林寶山，蘭道亮，陳亞冰，黃 偲，符 梅，李 解，李 鍵

(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/西南民族大學(xué) 青藏高原研究院，成都 610041)

麥洼牦牛TLR1～10基因克隆及分子生物學(xué)特征分析

林寶山，蘭道亮*，陳亞冰，黃 偲，符 梅，李 解，李 鍵*

(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/西南民族大學(xué) 青藏高原研究院，成都 610041)

本研究克隆了麥洼牦牛天然免疫受體1～10基因的編碼區(qū)，利用生物信息學(xué)工具分析基因特點(diǎn)，熒光定量PCR測定TLRs基因在不同組織中的表達(dá)量。序列比較分析結(jié)果表明，麥洼牦牛TLR基因與其他物種在核苷酸水平及氨基酸水平上均表現(xiàn)出很高的保守性。遺傳進(jìn)化方面，麥洼牦牛TLRs與牛和綿羊TLRs遺傳進(jìn)化距離最近，并與人、馬、鼠TLRs等形成哺乳動(dòng)物的一個(gè)分支，與雞則形成遺傳距離較遠(yuǎn)的一個(gè)分支。同時(shí)我們在進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，TLR1、TLR6先聚為一小支，再與TLR10又聚為更緊密的一支，然后TLR1、2、6、10和TLR7、8、9分別聚集在兩個(gè)單個(gè)的分支上，TLR其他成員各自成為一支。熒光定量結(jié)果表明，TLRs在麥洼牦牛各組織均有表達(dá)，但不同成員在不同組織的表達(dá)存在較大的差異。其中TLR2、TLR4和TLR6在脾表達(dá)量最高，在卵巢、小腸、腎、肝中有高表達(dá)，TLR1、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10在腎表達(dá)量最高，在肝、腎、脾等組織中高表達(dá)。綜上所述，本研究的開展能為以后揭示TLRs在牦牛等高原模式動(dòng)物分子免疫機(jī)制以及牦?？共∮N奠定基礎(chǔ)。

麥洼牦牛；TLR1-10；克??；熒光定量PCR；組織表達(dá)分布

TLR如同天然免疫的眼睛，監(jiān)視與識(shí)別各種不同疾病的相關(guān)分子模式 “PAMP”，引發(fā)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而導(dǎo)致炎性介質(zhì)的釋放，并最終激活獲得性免疫系統(tǒng)，是機(jī)體抵抗感染性疾病的第一道屏障[1]。近期研究發(fā)現(xiàn)，TLRs參與并調(diào)控獲得性免疫應(yīng)答[2]。迄今，TLR家族在哺乳動(dòng)物中至少有13個(gè)成員，其中，人類TLR1～10，小鼠TLR1～9、11～13，牛和羊TLR1～10，豬TLR1～10等。TLRs成員各自能夠特異性地識(shí)別不同的PAMPs/DAMPs(病原體相關(guān)分子模式/損傷關(guān)聯(lián)分子模式)，并調(diào)節(jié)先天性與獲得性免疫以限制病原微生物的入侵，同時(shí)清除宿主產(chǎn)生的機(jī)體殘留物質(zhì)。例如TLR2與TLR1或TLR6協(xié)同識(shí)別革蘭陽性菌的肽聚糖、磷壁酸、脂蛋白等；TLR3識(shí)別病毒的雙鏈RNA(dsRNA)；TLR4識(shí)別革蘭陰性菌的脂多糖、類脂A、熱休克蛋白60/70等；TLR5識(shí)別細(xì)菌的鞭毛蛋白；TLR7和TLR8識(shí)別病毒單鏈RNA(ssRNA)；TLR9識(shí)別細(xì)菌、病毒、真菌及一些原生動(dòng)物非甲基化的CpG DNA等[1-3]。

青藏高原是中國最大、世界海拔最高的高原，平均海拔4 000～5 000 m，有“世界屋脊”和“第三極”之稱。牦牛是生長在這里的一種特有古老物種，是世居青藏高原藏族人重要的生活和生產(chǎn)資源，也是當(dāng)?shù)匦竽两?jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱。與平原動(dòng)物相比，牦牛作為高原模式動(dòng)物能夠在青藏高原極度高寒、低氧等惡劣氣候環(huán)境下生存，其抗病及免疫分子機(jī)制可能存在特殊性。同時(shí)近年來，牦牛疾病尤其是傳染性疾病如犢牛腹瀉病、乳房炎、寄生蟲性疾病等疾病嚴(yán)重威脅著牦牛群體的健康，影響了牦牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此研究牦牛分子免疫機(jī)制具有重要意義。

目前，小鼠和人類的 Toll樣受體已經(jīng)研究的比較深入了，關(guān)于家畜Toll樣受體的鑒定和研究在最近幾年也取得了較大的進(jìn)展。K.MeGurie等將牛Toll樣受體1～10完成了鑒定并繪制了物理圖譜，發(fā)現(xiàn)其95%的核苷酸序列和人是一致的[4]；M.Menzies等對羊TLR1～10基因進(jìn)行了克隆與測序[5]；A.Raja等對山羊TLR1～10基因進(jìn)行了測序和分析[6]；在豬和馬上也都做了相關(guān)的研究[7-8]，但是TLRs在牦牛上的研究基本空白。鑒于此，本研究克隆了麥洼牦牛TLR1～10基因并進(jìn)行了相關(guān)的預(yù)測和分析研究，這為今后進(jìn)一步揭示牦牛等高原模式動(dòng)物免疫分子機(jī)制和高原動(dòng)物重大疫病的防控提供依據(jù)，同時(shí)也為牦?？共∮N提供重要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所有牦牛組織采自高原屠宰場(中國四川紅原縣，北緯31°51′～33°19′，東經(jīng) 101°51′～103°23′，平均海拔 3 600 m)，屬于麥洼牦牛品種。分別采集雌性麥洼牦牛7頭(年齡3～5歲，體重300～400 kg)11種組織樣本(心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、肌肉、胃、卵巢、乳腺)，均放入液氮速凍，送回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 稱取約1 g組織樣本至液氮中研磨后，按照RNAprep pure 動(dòng)物總RNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取總RNA。按照的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用20 μL體系：Oligo dT181 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，RibolockTMRnase Inhibitor(20 U·μL-1) 1 μL，10 mmol·L-1dNTP Mix 2 μL，RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcriptase(200 U·μL-1) 1 μL，模板1 μL，最后用RNase Free dH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min；70 ℃ 5 min。cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 麥洼牦牛TLR1～10克隆及熒光定量引物根據(jù)GenBank中登陸的牛TLR1～10基因序列，用Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)，內(nèi)參引物根據(jù)牛β-actin序列設(shè)計(jì)。引物詳細(xì)信息見表1、表2。以上所有引物由Invitrogen(上海)公司合成。

1.2.3 目的基因的克隆 每個(gè)TLR基因均以麥洼牦牛脾組織cDNA為模版，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50 μL。所有PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果，用Axygen的凝膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，取適量已純化PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD19-T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞并在Amp+瓊脂平板上涂菌。挑取單個(gè)菌落接種于含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中。經(jīng)PCR鑒定后，將陽性重組質(zhì)粒送往Invitrogen(上海)公司測序。

表1 基因TLR1～10 的克隆引物序列

Table 1 Primer sequences ofTLR1-10 genes

基因Gene引物名稱Nameofprimers引物序列(5'-3')Sequenceofprimers產(chǎn)物長度/bpLengthoffragmentTLR1FRTTTAATTGACAGGTCAAAAAGAGGTTAATGTATTTCTGCTGCTTTTCC2287TLR2FRATGCCACGTGCTTTGTGGGAGTCAGTGATGCCATCCAACC2620TLR3FRGAAAACGAACTGGATTTGGACTAAGGGAGACGTATTTCCATAGAAGAGA2942TLR4FRAGGATGATGGCGCGTGCTCTAATTCAGTTTGATGGGGTAAG2807TLR5FRGGATCATGGGAGACTGCCTTAGGAGATGGTGGTTACATTTTGC2582TLR6FRAGAAGCTGTCATTTTGTTTACATAACCTTTCACATCATCATTTTC2364TLR7FRAGGTGTTTCCAATGTGGACATTCTTTGAACACCTGACTGTAGGT3142TLR8FRCCCTTTTCCTGCTCATCTCTGACGTGAATCGTTGGCTGTTAGGAC3033TLR9FRAGCTCAGACAGAAGACGATCAACGGCAGAAGTTCCGGTTATAG3303TLR10FRATTGTTACGTCTGTGCATAGTGGAACCTCCAAACCCTTCATTCAG2367

表2 基因TLR1～10和β-actin的熒光定量引物序列

Table 2 Real-time PCR primer sequences ofTLR1-10 andβ-actingenes

基因Gene引物名稱Nameofprimers引物序列(5'-3')Sequenceofprimers退火溫度/℃Tm產(chǎn)物長度/bpLengthoffragmentTLR1FRATTTCTTGCCACCCTACTCTGATAAGGTCTTGAAGGCTCTCGG58241TLR2FRAGGAAGGCTCCCCGCAGGGTTCTCCGAAAGCACAAAGATGGT60225TLR3FRTTGGGCAAGAACTCACAGGCAAGAGGGCGAAAAGGCGA60188TLR4FRGAAGACGACACATTTCAGGGCGCTCCAGATTGGGCAGGTTAG57256TLR5FRCAGGACAGTCACAACCGCATCAGCATCGGAGAGACCACAGGA60229TLR6FRTGTTTTCAGATGTTTACCTCCTCGGGGGTTCCCTTGTAGCGTTC60387TLR7FRTCCCCACTGTTTTGCCATGCTGTAGAGAGTTACTGTGTAGACG58255TLR8FRTGAAGCCAGTTATCCCCGAAGCCCCGTCTGTAATAGTCATAGC60273TLR9FRTCCTGGTTCGGTTCCTTAGCGCCACCATTAGCAGCGAGAG60254TLR10FRTATCCCCCAGGAGAGCGTCTTCCAGGCAAGCACCCAA60392β-actinFRAGGTGACAGCAGTCGGTTGGACCTTAGAGAGAAGCGGGGTGG59170

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR參照β-actin對TLR基因組織表達(dá)進(jìn)行定量檢測。實(shí)時(shí)熒光定量采用20 μL反應(yīng)體系：SYBR Premix ExTaqTMII(TaKaRa公司)10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，dH2O 6.4 μL。使用Bio-Rad公司熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量分析。優(yōu)化處理后每個(gè)基因的最佳反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，X ℃(表2)退火30 s，72 ℃延伸20 s，39個(gè)循環(huán)；添加一個(gè)熔解曲線，設(shè)置以dH2O為模板的陰性對照，每個(gè)組織進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.5 分析與處理TLR克隆序列應(yīng)用Lasergene軟件包進(jìn)行分析；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域由SMART在線軟件預(yù)測分析(http：//smart.embl-heidelberg.de/)；TLRs同其他物種的多序列同源性比對利用在線軟件ClustalW2(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)；遺傳進(jìn)化關(guān)系樹的建立應(yīng)用Cltulax、MEGA5.1軟件。熒光定量結(jié)果采用相對定量的2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并用SpassV19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，最后使用Excel制圖功能繪制出麥洼牦牛TLRs各基因的組織相對表達(dá)柱狀圖。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的擴(kuò)增

麥洼牦牛TLR1～10 基因的克隆擴(kuò)增結(jié)果如圖1。由圖可知，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期擴(kuò)增片段大小基本相符。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～10.基因TLR1～10擴(kuò)增的片段M.DNA marker 1kb；1-10.PCR products of TLR1-10 genes圖1 基因TLR1～10的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR products of TLR1-10 genes

2.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

采用SMART在線軟件分析TLR1～10分子的結(jié)構(gòu)特征(圖2)，結(jié)果顯示，TLR1～10分子結(jié)構(gòu)包含N末端信號肽結(jié)構(gòu)、胞外區(qū)的LRRs結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)以及保內(nèi)去TIR結(jié)構(gòu)域，是典型的TLRs結(jié)構(gòu)特征。但是TLR家族成員所含LRR及TIR結(jié)構(gòu)域數(shù)量有很大的差異，其中，TLR3、TLR7、TLR8、TLR9含有數(shù)量較多的LRR區(qū)域，TLR1包含的LRR區(qū)域?yàn)樽钌?。通過與牛、羊、人、雞等不同物種TLRs蛋白功能結(jié)構(gòu)與排布方式比較，發(fā)現(xiàn)麥洼牦牛TLR蛋白結(jié)構(gòu)域與牛、羊數(shù)量與分布位置較為一致，與其他物種間TLRs蛋白大小相近，但蛋白功能結(jié)構(gòu)域排布方式存在細(xì)微差別。

2.3 同源性分析

TLRs同其他物種的多序列同源性比對利用在線軟件ClustalW2(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)(表3)實(shí)施。結(jié)果顯示，麥洼牦牛TLR基因與其他物種均表現(xiàn)出很高的保守性。在核苷酸水平上，麥洼牦牛與牛和綿羊的同源性均大于96%，與人和鼠的同源性在75%～87%。在氨基酸水平上，麥洼牦牛與牛及綿羊的同源性為90%～99%，與人和鼠的同源性為64%～86%。在所有TLR家族成員中TLR7基因最為保守(氨基酸同源性達(dá)到80%～99.71%)；而TLR2、TLR4相對較低，分別為66.58%～94.11%、64.07%～92.17%。

2.4 遺傳進(jìn)化樹

麥洼牦牛TLR基因遺傳進(jìn)化樹的建立利用了MEGA 5.0軟件的Neighbor-Joining法，重復(fù)1 000次，將克隆所得麥洼牦牛TLR1～10分別與GenBank中登錄的牛、羊、人、鼠、馬、原雞TLR1～10序列比對構(gòu)建Bootstrap驗(yàn)證的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果顯示，麥洼牦牛與牛和綿羊遺傳進(jìn)化距離最近，并與人、馬、鼠等形成哺乳動(dòng)物的一個(gè)分支。原雞則形成與麥洼牦牛遺傳距離較遠(yuǎn)的一個(gè)分支。值得一提的是，TLR1、TLR6先聚為一小支，再與TLR10又聚為更緊密的一支，然后TLR1、2、6、10和TLR7、8、9分別聚集在兩個(gè)單個(gè)的分支上，TLR其他成員各自成為一支。

圖2 TLR1～10基因蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果Fig.2 Protein domains prediction of TLR1-10 genes

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

標(biāo)準(zhǔn)曲線以連續(xù)10倍倍比稀釋(1×102～1×108copies·μL-1)的陽性質(zhì)粒為模板，經(jīng)定量PCR擴(kuò)增后，計(jì)算Ct值得出最佳檢測區(qū)域，并制作各基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4可見，TLR1～10和β-actin基因的相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.990，說明Ct值與cDNA濃度間具有良好的線性關(guān)系；TLR1～10基因和β-actin基因擴(kuò)增效率(E)在1.0左右，說明擴(kuò)增效率基本相同，以上分析說明建立的熒光定量檢測方法快速、敏感性高、特意性強(qiáng)等，可用于2-△△ct相對定量的PCR分析。

2.6 熒光定量PCR檢測麥洼牦牛TLR1～10基因在各組織的表達(dá)分布

采用β-actin為參照基因，SYBR Green I為熒光染料，通過熒光定量PCR方法檢測TLR1～10基因在麥洼牦牛各組織的表達(dá)分布。數(shù)據(jù)經(jīng)分析處理后，繪制的麥洼牦牛TLR1～10基因在各組織相對表達(dá)柱狀圖(圖5)。結(jié)果顯示，麥洼牦牛TLRs在各主要器官組織均有表達(dá)，但不同成員在不同組織的表達(dá)存在較大的差異。其中TLR1、TLR2、TLR4和TLR6在脾表達(dá)量最高在卵巢、小腸、腎、肝中有較高表達(dá)，TLR5、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10在腎表達(dá)量最高，在肝、脾、肺等組織中高表達(dá)。與其他組織相比較麥洼牦牛TLR1～10基因除TLR10外，其他成員均在心組織相對表達(dá)量最低。同時(shí)，通過比較發(fā)現(xiàn)麥洼牦牛TLR1、TLR6基因在各組織的表達(dá)比較相似，TLR2與TLR4、TLR7與TLR8、TLR9表達(dá)比較相似。

3 討 論

Toll樣受體作為連接動(dòng)物機(jī)體天然免疫和獲得性免疫的橋梁，通過識(shí)別病原體組織和細(xì)胞特異性表達(dá)模式進(jìn)而使機(jī)體對各種致病挑戰(zhàn)作出反應(yīng)，抵御疾病。牦牛作為藏族人重要的生產(chǎn)生活資源，也是當(dāng)?shù)氐男竽两?jīng)濟(jì)發(fā)展不可或缺的重要畜種。其作為高原模式動(dòng)物對青藏高原惡劣極端氣候有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，然而近年來牦牛重大疫病的發(fā)生和不斷加強(qiáng)的趨勢所帶來的影響和損失讓人擔(dān)憂。因此，研究牦牛分子免疫機(jī)制具有重要理論及實(shí)踐意義。

表3TLR1～10基因的核苷酸序列同源性比較

Table 3 Alignment ofTLR1-10 gene sequences

名稱Name物種Species長度/bpLength核苷酸相似性/%NucleotidesimilaritytoMaiwayak氨基酸相似性/%AminosimilaritytoMaiwayakGenBank登錄號GenBankaccessionNo.TLR1YakBovineOvineHumanMouse2183218421962361238899.1396.6384.4378.4998.2194.5582.1177.87KJ101605.1NM_001046504.1NM_001135060.2NM_003263.3NM_001172120.2TLR2YakBovineOvineHumanMouse2355235523552355235599.0295.7183.8276.1894.1190.0176.5366.58KF977429.1NM_174197.2DQ890157.1NM_003264.3NM_198769.2TLR3YakBovineOvineHumanMouse2714271527152715271899.2696.884.4279.9598.7895.9182.5278.34KF990165.1NM_001008664.1NM_001135928.1NM_003265.2NM_198791.1TLR4YakBovineOvineHumanMouse2526252325232520250899.2596.2382.1475.1692.1789.7675.864.07KF977430.1NM_174198.6NM_001135930.1AB445638.1NM_019178.1TLR5YakBovineOvineHumanMouse2576257725772577261697.3696.4783.2475.8795.6693.3578.4170.52KJ101606.1NM_001040501.1NM_001135926.1NM_003268.5NM_001145828.1TLR6YakBovineOvineHumanMouse2397238223942391242197.5796.9186.4977.6496.3494.9880.6571.55KM359137NM_001001159.1NM_001135927.1AB020807.1NM_207604.1TLR7YakBovineOvineHumanMouse3153315331413150315399.8198.2887.4382.3799.7198.0986.2780.76KM359138NM_001033761.1NM_001135059.1NM_016562.3NM_001097582.1TLR8YakBovineOvineHumanMouse3102307531023180309097.4397.5681.0276.0196.1595.3476.0470.23KM359140NM_001033937.1NM_001135929.1AF246971.1NM_001101009.1TLR9YakBovineOvineHumanMouse309030903099309999.1495.8684.2377.8399.0395.0379.2470.81KM359141NM_183081.1NM_001011555.1NM_017442.3NM_198131.1TLR10YakBovineOvineHumanMouse2296243923312436243699.3795.0786.1977.4598.9994.280.2368.57KM359139NM_001076918.2NM_001135925.1AB445680.1NM_001146035.1

圖3 TLR1～10 基因的核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of TLR1-10 gene sequences

圖4 Real-time PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curves of the real-time PCR

圖5 TLR1～10基因組織表達(dá)分布Fig.5 Tissues expression and distribution of TLR1-10 genes

3.1 克隆及序列分析

本研究克隆了麥洼牦牛天然免疫受體TLR1～10家族基因，利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對所得序列進(jìn)行分析和預(yù)測。眾所周知，TLRs分子中胞外區(qū)LRRs結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及排布是TLRs識(shí)別不同類別PAMPs配體的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，TIR結(jié)構(gòu)域是免疫信號向胞內(nèi)傳導(dǎo)，激活天然免疫的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。麥洼牦牛TLR蛋白結(jié)構(gòu)分析預(yù)測顯示，TLR家族成員間結(jié)構(gòu)及排布相似但各成員所含LRR及TIR結(jié)構(gòu)域數(shù)量有較大的差異，提示，牦牛TLR不同成員可能有相似的PAMPs識(shí)別配體，但其信號傳導(dǎo)通路可能不盡相同；與牛、羊、人、雞等不同物種TLRs蛋白功能結(jié)構(gòu)與排布方式比較，發(fā)現(xiàn)麥洼牦牛TLR蛋白結(jié)構(gòu)域與牛、羊數(shù)量與分布位置較為一致，與其他物種間TLRs蛋白大小相近，但蛋白功能結(jié)構(gòu)域排布方式存在差別。認(rèn)為麥洼牦牛TLR1～10基因盡管與其他物種TLRs結(jié)構(gòu)域存在細(xì)微差別，但由此可以推斷不同物種間TLRs蛋白應(yīng)該識(shí)別相類似的配體，發(fā)揮相同的功能。

牦牛與牛和綿羊等內(nèi)地平原物種相比生活生長環(huán)境惡劣，同等條件下對某些傳染性疾病的抵抗能力相對較強(qiáng)，本研究推測，麥洼牦牛免疫分子機(jī)制與其他物種相比可能存在特殊性，但同源性分析結(jié)果顯示，麥洼牦牛TLR家族基因與其他物種表現(xiàn)出高同源性，其中同源性最高的是牛和綿羊，與人、馬和鼠的同源性也相對較高。這一結(jié)果與K.MeGurie等在牛、羊及山羊上的研究結(jié)果基本一致[4-8]。推測，麥洼牦牛TLR家族基因可能在最初遺傳進(jìn)化時(shí)與其他物種的TLR一樣起源于同一祖先，這也提示我們TLR基因在不同物種間依然保持有高度的同源性和保守型可能是因?yàn)槠湓跈C(jī)體天然免疫和獲得性免疫過程中擔(dān)任著非常重要的作用，其所識(shí)別的病原微生物結(jié)構(gòu)模式要求其必須高度保守[9-11]。盡管TLRs基因有很高的保守性，然而在麥洼牦牛所有TLR家族成員中TLR2和TLR4卻表現(xiàn)出相對較低的同源性，這說明在不斷的遺傳進(jìn)化中部分TLRs成員會(huì)因?yàn)閯?dòng)物機(jī)體所處環(huán)境及所識(shí)別病原微生物的不同而發(fā)生特異性的改變[12-13]。雖然與其他物種TLR相比麥洼牦牛TLR家族基因編碼區(qū)亦高度保守，但推測由于高原惡劣環(huán)境影響的差異性和麥洼牦牛物種本身的特殊性，麥洼牦牛TLR基因可能還是與其他物種相比存在差異，這種差異有可能存在于編碼區(qū)之外的區(qū)域，如啟動(dòng)子區(qū)域或是由于甲基化等表觀遺傳學(xué)方面的差異造成[14-16]。

麥洼牦牛與其他物種的TLRs的遺傳進(jìn)化關(guān)系表明，麥洼牦牛進(jìn)化距離最近的是牛和綿羊。在進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，TLR1、2、6、10和TLR7、8、9分別聚集在兩個(gè)單個(gè)的分支上，其中TLR1、TLR6、TLR10又聚為更緊密的一支，TLR其他成員各自成為一支。推測這種分組可能是基于配體結(jié)合特性，TLR7、8、9是作為內(nèi)體與其配體結(jié)合，TLR1、6、10則作為異源二聚體與TLR的配體結(jié)合，進(jìn)而傳遞細(xì)胞信號引起相關(guān)免疫反應(yīng)。這也提示人們，保守的TIR在結(jié)合配體過程中通過相似的模式組合配體，進(jìn)而在細(xì)胞信號傳遞中發(fā)揮重要的作用[17-19]。

3.2 熒光定量方法的建立及組織表達(dá)分布研究

本試驗(yàn)采用SYBR Green I熒光染料嵌合法檢測麥洼牦牛天然免疫受體TLRs家族基因的熒光定量PCR方法。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，TLR1～10和β-actin基因的相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.990，說明Ct值與cDNA濃度間具有良好的線性關(guān)系；TLR1～10和β-actin基因擴(kuò)增效率(E)在1.0左右，說明擴(kuò)增效率基本相同，以上分析說明建立的熒光定量檢測方法快速、敏感性高、特意性強(qiáng)等，可用于2-△△Ct相對定量的PCR分析。數(shù)據(jù)分析上，本試驗(yàn)選擇了相對定量法，利用內(nèi)參基因β-actin消除mRNA的提取效率和反轉(zhuǎn)錄效率間的差異，對麥洼牦牛TLR1～10基因mRNA表達(dá)水平的檢測結(jié)果進(jìn)行校正，保證了研究結(jié)果的可靠性。試驗(yàn)證明了該方法具備很好的穩(wěn)定性，是可行的。

組織表達(dá)結(jié)果顯示，麥洼牦牛TLRs在各主要器官組織均有表達(dá)，但不同成員在不同組織的表達(dá)存在較大的差異?？傮w來看，麥洼牦牛TLR家族成員在免疫及與免疫相關(guān)的組織和器官例如脾、肝、腎、肺均有相對較高的表達(dá)量，這說明TLR作為天然免疫識(shí)別受體其與麥洼牦牛免疫相關(guān)的組織器官之間保持者相當(dāng)緊密的聯(lián)系，在機(jī)體面臨病原入侵時(shí)參與其中并發(fā)揮重要作用。麥洼牦牛腹瀉性疾病及麥洼牦牛生殖性疾病在飼養(yǎng)過程中特別常見，本研究中，麥洼牦牛TLR1、TLR2、TLR4及TLR6等成員在麥洼牦牛小腸和生殖相關(guān)的卵巢組織中高表達(dá)，提示我們TLRs很可能參與牦牛相關(guān)的黏膜免疫系統(tǒng)，在牦牛常見的腸道疾病以及生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色，這為人們進(jìn)一步解決牦牛腹瀉和生殖疾病導(dǎo)致的繁殖能力低下等難題提供新的思路。同時(shí)，通過比較發(fā)現(xiàn)，麥洼牦牛TLR1、TLR6基因在各組織的表達(dá)比較相似，TLR2與TLR4、TLR7與TLR8、TLR9表達(dá)比較相似。這與J.S.Chang等、K.A.Zarember等和A.O.Monica等的研究結(jié)果基本一致[20-22]。TLR2和TLR4除了能夠各自識(shí)別革蘭陽性菌的脂蛋白和脂多糖之外，TLR2、TLR4能夠共同識(shí)別外分泌蛋白MD-2進(jìn)而引起細(xì)胞反應(yīng)，此外TLR2、TLR4在炎性反應(yīng)中同時(shí)受一些炎性因子的調(diào)控[23]。TLR7、TLR8和TLR9在識(shí)別配體以及相關(guān)號傳遞過程中也均有很多相似和內(nèi)在的聯(lián)系，這提示人們麥洼牦牛這些基因之間表達(dá)相似可能是與其在識(shí)別病原微生物并參與動(dòng)物機(jī)體抗病免疫過程中相互協(xié)調(diào)調(diào)控共同發(fā)揮作用有關(guān)。

綜上所述，本研究成功克隆了麥洼牦牛TLR1～10基因，并利用相關(guān)生物學(xué)軟件對其生物學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行分析，同時(shí)建立了檢測麥洼牦牛TLR1～10 基因的熒光定量PCR 方法，并對天然免疫受體基因TLR在麥洼牦牛各組織中的表達(dá)進(jìn)行了研究。這為進(jìn)一步理解和研究天然免疫受體TLRs 在牦牛等高原動(dòng)物的免疫分子機(jī)制以及抗病育種提供理論基礎(chǔ)。

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(編輯 郭云雁)

Molecular Cloning and Biological Characterization Analysis of Toll-like Receptors 1-10 in Maiwa Yak

LIN Bao-shan，LAN Dao-liang*，CHEN Ya-bing，HUANG Cai，F(xiàn)U Mei，LI Jie，LI Jian*

(CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities/CollegeofTibetanPlateauResearch，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China)

In this study，the coding region of Maiwa yak toll-like receptors 1-10 genes were cloned，and then the bioinformatics tool was used to analyze the characteristics ofTLRssequences，and real-time PCR was used to detect the expression pattern ofTLRs.The results showed that Maiwa yakTLRgenes exhibited high homologies at the nucleotide and the amino acid levels with other species.Phylogenetic relationships showed that Maiwa yak had a nearest relationship with cattle and sheep,Maiwa yak was clustered into a branch with human,horse and mouse.It was noteworthy that TLR1，TLR6 first clustered into a small branch，then gathered with TLR10 for a closer one，then TLR1，2，6，10 and TLR7，8，9 were gathered in the 2 individual branches，respectively.The other members of TLRs became respective one.Real-time PCR results showed thatTLRswere expressed in all tissues of yak，but different members had different expression patterns.TLR2，TLR4 andTLR6 had the highest expression in the spleen，followed with ovary，small intestine，kidney，liver.TLR1，TLR5，TLR7，TLR8，TLR9 andTLR10 had the highest expression in kidney，higher expression in liver，kidney，spleen.The study provide useful information for further study in immune molecular mechanisms and disease resistance breeding of yaks.

Maiwa yak；TLR1-10；cloning；real-time PCR；expression and distribution in tissues

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.007

2014-08-01

西南民族大學(xué)中央高校青年教師基金項(xiàng)目(2014NZYQN37)；西南民族大學(xué)研究生學(xué)位點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目(2014XWD-S0906)

林寶山(1987-)，男，藏族，甘肅天祝藏族自治縣人，碩士生，主要從事高原動(dòng)物分子免疫機(jī)制方面的研究，E-mail:172407151@qq.com

*通信作者：蘭道亮，副教授，博士，主要從事高原動(dòng)物分子免疫機(jī)制方面的研究，E-mail：landaoliang@163.com；李 鍵，教授，博士，主要從事動(dòng)物生殖調(diào)控研究，E-mail：lijian@swun.cn

S823.8+5；S813.3

A

0366-6964(2015)05-0728-10