-1含量于14、21、35 DPI時(shí)高于(P>0.05) T組，于28 DPI時(shí)稍低于(P>0.05) T組。結(jié)果表明，G組的MDV-1含量總體上和T組相當(dāng)。

在MDV-1攻毒后不同時(shí)間，測定MD抗性免疫攻毒組(R組)和普通非免疫攻毒組(F組)羽囊中MDV-1含量，結(jié)果見表1，F(xiàn)組的MDV-1含量于14(P<0.05)、35(P<0.05) DPI時(shí)顯著高于R組，于28 DPI時(shí)極顯著高于(P<0.01)R組，于21 DPI時(shí)高于(P>0.05) R組。結(jié)果表明，F(xiàn)組的MDV-1含量總體上高于R組。

3 討 論

MDV按其致病性和血清學(xué)反應(yīng)不同分為三個(gè)血清型：血清Ⅰ型(MDV-1)，包括所有致瘤致病的強(qiáng)毒株及其弱化株以及天然弱毒株；血清Ⅱ型(MDV-2)，為自然的非致瘤株；血清Ⅲ型(MDV-3)，為火雞皰疹病毒(hepresviurs of turkeys，HVT)，對雞沒有致病性。三個(gè)血清型之間具有一定的交叉免疫保護(hù)。因此，自從20世紀(jì)70年代以來，MD的預(yù)防很大程度上依靠使用血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒的單價(jià)、二價(jià)或多價(jià)疫苗接種。

疫苗免疫、抗病育種和生物安全是控制MD的三大主要措施。由于多方面的原因：強(qiáng)毒株和野外變異株的不斷出現(xiàn)、雛雞的早期感染、MDV的廣泛存在以及疫苗使用不當(dāng)，導(dǎo)致免疫雞群甚至于免疫過CVI988/Rispens株疫苗(目前最好的MD疫苗)的雞群仍有MD的暴發(fā)。目前，雞的基因組序列已完成，加之更為高效疫苗的研究變得越來越難的情形下，促使人們更重視抗病育種，采用遺傳學(xué)方法從遺傳本質(zhì)上提高家禽的抗病能力就成為有效控制MD的重要策略。研究者們注意到不同遺傳品系的雞對MD的易感性不同，并研究培育出抗MD的雞品系。本研究中所用實(shí)驗(yàn)雞就是李康然等在20世紀(jì)90年代初期用表型遺傳標(biāo)記選育的方法選育的廣西抗MD霞煙雞[7]。

本研究就MD抗性選育和疫苗免疫對雞羽囊MDV-1載量的影響進(jìn)行了初步的分析比較，從MD抗性對病毒載量的影響看，普通非免疫雞MDV-1的含量在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上顯著高于MD抗性非免疫雞間，然而，MD抗性免疫攻毒組MDV-1含量和普通免疫攻毒組總體上相當(dāng)，這說明非免疫情況下MD抗性雞相對于普通雞保持了較好的MD抗性水平，不過，免疫因素使情況變得復(fù)雜了。從HVT疫苗免疫對病毒載量的影響看，MD抗性非免疫攻毒組MDV-1的含量在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上顯著高于MD抗性免疫攻毒組，普通非免疫攻毒組MDV-1含量在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上顯著高于普通免疫攻毒組，這說明HVT疫苗對MD感染雞群具有極大的保護(hù)作用。尤其引人注意的結(jié)果是，普通非免疫攻毒組MDV-1含量在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上顯著高于MD抗性免疫攻毒組，說明MD抗性選育協(xié)同HTV疫苗對雞MD具有更強(qiáng)的抵抗作用。與之相反，MD抗性非免疫攻毒組MDV-1含量和普通免疫攻毒組近似，說明MD抗性育種對病毒載量的影響也許和HVT疫苗免疫對病毒載量的影響相互抵消了?？傊?，雞MD抗性選育協(xié)同HTV疫苗接種可顯著降低雞羽囊的病毒載量。理論上，該結(jié)果為較深入地探究雞抗MD的遺傳基礎(chǔ)及其分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)；同時(shí)也為MD的預(yù)防等實(shí)踐工作提供了思路。

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(編輯 白永平)

Effects of Resistance Selection in Coordination with Vaccination on MDV-1 Loads in Feather Follicle of Chickens

JIN Yuan-chang1，2*，CHEN Zhuang1，LI Yu-feng1，YUAN Zhi-dong1

(1.CollegeofLifeScience，HunanUniversityofScienceandTechnology，Xiangtan411201，China；
2.PoultryScienceandHealth，GuangxiUniversity，Nanning530004，China)

The aim of the present study was to study the effects of HVT-vaccinated and MD resistant selection on virus loads in feather follicle of chickens after the challenge with MDV-1.Real-time FQ-PCR was used for absolute quantification of the DNA levels ofmeqof feather follicle sampled in 5 different times(7，14，21，28，35 DPI) from all chickens after the challenge for quantification of MDV-1.The load of MDV-1 was detected in feather follicle to analyzed and compared proliferation of MDV-1 in resistant/common or/and HVT-vaccinated/HVT-unvaccinated chickens.The results showed that 1) from the impact of MD-resistant on the MDV-1 loads，the load of MDV-1 were significantly higher in chickens of F group(common line，HVT-unvaccinated and MDV-challenged) whereas significantly lower(P<0.05) in chickens of T group(MD-resistant line，HVT-unvaccinated and MDV-challenged) in 14，21 DPI；On the one hand，R group(MD-resistant line，HVT-vaccinated and MDV-challenged) and G group(common line，HVT-vaccinated and MDV-challenged) give about the same load of MDV-1；2) From the impact of HVT-vaccinated on the MDV-1 loads，the load of MDV-1 were significantly higher in chickens of T group(MD-resistant line，HVT-unvaccinated and MDV-challenged) whereas significantly lower(P<0.05) in chickens of R group(MD-resistant line，HVT-vaccinated and MDV-challenged) in 28 DPI；On the one hand，the load of MDV-1 were significantly higher in chickens of F group(common line，HVT-unvaccinated and MDV-challenged) whereas significantly lower(P<0.05)in chickens of G group(common line，HVT-vaccinated and MDV-challenged) in 14，21 DPI：3) From the impact of MD-resistant and HVT-vaccinated on the MDV-1 loads，the load of MDV-1 were significantly higher in chickens of F group(common line，HVT-unvaccinated and MDV-challenged) whereas significantly lower in chickens of R group(MD-resistant line，HVT-vaccinated and MDV-challenged) in 14(P<0.05)，28(P<0.01) and 35(P<0.05)DPI.These results indicated that the virus loads in feather follicle of chickens can be reduced significantly by resistance selection in coordination with vaccination，which will reduce the risk of MDV-1 transmission and improve the chicken’s chance of survival.

Marek’s disease virus(MDV)；feather follicl；Real-time FQ-PCR；resistance selection；absolute quantization

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.021

2014-09-17

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(13JJ6055)；湖南省普通高?；瘜W(xué)與生物科學(xué)類專業(yè)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練中心(G21323)；湖南科技大學(xué)化學(xué)與生物學(xué)省級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練中心項(xiàng)目

金元昌(1969-)，男，山東日照人，副教授，博士，主要從事分子病毒學(xué)與基因工程方面的研究

*通信作者：金元昌，E-mail：404340774@qq.com

S852.659.1

A

0366-6964(2015)05-0836-05