劉丹丹，趙 元，韓 蕊，張詩堯

(吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，吉林省動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，長春130118)

β-Conglycinin酶解肽對仔豬空腸上皮細胞通透性及緊密連接蛋白表達的影響

劉丹丹，趙 元*，韓 蕊，張詩堯

(吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，吉林省動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，長春130118)

本研究通過測定大豆抗原β-Conglycinin酶解肽(52 ku)對仔豬空腸上皮細胞(IPEC)通透性及緊密連接蛋白Occludin與ZO-1 基因mRNA表達的影響，為探索其對腸道損傷的相關(guān)機制提供依據(jù)。本試驗分別采用不同濃度(0、0.125、0.25、0.5、1、2 mg·mL-1)52 ku酶解肽處理IPEC 2、4、6、8、12、24 h后，通過測定細胞存活力(MTT值)、跨上皮細胞電阻值(TEER)以及細胞培養(yǎng)液中堿性磷酸酶(AP)的活性，檢測52 ku酶解肽對細胞膜通透性的影響。并選取0.5 mg·mL-152 ku酶解肽處理IPEC 24 h后，用實時熒光定量PCR方法檢測Occludin與ZO-1基因 mRNA表達量的變化情況。結(jié)果表明，52 ku酶解肽處理仔豬空腸上皮細胞后，MTT值和TEER呈時間-劑量依賴性降低(P<0.05)。24 h處理后，AP活性呈顯著升高趨勢(P<0.05)。與對照組相比，52 ku酶解肽可使Occludin和ZO-1 基因mRNA相對表達量均呈顯著下降趨勢(P<0.05)?？傊?2 ku酶解肽使仔豬空腸上皮細胞通透性增加，并降低Occludin或ZO-1的 mRNA表達。

大豆抗原β-Conglycinin；52 ku酶解肽；仔豬；IPEC；緊密連接

大豆因其蛋白質(zhì)含量豐富而成為機體主要的蛋白質(zhì)來源之一，但與此同時也是人和動物的重要過敏原之一，使得大豆的食用和飼用價值受到了極大的影響[1]。其中β-伴大豆球蛋白(β-Conglycinin)是主要致敏原之一。近些年研究發(fā)現(xiàn)，β-Conglycinin進入機體消化道后，即使經(jīng)過消化酶降解后仍存在抗酶解的肽段。其中52 ku酶解肽是經(jīng)胃蛋白酶酶解后仍含量較多的酶解肽段，其上存有胃蛋白酶和胰蛋白酶酶切位點[2-3]，有完整的IgG和IgE抗體結(jié)合表位，并具有免疫活性，對仔豬過敏起著重要作用。

腸上皮細胞之間主要通過緊密連接進行連接的，緊密連接對維持和調(diào)節(jié)腸道機械屏障的通透性起重要作用。緊密連接蛋白主要包括跨膜蛋白(如：Occludin蛋白)和胞質(zhì)蛋白(如：ZO-1蛋白)。Occludin蛋白對腸道屏障功能起到維持和調(diào)節(jié)作用。ZO-1蛋白不僅與腸道屏障功能和通透性功能的變化情況有關(guān)，還在細胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運和細胞增殖分化過程中起著重要作用。研究表明，膽汁的淤積會導致腸上皮細胞間的緊密連接蛋白ZO-1和Occludin減少，從而使腸上皮細胞間緊密連接的完整性受到破壞，上皮屏障及其防護功能受到了損傷[4]。

因此，本試驗研究了52 ku酶解肽對仔豬空腸上皮細胞活性和細胞屏障通透性的影響，同時通過對Occludin和ZO-1基因mRNA表達量的影響來探討52 ku酶解肽對腸黏膜機械屏障損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco，美國)，青霉素和鏈霉素(Sigma，美國)，0.4 μm Millicell插入式培養(yǎng)皿(Millipore，美國)，AP試劑盒(南京建成生物制品有限公司，中國)，總RNA提取試劑盒(OMEGA，美國)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒(Applied Biosystems，美國)，熒光探針：ZO-1 Assay ID：Ss 03373514；Occludin Assay ID：Ss03377507；β-actin Assay ID：Ss03376081(由美國Applied Biosystems公司設(shè)計合成)。

1.2 仔豬空腸上皮細胞培養(yǎng)

仔豬空腸上皮細胞(美國德州農(nóng)工大學)由中國農(nóng)業(yè)大學提供，DMEM/F12高糖培養(yǎng)基中添加7%胎牛血清，1%雙抗。在5% CO2飽和濕度，37 ℃條件下培養(yǎng)，待同代細胞生長良好至單層后進行試驗。

1.3 52 ku酶解肽提純方法

β-Conglycinin由本實驗室參照I.Setsuko等[5]的免疫法從大豆中分離提純，經(jīng)SDS-PAGE鑒定純度達95%以上，并從純化的β-Conglycinin中分離提純得到52 ku酶解肽，經(jīng)SDS-PAGE鑒定純度達90.03%以上，且具有免疫活性[6]，可用做本試驗刺激物。

1.4 52 ku酶解肽對仔豬空腸上皮細胞活性的影響

仔豬空腸上皮細胞的活性利用MTT比色法檢測。將細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板上，待細胞融合達95%以上時，分別用不同濃度(0、0.125、0.25、0.5、1、2 mg·mL-1)的52 ku酶解肽刺激仔豬空腸上皮細胞，經(jīng)不同時間(2、4、6、8、12、24 h)處理后，加入20 μL MTT溶液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后每孔加入150 μL DMSO，并置搖床上低速振蕩10 min以致結(jié)晶物質(zhì)充分溶解。采用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm處測定各孔的吸光值。每個處理6個重復。

1.5 TEER值的測定

將同代生長良好的仔豬空腸上皮細胞接種于插入式培養(yǎng)皿中，上層分別加入400 μL不同設(shè)定濃度(0、0.125、0.25、0.5、1、2 mg·mL-1)的52 ku酶解肽的完全DMEM/F12培養(yǎng)液，下層均加入800 μL新鮮無52 ku酶解肽添加的完全培養(yǎng)液。用跨上皮電阻儀測定培養(yǎng)2、4、6、8、12、24 h的TEER值，每個測定孔均取不同方向的3個點，并取其均值乘以插入式培養(yǎng)皿的膜面積(0.6 cm2)，為待測樣品的TEER值，以Ω×cm2表示。每個處理4個重復。

1.6 AP活性的測定

將生長狀態(tài)良好的仔豬空腸上皮細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，同上分別加入不同濃度(0、0.125、0.25、0.5、1、2 mg·mL-1)的52 ku酶解肽培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，分別收集每孔中的培養(yǎng)上清液，并對細胞培養(yǎng)液中AP活性進行測定。細胞AP活性的測定步驟參照試劑盒說明書進行。每個處理4個重復。

1.7 熒光定量PCR

1.7.1 RNA的提取 在仔豬空腸上皮細胞中加入不同濃度52 ku酶解肽處理24 h后，進行總RNA提取，每個處理設(shè)3個重復。小腸上皮細胞總RNA的提取按照OMEGA總RNA提取試劑盒說明書進行，提取后經(jīng)檢測RNA的完整性良好，可進行下步試驗。

1.7.2 目的基因cDNA的合成和實時熒光定量PCR cDNA合成采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，反應體系為20 μL：2 μL 10×RT Buffer，0.8 μL 25×dNTP Mix，2 μL 10×RT Random Primers，1 μL MultiScribeTM Reverse Transcriptase，2 μg Total RNA，Nuclease-free H2O補至20 μL。反轉(zhuǎn)錄反應條件：25 ℃ 10 min；37 ℃ 120 min；85 ℃ 5 min。反應所得到的cDNA于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實時熒光定量PCR法分別測定緊密連接蛋白Occludin與ZO-1基因 mRNA相對表達量。參照實時熒光定量試劑盒，反應體系為20 μL：10 μL TaqMan Gene Expression Master Mix(2×)，1 μL TaqMan Gene Expression Assay(20×)，7 μL Nuclease-free H2O，2 μL cDNA模板。反應程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS17.0分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析，所有數(shù)據(jù)以“mean±SD”表示，以P<0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié) 果

2.1 52 ku酶解肽對IPEC活性的影響

相同培養(yǎng)時間，隨著52 ku酶解肽濃度的增加，MTT值呈現(xiàn)下降趨勢。0.25 mg·mL-152 ku酶解肽濃度處理仔豬空腸上皮細胞8 h后，MTT值顯著降低(P<0.05)。相同濃度52 ku酶解肽處理仔豬空腸上皮細胞，隨著培養(yǎng)時間的延長，MTT值呈現(xiàn)下降趨勢。0.50 mg·mL-152 ku處理仔豬空腸上皮細胞 6 h 后，MTT值顯著降低(P<0.05)(圖1)。

每個處理各個時間測定的樣本數(shù)為6 (n=6)。a、b、c、d、e表示處理相同濃度，不同時間下52 ku酶解肽對IPEC MTT值的變化，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)；v、w、x、y、z表示處理相同時間，不同濃度下52 ku酶解肽對IPEC MTT值的變化，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)Number of samples treated by different concentrations and different times is 6 (n=6). a, b, c, d, e. P<0.05 under the same concentration and different times; v, w, x, y, z. P<0.05 under the same time and different concentrations圖1 不同濃度52 ku酶解肽處理不同時間IPEC膜MTT值的變化Fig.1 The variation of MTT in IPEC membrane treated with different concentrations of 52 ku hydrolyzed peptide for different time

2.2 52 ku酶解肽細胞TEER值的影響

每個處理各個時間測定的樣本數(shù)為4(n=4)Number of samples treated by different concentrations and different times is 4(n=4)圖2 不同濃度52 ku酶解肽處理不同時間IPEC膜TEER值的變化Fig.2 The variation of TEER in IPEC membrane treated with different concentrations of 52 ku hydrolyzed peptide for different times

細胞的TEER值呈劑量和時間依賴性的降低趨勢，如圖2所示。同一處理濃度，隨著處理時間的延長，TEER值呈現(xiàn)降低趨勢(P<0.05)，濃度為0.5 mg·mL-152 ku酶解肽處理6、8、12、24 h后，細胞TEER較對照組相比分別降低了5.31%、5.94%、7.53%和10.07%(P<0.05)。相同濃度條件下，各個處理時間的TEER值較對照組均顯著性降低(P<0.05)。隨著濃度的增加，濃度為0.5、1、2 mg·mL-152 ku酶解肽處理6 h后，各處理組之間差異顯著，且較對照組相比，TEER值分別降低了5.31%、7.52%和11.73%(P<0.05)，而0、0.125與0.25 mg·mL-1處理組之間以及0.25與0.5 mg·mL-1處理組間差異不顯著(P>0.05)。24 h時，0.25、0.5、1、2 mg·mL-1與對照組差異顯著(P<0.05)。所以也將24 h作為檢測仔豬空腸上皮細胞AP活性與緊密連接蛋白基因表達的刺激時間。2.3 52 ku酶解肽對IPEC AP分化的影響

細胞AP活性隨著52 ku酶解肽濃度的增加呈現(xiàn)顯著性增長趨勢，如圖3所示。隨著濃度的增加，52 ku酶解肽24 h處理仔豬空腸上皮細胞培養(yǎng)液AP值呈現(xiàn)明顯上升趨勢(P<0.05)。用0.125、0.25 mg·mL-1的52 ku處理24 h后AP活性較對照組相比差異顯著(P<0.05)，但0.5、1.0 mg·mL-1處理組之間以及1.0與2 mg·mL-1處理組之間差異不顯著(P>0.05)。

圖柱上的不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，圖4同The different small letters on columns indicate the significant difference(P<0.05)，the same as Figure4圖3 不同濃度52 ku酶解肽處理24 h IPEC培養(yǎng)液中AP的變化(n=4)Fig.3 The variation of AP in IPEC culture medium treated with different concentrations of 52 ku hydrolyzed peptide for 24 h(n=4)

2.4 52 ku酶解肽對仔豬空腸上皮細胞Occludin和ZO-1 mRNA相對表達量的影響

不同濃度52 ku酶解肽處理24 h后，仔豬空腸上皮細胞緊密連接蛋白Occludin和ZO-1 mRNA相對表達量結(jié)果如圖4顯示，隨52 ku酶解肽添加濃度的增大，Occludin和ZO-1 mRNA相對表達量成下降趨勢。1 mg·mL-1OccludinmRNA相對表達量與對照組差異不顯著(P>0.05)，其他濃度與對照組均達到極顯著水平(P<0.05)。隨52 ku酶解肽添加濃度的增大，ZO-1 mRNA表達量均與對照組相比，差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

健康狀態(tài)下的腸上皮細胞旁間隙是封閉的，緊密連接對相鄰細胞的相互連接起著重要作用。大豆是飼糧中主要的植物蛋白源，但即使經(jīng)過相應酶類的酶解，仍會有一些具有免疫活性的酶解肽段會進入腸道，影響動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收。因此推測，52 ku酶解肽是通過影響緊密連接蛋白的表達，從而使緊密連接的完整性遭到破壞，進而增加了腸黏膜屏障的通透性。為了驗證這一假設(shè)，本研究檢測了52 ku酶解肽對仔豬空腸上皮細胞通透性和緊密連接蛋白中最重要的跨膜蛋白ZO-1和Occludin基因mRNA表達的影響。首先通過不同時間、不同濃度52 ku酶解肽刺激細胞，通過檢測MTT、TEER、AP來驗證其細胞膜完整性。結(jié)果表明，52 ku酶解肽對仔豬小腸上皮細胞活性有一定程度的影響，并隨52 ku濃度升高細胞存活率下降。隨著52 ku酶解肽濃度的提高，培養(yǎng)液中MTT值也逐漸降低。結(jié)果說明，52 ku酶解肽不同程度上抑制了仔豬空腸上皮細胞增殖。徐君研究報道證明，用大豆抗原蛋白提取物處理小鼠IEC，隨著提取物濃度的提高，不同程度的抑制了小鼠IEC的增殖[7]。這說明一定濃度的52 ku酶解肽導致動物腸上皮細胞減少，本試驗結(jié)果與其一致。本試驗對刺激24 h的培養(yǎng)液進行AP活力測定，結(jié)果表明，隨著52 ku酶解肽濃度的提高，培養(yǎng)液中AP值也逐漸升高。研究者也通常用AP活力來反映鼠、鯉魚等動物的腸上皮細胞完整性[7-8]，AP值隨52 ku酶解肽濃度的增加也逐漸升高，其結(jié)果與本試驗研究結(jié)果一致。

圖4 不同濃度52 ku酶解肽處理24 h對IPEC Occludin和ZO-1 mRNA相對表達量的變化(n=3)Fig.4 The variation of Occludin or ZO-1 mRNA relative expression in IPEC culture medium treated with different concentrations of 52 ku hydrolyzed peptide for 24 h(n=3)

TEER能夠反映細胞的完整性和通透性。本試驗發(fā)現(xiàn)，0.50 mg·mL-152 ku酶解肽處理仔豬空腸上皮細胞培養(yǎng)液TEER值明顯低于對照組(P<0.05)。同時，隨著52 ku酶解肽濃度的提高，培養(yǎng)液中TEER值也逐漸降低。試驗表明，52 ku酶解肽損傷了仔豬空腸上皮細胞的屏障功能，導致其通透性增加；隨著培養(yǎng)時間的延長細胞屏障功能逐漸降低。TEER值的降低與細胞膜通透性的升高揭示緊密連接蛋白復合物的改變。有研究證明，隨著大豆球蛋白濃度的增加TEER值下降，這會造成仔豬空腸上皮細胞通透性增加，使抗原更容易進入血液中導致仔豬過敏[9]。

目前有研究表明，斷奶仔豬容易產(chǎn)生腸易激綜合癥，導致腸上皮緊密連接蛋白破壞及表達量降低[10]，腸道通透性增強，仔豬腹瀉。本試驗發(fā)現(xiàn)，除52 ku酶解肽濃度為1 mg·mL-1時緊密連接蛋白OccludinmRNA相對表達量無明顯變化，其他各濃度腸上皮細胞緊密連接蛋白Occludin或ZO-1 mRNA相對表達量也顯現(xiàn)下降趨勢，且差異顯著，ZO-1或OccludinmRNA相對表達量下降引發(fā)腸黏膜屏障破壞，與R.Yang等[11]的結(jié)果一致。也有學者用β-Conglycinin刺激細胞，結(jié)果導致ZO-1和Occludin表達量下降，破壞了腸道屏障[12]。這些都證明，蛋白表達量下降反映了食物致敏原對仔豬腸道屏障造成了一定程度的損傷。

4 結(jié) 論

52 ku β-Conglycinin酶解肽能破壞仔豬空腸上皮細胞緊密連接的完整性，加大腸道通透性，破壞屏障功能，降低腸上皮緊密連接蛋白Occludin或ZO-1 基因mRNA的表達。

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(編輯 郭云雁)

Effects of β-conglycinin Hydrolyzed Peptide on the Permeability and Expression of Tight Junction Protein in Piglet Intestinal Epithelial Cells

LIU Dan-dan，ZHAO Yuan*，HAN Rui，ZHANG Shi-yao

(KeyLaboratoryofAnimalProduction，ProductQualityandSecurityofMinistryofEducation，KeyLaboratoryofAnimalNutritionandFeedsScienceinJilinProvince，CollegeofAnimalScienceandTechnology，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China)

The objective of this study was to evaluate the effects of β-Conglycinin hydrolyzed peptide(52 ku) on the permeability and expression of tight junction proteinOccludinandZO-1 in piglet intestinal epithelial cells(IPEC)，which would provide a basis for exploring the mechanisms of intestinal damage.IPEC were treated with different concentrations(0，0.125，0.25，0.5，1 and 2 mg·mL-1) hydrolyzed peptide for 2，4，6，8，12，24 h.The effects of hydrolyzed peptide(52 ku) on cell membrane permeability were determined by measuring the cell viability(MTT values)，transepithelial resistance values(TEER) and alkaline phosphatase(AP) activity in cell culture medium.The mRNA expression ofOccludinandZO-1 were detected by real-time PCR after IPEC treated with 0.5 mg·mL-1hydrolyzed peptide for 24 h.The results showed that MTT and TEER of intestinal epithelial cells treated with hydrolyzed peptide(52 ku) with 0.5 mg·mL-1were decreased by a time-dose dependent manner(P<0.05).With the increase concentration of hydrolyzed peptide(52 ku)，AP activity in 24 h treatment group had a significant increased trend(P<0.05) by dose dependent manner.Also，hydrolyzed peptide(52 ku) could decrease the relative expression ofOccludinandZO-1 mRNA in IPEC(P<0.05).In conclusion，hydrolyzed peptide(52 ku) destructed the permeability and reducedOccludinorZO-1 mRNA expression of tight junction protein in IPEC.

soybean allergic β-Conglycinin；52 ku hydrolyzed peptide；piglets；IPEC；tight junctions

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.012

2014-07-08

國家自然科學基金青年資金項目(31101719)；省科技發(fā)展計劃項目青年科研基金(201201098)；吉林省教育廳“十二五”科學技術(shù)研究規(guī)劃項目

劉丹丹(1988-)，女，吉林松原人，碩士生，主要從事飼料抗營養(yǎng)因子研究，E-mail：ddliu19880922@163.com

*通信作者：趙 元，博士，副教授，E-mail：zhaoyuan4CL52@126.com

S828；S815.4

A

0366-6964(2015)05-0768-06