劉 彧，石占全，姬凱元，楊姍姍，范瑞文

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801)

TGF-β3對體外培養(yǎng)的羊駝黑色素細(xì)胞的影響

劉 彧，石占全，姬凱元，楊姍姍，范瑞文*

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801)

為了研究轉(zhuǎn)化生長因子β3(Transforming growth factor beta3，TGF-β3)對體外培養(yǎng)的羊駝皮膚黑色素細(xì)胞表型的影響。本研究在體外培養(yǎng)的羊駝皮膚黑色素細(xì)胞中添加不同濃度TGF-β3(6.25、12.5、25、50 ng·mL-1)，通過實時監(jiān)測和檢測細(xì)胞增殖、毛色相關(guān)基因小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Microphthalmia—associtated transcription factor，MITF)、酪氨酸酶(Tyrosinase，TYR)和酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(Tyrosinase related protein 2，TYRP2)表達(dá)以及黑色素產(chǎn)量的變化。結(jié)果表明：(1)在羊駝皮膚黑色素細(xì)胞中添加50 ng·mL-1濃度的TGF-β3后，在前30 h內(nèi)對細(xì)胞增殖有抑制效果，30 h后對細(xì)胞增殖有明顯的長時程維持細(xì)胞數(shù)量作用，但對TGF-β3添加的劑量沒有依賴性；(2)添加TGF-β3后，黑色素細(xì)胞內(nèi)MITF、TYR和TYRP2的表達(dá)量均被下調(diào)，而且黑色素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素的量也被下調(diào)，主要以添加50 ng·mL-1時下調(diào)最為顯著。結(jié)果揭示，TGF-β3通過對羊駝黑色素細(xì)胞內(nèi)MITF、TYR和TYRP2的表達(dá)的影響，并調(diào)控黑色素的產(chǎn)生，對黑色素細(xì)胞的生物學(xué)功能具有重要的影響。

轉(zhuǎn)化生長因子β3； 黑色素；黑色素細(xì)胞； 羊駝

轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor beta，TGF-β)有3個不同的家族成員，分別為TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3[1-3]。TGFβ是一種多功能細(xì)胞因子，對細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長停滯以及其他生理和病理反應(yīng)起著重要的誘導(dǎo)作用[4-8]。TGFβ及其受體還是黑色素細(xì)胞成熟分化時有效的抑制因子，主要通過有效的抑制MITF的表達(dá)，從而抑制黑色素細(xì)胞的成熟[9]。

黑色素細(xì)胞形狀不規(guī)則大多數(shù)呈梭形或多邊形，細(xì)胞核呈卵圓形，黑色素細(xì)胞內(nèi)散在分布電子密度高，質(zhì)地均勻，大小不等，形態(tài)規(guī)則，一般呈圓形或卵圓形的合成黑色素的細(xì)胞器-黑素體。黑色素細(xì)胞中散在分布黑素體，當(dāng)黑素體成熟時，內(nèi)含電子密度高的黑色素可從胞質(zhì)內(nèi)釋放進(jìn)入黑色素細(xì)胞外的結(jié)締組織中，在其周圍的膠原纖維束中含有大小不等，體積一般較黑素體小，沒有規(guī)則形狀的電子致密的黑色素顆粒，黑色素細(xì)胞內(nèi)的黑素體與釋放出的黑色素顆粒大小和形狀完全不同[10]。

黑色素細(xì)胞分泌大量的TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，并且所有的亞型都在高發(fā)性黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)[11-13]。盡管已有研究報道TGF-β在黑色素細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞發(fā)育和成熟過程中至關(guān)重要，但在黑色素細(xì)胞內(nèi)TGF-β3作為外源的影響因子，調(diào)控其產(chǎn)生黑色素的機制還知之甚少，本課題組對TGF-β1在羊駝皮膚和黑色素細(xì)胞中的作用做了系列研究，為了揭示TGF-β3與羊駝皮膚黑色素合成中一些基因和蛋白的關(guān)系，擬將TGF-β3作用于體外培養(yǎng)的羊駝皮膚黑色素細(xì)胞，分析黑色素細(xì)胞的形態(tài)、毛色基因(MITF、TYR和TYRP2)表達(dá)以及色素產(chǎn)量的變化，旨在為研究TGF-β3對羊駝皮膚毛色黑色素生成的調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 正常羊駝皮膚黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)

無菌切取1～3歲羊駝的背部皮膚組織，用含雙抗預(yù)冷的PBS溶液反復(fù)沖洗，去除皮下的結(jié)締組織，切成寬約0.2 mm的小條，0.25% DispaseⅡ酶4 ℃過夜，即冷消化16～18 h，真皮與表皮分離，用1.5 g·L-1胰酶消化液將表皮于37 ℃消化5～8 min，吸管反復(fù)吹打，200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，4 ℃ 1 000 r·min-1離心，用黑色素細(xì)胞培養(yǎng)液(MGM)重懸細(xì)胞，計數(shù)后以5×105個·mL-1的密度接種于6孔培養(yǎng)板中。MGM的組成：DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、慶大霉素200 U·L-1、CT 0.25 mg·L-1、胰島素150 U·L-1、氫化可的松3 mg·L-1、bFGF 1 ng·mL-1。將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，其密度為2×104～4×104個·mL-1，于37 ℃培養(yǎng)箱中5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，換液去除組織碎片與未貼壁的細(xì)胞，此后每3 d更換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)8～10 d，經(jīng)傳代所得到的羊駝皮膚黑色素細(xì)胞純度為99%以上。本研究所用的羊駝皮膚黑色素細(xì)胞為第4代。黑色素細(xì)胞形狀不規(guī)則，大多數(shù)呈梭形或多邊形，細(xì)胞核呈卵圓形，黑色素細(xì)胞內(nèi)散在分布黑素體。

1.2 方法1.2.1 細(xì)胞內(nèi)添加TGF-β3 TGF-β3用去離子水溶解，制成儲備液。制備不同濃度的TGF-β3(6.25、 12.5、25、50 ng·mL-1)用于添加到黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基中，對照組添加去離子水，每組9個重復(fù)孔。1.2.2 TGF-β3對羊駝皮膚黑色素細(xì)胞活力的影響 對添加不同濃度TGF-β3的5組羊駝黑色素細(xì)胞計數(shù)，稀釋到相同的細(xì)胞濃度，用RTCA實時無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀做細(xì)胞增殖試驗：E-plate每孔中加入50 μL的培養(yǎng)基，置于儀器檢測臺上測試基線；將計數(shù)稀釋的羊駝黑色素細(xì)胞加入E-plate孔中，每孔5 000個細(xì)胞；室溫放置30 min后將實驗板放入儀器開始試驗，每5 min檢測1次細(xì)胞指數(shù)，記錄細(xì)胞貼壁，生長過程至40 h。

1.2.3 細(xì)胞總RNA和蛋白質(zhì)的提取 添加試驗結(jié)束時，收集9孔細(xì)胞，3孔用于提取RNA，3孔用于提取總蛋白，3孔用于提取黑色素，并用NanoDrop 1000和BSA法分別檢測RNA和蛋白質(zhì)的質(zhì)量和濃度。

1.2.4 RNA反轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR 10 μL反應(yīng)體系：5×Prime ScriptTMBuffer 2 μL，Prime ScriptTMRT Enzyme Mix 10.5 μL，Oligo dT Primer 25 pmol，隨機引物50 pmol，Total RNA 1 μL，DEPC水加至10 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，反轉(zhuǎn)錄后cDNA可用于實時定量PCR。

qRT-PCR每個樣本做4個重復(fù)，并且設(shè)立每個樣本的陰性對照(以水代替模板)，10 μL反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTMII(2×) 5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1) 各0.2 μL(引物序列見表1)，ROX Reference Dye II 0.2 μL，Template DNA 1 μL，Rnase-free water 3.4 μL。擴增條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，40循環(huán)。內(nèi)參基因為β-actin?；虻南鄬Ρ磉_(dá)量用2-ΔΔCt法計算。

1.2.5 總蛋白的提取與Western blotting檢測 用總蛋白提取試劑盒(碧云天)提取細(xì)胞總蛋白。用核酸蛋白儀測定蛋白濃度，每孔上樣200 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉液，室溫封閉1.5 h。將轉(zhuǎn)印膜放入平皿內(nèi)，加入兔源目的基因多克隆抗體(封閉液1∶300稀釋)。4 ℃搖床過夜孵育，TBST洗膜，加入二抗(HRP山羊抗兔IgG)，37 ℃孵育1.5 h，加入ECL發(fā)光劑，2～3 min后甩去工作液，照相觀察。免疫印跡信號用Image-proplus 6.0軟件進(jìn)行相對定量分析。

表1MITF、TYR、TYRP2、β-actin的引物序列

Table 1 The primer sequences ofMITF，TYR，TYRP2，β-actin

目的基因Gene引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃TmMITFF:TCCCAAGTCAAATGATCCAGR:GAGCCTGCATTTCAAGTTCC52TYRF:GCTTTAGCAACTTCATGGGAR:CTTGTTCTTCTCTGGGACAC56TYRP2F:TGCTTTGCCCTACTGGAACR:ATCAGAGTCGATCGTCTG63β-actinF:CTAAGGAGAAGGGCCAGTCCR:CTCAAGTTGGGGGACAAAAA52～56

1.2.6 黑色素含量的測定 在羊駝黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加不同濃度的TGF-β3，56 h后移去培養(yǎng)基，用1 mL預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞3次，用0.25%胰蛋白酶消化8 min，加入終止液終止消化，吹打使其變?yōu)閱渭?xì)胞懸液后將細(xì)胞移入離心管中，取出一小部分進(jìn)行臺盼藍(lán)染色計數(shù)。然后4 ℃，1 000 r·min-1，離心10 min，棄去終止液再次用PBS沖洗細(xì)胞，共沖洗3次。棄去PBS，每管加入0.5 mL 0.2 mol·L-1的NaOH溶解黑色素細(xì)胞。將細(xì)胞溶解液移到另一個干凈的1.5 mL的EP管中，80 ℃加熱5 min。取烏賊墨標(biāo)準(zhǔn)品溶解在0.2 mol·L-1的NaOH中，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的設(shè)置。使用酶標(biāo)儀在475 nm波長處對黑色素標(biāo)準(zhǔn)品級所有樣品進(jìn)行吸光值的測量，每組重復(fù)3次，將同一條件下測得的樣品吸光值與黑色素標(biāo)準(zhǔn)品吸光值進(jìn)行比較即為各樣品中的黑色素含量，最終獲得黑色素含量用μg·10-6細(xì)胞表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)”表示，采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 TGF-β3對羊駝皮膚黑色素細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

在體外培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞中添加不同濃度的TGF-β3 56 h后，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組中黑色素細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)正常培養(yǎng)黑色素細(xì)胞的梭形或多邊形，而試驗組黑色素細(xì)胞隨著TGF-β3濃度增大，含兩極突起的細(xì)胞明顯增多，呈現(xiàn)橢圓形(圖1)。

2．2 TGF-β3對羊駝皮膚黑色素細(xì)胞增殖的影響

各組細(xì)胞在4 h內(nèi)均貼壁，10 h后各組的細(xì)胞增殖有了明顯變化。與正常細(xì)胞相比，添加最高濃度TGF-β3(50 ng·mL-1)的黑色素細(xì)胞增殖在前30 h被抑制，而添加較低濃度的黑色素細(xì)胞增殖沒有變化；30 h后，添加不同濃度的TGF-β3均對黑色素細(xì)胞有長時程維持細(xì)胞數(shù)量的作用，但沒有劑量依賴性(圖2)。

2.3 TGF-β3對羊駝皮膚黑色素細(xì)胞MITF、TYR、TYRP2基因表達(dá)變化量的影響

實時定量PCR結(jié)果表明，添加了TGF-β3的羊駝黑色素細(xì)胞中，MITF基因各試驗組較對照組在轉(zhuǎn)錄水平分別下降到0.52、0.53、0.54和0.32倍，試驗組與對照組均差異極顯著(P<0.01)。在試驗組中，TYR的轉(zhuǎn)錄水平分別較對照組下降到0.49、0.71、0.56、0.58倍，并呈顯著或極顯著差異；TYRP2各試驗組的轉(zhuǎn)錄水平分別較對照組下降到0.41、0.40、0.46、0.51倍，并呈極顯著差異(P<0.01)(圖3)。2.4 TGF-β3對羊駝皮膚黑色素細(xì)胞MITF、TYR、TYRP2蛋白表達(dá)變化量的影響

Western blotting結(jié)果顯示，羊駝黑色素細(xì)胞總蛋白中存在能與兔抗TYR、TYRP2、MITF多克隆抗體發(fā)生免疫陽性反應(yīng)的蛋白條帶(圖4A)。對不同試驗組羊駝黑色素細(xì)胞目的蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，添加TGF-β3的羊駝黑色素細(xì)胞中MITF、TYR和TYRP2均下調(diào)，且添加50 ng·mL-1TGF-β3下降的最為顯著。4個試驗組與對照組相比差異顯著或極顯著(圖4B)。

2.5 TGF-β3對羊駝皮膚黑色素細(xì)胞黑色素產(chǎn)量的影響

用分光光度法對添加不同濃度TGF-β3的黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素產(chǎn)量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，添加不同濃度的TGF-β3后，試驗組黑色素細(xì)胞中黑色素產(chǎn)量比對照組均有不同程度的減少，且添加50 ng·mL-1TGF-β3下降的最為顯著(圖5)。

A．正常的羊駝黑色素細(xì)胞；B．添加6.25 ng·mL-1 TGF-β3的羊駝黑色素細(xì)胞；C．添加12.5 ng·mL-1 TGF-β3的羊駝黑色素細(xì)胞；D．添加25 ng·mL-1 TGF-β3的羊駝黑色素細(xì)胞；E.添加50 ng·mL-1 TGF-β3的羊駝黑色素細(xì)胞A．Normal alpaca skin melanocytes；B．Melanocyte with the addition of 6.25 ng·mL-1 TGF-β3；C．Melanocyte with the addition of 12.5 ng·mL-1 TGF-β3；D．Melanocyte with the addition of 25 ng·mL-1 TGF-β3；E．Melanocyte with the addition of 50 ng·mL-1 TGF-β3圖1 TGF-β3處理56 h羊駝皮膚黑色素細(xì)胞的形態(tài)Fig.1 The effect of TGF-β3 with different concentrations on the morphology of alpaca melanocytes for 56 h

圖2 TGF-β3添加對羊駝皮膚黑色素細(xì)胞增殖的影響Fig.2 The effect of TGF-β3 with different concentrations on the proliferation of alpaca melanocytes

3 討 論

哺乳動物被毛的顏色主要由沉著在皮膚的黑色素的含量及其種類決定的，黑色素主要分為兩類：真黑色素(Eumelanin)和褐黑色素(Pheomelanin)[14]。黑色素產(chǎn)生后，被運輸?shù)街車琴|(zhì)化細(xì)胞中，產(chǎn)生皮膚和被毛顏色。

不同小寫字母表示差異顯著；不同大寫字母表示差異極顯著。圖4、圖5同Different lowercase letters .P<0.05；Different uppercase letters.P<0.01.The same as Figure 4 and Figure 5圖3 添加不同濃度TGF-β3對毛色相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Fig.3 The effect of TGF-β3 with different concentrations on mRNA expression of hair color genes in alpaca melanocytes

A.Western blotting 結(jié)果；B.相對表達(dá)量分析A.Western blotting；B.Quantitative amount of protein expression圖4 添加不同濃度TGF-β3對毛色基因蛋白表達(dá)的影響Fig.4 The effect of TGF-β3 with different concentrations on protein expression in alpaca melanocytes

圖5 添加不同濃度TGF-β3對黑色素細(xì)胞內(nèi)色素產(chǎn)量的影響Fig.5 The effect of TGF-β3 with different concentrations on melanin production in alpaca melanocytes

目前發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物黑色素細(xì)胞中，合成黑色素有兩條信號路徑，即受體酪氨酸激酶(KIT)和G蛋白偶聯(lián)內(nèi)皮素受體B(EDNRB)途徑，其中任意一條路徑上功能的丟失或突變都會導(dǎo)致胚胎中黑色素細(xì)胞前體的數(shù)量減少，最終導(dǎo)致毛色的改變[15]。在EDNRB路徑中，促黑色素激素(α-MSH)與黑色素細(xì)胞膜上的黑皮激素受體(MC1R)結(jié)合后可激活Gs蛋白，Gs蛋白激活膜內(nèi)側(cè)的腺苷酸環(huán)化酶(AC)，AC的活化使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，后者能活化蛋白激酶A(PKA)導(dǎo)致CREB(cAMP-responsive element-binding)的磷酸化[16]。磷酸化的CREB可激活小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)，MITF是毛色通路上一個重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過調(diào)控形成黑色素的重要基因的表達(dá)而影響黑色素細(xì)胞的發(fā)育，如酪氨酸酶(TYR)及其相關(guān)蛋白1和2(TYRP1和TYRP2)，而TYR是黑色素生成的關(guān)鍵酶，催化3步不同的反應(yīng)；酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(TYRP1)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(TYRP2)在黑色素合成過程中各自催化特異的反應(yīng)[16-17]。盡管有研究表明，TGF-β3是小鼠神經(jīng)源色素細(xì)胞發(fā)育所必須的，但TGF-β3是否對黑色素細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)有影響尚不清楚。本試驗通過在體外培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞中添加不同濃度的TGF-β3，檢測到黑色素細(xì)胞中MITF、TYR、TYRP2在mRNA 和蛋白水平均有不同程度的下調(diào)。MITF是TYR、TYRP2的轉(zhuǎn)錄因子，因此，TYR和TYRP2的表達(dá)水平的變化是由MITF引起的。TYRP2 在酪氨酸酶發(fā)揮作用過程中起重要的作用[18-21]，是細(xì)胞增殖率和細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的指標(biāo)[22]。在該試驗中也檢測到不同濃度的TGF-β3引起細(xì)胞表型的變化，導(dǎo)致了黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素合成量的下調(diào)，這證實了TYRP2表達(dá)水平與黑色素含量之間的關(guān)系。綜上所述，TGF-β3通過G蛋白偶聯(lián)內(nèi)皮素受體B路徑調(diào)控黑色素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素，而TGF-β3如何作用于MITF的機理有待于進(jìn)一步研究。

黑色素細(xì)胞的突起或突起延伸對黑色素運輸至周圍的角質(zhì)化細(xì)胞至關(guān)重要，影響皮膚和被毛顏色的形成。此外，還關(guān)系到黑色素細(xì)胞的其他功能，如張暉等[10]發(fā)現(xiàn)，多泡脂肪細(xì)胞靠近黑色素細(xì)胞，黑色素細(xì)胞合成的黑色素可以通過運輸釋放到多泡脂肪細(xì)胞，引起脂肪吸附。本試驗中，高濃度TGF-β3可以促進(jìn)黑色素細(xì)胞突起形成，引起黑色素細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，因此，TGF-β3在黑色素轉(zhuǎn)運至角質(zhì)化細(xì)胞和多泡脂肪細(xì)胞過程中起重要作用，從而將對哺乳動物毛色形成和脂肪吸附有重要意義。

4 結(jié) 論

在黑色素細(xì)胞G蛋白偶聯(lián)內(nèi)皮素受體B路徑中，TGF-β3通過調(diào)控MITF、TYR和TYRP2的表達(dá)，從而引起黑色素含量的變化；適當(dāng)濃度的外源性TGF-β3可促進(jìn)黑色素突起形成，以確保黑色素的運輸。

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(編輯 郭云雁)

The Effect of TGF-β3 on the Melanocyte Culturedinvitroof Alpaca

LIU Yu，SHI Zhan-quan，JI Kai-yuan，YANG Shan-shan，F(xiàn)AN Rui-wen*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)

The aim of this study was to investigate the effect of TGF-β3 on the phenotype of alpaca melanocyte culturedinvitro.The melanocyte proliferation，gene expression of MITF，TYR and TYRP2 at the transcript and translation level were detected and melanin production was analyzed after the addition of TGF-β3 with different concentrations of 6.25，12.5，25，50 ng·mL-1in melanocyte medium.The results showed that：Compared to the normal melanocyte，the proliferation of melanocytes was inhibited within 30 h by the addition of 50 ng·mL-1TFG-β3 and then the amount of cells could be maintained without dependence on the concentration of TGF-β3 after 30 h；MITF，TYRandTYRP2 expression were down-regulated and melanin production also reduced after the addition of TGF-β3.The dose of 50 ng·mL-1TGF-β3 caused more significant effects.The results suggested that TGF-β3 had the important effects on the biology of alpaca melanocyte by regulating the expression ofMITF，TYR，TYRP2 and melanin production.

TGF-β3；melanin；melanocyte；alpaca

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.009

2014-06-25

國家自然科學(xué)基金(31201868)；山西省科技攻關(guān)項目(20120311024-2)

劉 彧(1989-)，女，山東安丘人，碩士生，主要從事羊駝毛色研究，Tel：0354-6288980，E-mail：18404966089@163.com

*通信作者：范瑞文，教授，主要從事動物解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)教學(xué)與科研工作，E-mail：ruiwenfan@163.com

S852.2

A

0366-6964(2015)05-0746-06