皮文輝，周 平，王立民，唐 紅，郭延華，張譯元，劉守仁，王新華

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團綿羊遺傳改良和健康養(yǎng)殖重點實驗室，石河子 832000)

TALENs編輯綿羊成纖維細胞FGF5基因

皮文輝，周 平，王立民，唐 紅，郭延華，張譯元，劉守仁，王新華*

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團綿羊遺傳改良和健康養(yǎng)殖重點實驗室，石河子 832000)

類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物(Transcription activator-like effector，TALE)已經(jīng)成為基因組編輯和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的有效工具，在多個物種的基因組中實現(xiàn)特定位點的刪除、插入和突變。針對綿羊成纖維細胞生長因子5(Fibroblast growth factor 5，F(xiàn)GF5)基因起始密碼子ATG位點，設(shè)計構(gòu)建TALENs(Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)。通過比較分析正常培養(yǎng)和基因組編輯處理的綿羊成纖維細胞，電轉(zhuǎn)TALENs組合，Surveyor突變檢測，篩選獲得1對有效的TALENs。有限稀釋細胞傳代培養(yǎng)，PCR擴增FGF5基因片段，經(jīng)PAGE檢測篩選發(fā)生突變的細胞，測序確認(rèn)FGF5基因ATG位點產(chǎn)生缺失突變細胞。獲得具有編輯活性的TALENs，為該基因的定點編輯奠定基礎(chǔ)。Surveyor檢測和測序結(jié)果表明，在綿羊FGF5基因ATG起始密碼子上游104堿基位點，存在1個G/C單核苷酸多態(tài)。

類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶；基因組編輯；成纖維細胞生長因子5基因；單核苷酸多態(tài)；綿羊

J.M.Hébert等[1]針對小鼠胚胎干細胞的FGF5基因第一外顯子，采用基因打靶，成功導(dǎo)入含多個終止密碼子的干擾基因，利用重構(gòu)ES細胞制作嵌合體小鼠，通過繁育嵌合體小鼠，獲得FGF5基因敲除的純合體小鼠，證實缺失FGF5基因使毛囊生長Ⅵ期延長，F(xiàn)GF5因子對毛發(fā)生長具有抑制作用。T.A.Rosenquist等[2]發(fā)現(xiàn)FGF5的受體FGFRl(Fibroblast growth factor receptor 1，F(xiàn)GFR1)在毛囊真皮乳頭中表達，表明FGF5誘導(dǎo)毛乳頭促進毛囊生長期向退行期轉(zhuǎn)變。狗、貓等長毛性狀與FGF5基因突變相關(guān)[3-4]。高愛琴等發(fā)現(xiàn)綿羊FGF5基因存在多態(tài)性[5]。

在基礎(chǔ)和應(yīng)用研究方面，基因組編輯(Genome editing)技術(shù)能夠快速地實現(xiàn)遺傳修飾。其中以TALE結(jié)合DNA的高度專一性為理論基礎(chǔ)[6-7]，加之研究開發(fā)的模塊化構(gòu)建程序，使TALEs成為基因組編輯(Genome editing)和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控(Transcriptional modulation)的有效工具[8-12]。TALENs靶向結(jié)合DNA，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(DNA double-srand breaks，DSBs)。所有真核細胞內(nèi)，DSBs激活兩條保守的DNA修復(fù)通路。非同源末端連接修復(fù)(Non-homologous end joining，NHEJ)能夠?qū)嗔训娜旧w重新連接，在斷裂位點產(chǎn)生小片段插入或刪除，定點改變基因組的DNA序列。這一技術(shù)已迅速在多個物種中(絕大部分在個體水平)成功應(yīng)用，開啟了反向遺傳學(xué)研究的新天地，在基礎(chǔ)理論研究、臨床治療和農(nóng)牧漁業(yè)等領(lǐng)域必將有越來越廣闊的應(yīng)用前景，并且產(chǎn)生不可估量的深遠影響[11]。

本研究針對綿羊FGF5基因的ATG起始密碼子位點，設(shè)計構(gòu)建了4對TALENs。通過綿羊成纖維細胞測試，獲得FGF5基因ATG起始密碼子發(fā)生突變的細胞，將有助于綿羊FGF5基因功能的研究。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

TALE Toolbox kit(No.1000000019)由Addgene非營利組織提供。QuickExtract DNA 抽提液(Epicentre，cat.No.QE09050)、Surveyor 凝膠電泳突變檢測試劑盒(Transgenomic，cat.No.706025)。Herculase II fusion polymerase(Agilent Technologies)、Pfu高保真DNA聚合酶(TIANGEN，Co.No.EP101)、Esp3 I(BsmB I，F(xiàn)ermentas)和AfeI(Fermentas)、BsaI-HF(NEW England Biolabs)、T7 DNA ligase(Enzymatics)、PlasmidSafe ATP-dependent DNase(Epicentre)、DNA A-Tailing Kit(TaKaRa)。瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒(生工生物工程(上海)公司)，DL2000 DNA marker(寶生物工程(大連)公司)，100 bp Plus DNA Ladder Marker(研域(上海)化學(xué)試劑公司)，DH5α大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細胞(天根生化科技(北京)公司)，核酸染料GELVIEW(北京百泰克生物技術(shù)公司)，引物合成和測序由Invitrogen公司完成。DMEM高糖培養(yǎng)液(Gibco，12800-017)，胎牛血清(Biological Industries，04-001-1A)。

1.2 方法

1.2.1 TALENs設(shè)計 針對綿羊FGF5基因ATG起始密碼子位點，利用TAL effector Nucleotide Targer 2.0(https：//tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen)設(shè)計TALENs組合，5′端保留T堿基。圍繞FGF5基因起始密碼子ATG位點周圍，設(shè)計4對TALENs組合：TALFGF5F1/TALEFGF5R1、TALFGF5F1/TALEFGF5R2、TALFGF5F2/TALEFGF5R3和TALFGF5F2/TALEFGF5R4。受5′端保留T堿基條件限制，造成TALFGF5F1/TALEFGF5R1和TALFGF5F1/TALEFGF5R2兩對TALENs組合切割位點位于ATG起始密碼子上游。圖1是TALENs靶向DNA序列。

1.2.2 TALENs構(gòu)建 根據(jù)相關(guān)報道的程序，應(yīng)用Golden Gate克隆法和PCR構(gòu)建TALENs[9-11]。構(gòu)建程序：首先用Herculase II fusion polymerase PCR擴增得到單體模塊DNA。接著用“Golden Gate”克隆法將N1N2N3N4N5N6、N7N8N9N10N11N12和N13N14N15N16N17N18分別組裝形成3個環(huán)形六聚體。每個“Golden Gate”反應(yīng)體系中，BsmB I酶切6條單體DNA片段，產(chǎn)生黏性末端依次互補的DNA片段，這些黏性末端順次連接，形成不含BsmB Ⅰ酶切位點的重復(fù)單元串聯(lián)環(huán)形六聚體。然后以環(huán)形六聚體為模板，熱啟動PfuDNA聚合酶PCR擴增得到線性六聚體。用BsaⅠ酶切TALENs骨架質(zhì)粒和3條線性六聚體，產(chǎn)生黏性末端依次互補的DNA片段，再用“Golden Gate”克隆法順次連接DNA片段的黏性末端。AfeⅠ酶切鑒定構(gòu)建TALENs質(zhì)粒的正確性。

圖1 綿羊FGF 5基因ATG起始密碼子位點的TALENs靶序列Fig.1 TALENs targeting the ATG initiation codon of ovine FGF 5 gene

1.2.3 細胞培養(yǎng) 選取2周歲超細型細毛羊公羊，無菌操作采其耳緣組織，剪碎，采用組織塊培養(yǎng)法，獲得原代成纖維細胞。經(jīng)過3次傳代培養(yǎng)獲得的成纖維細胞，用于TALENs電轉(zhuǎn)處理。綿羊成纖維細胞培養(yǎng)采用DMEM培養(yǎng)液，15%胎牛血清，37 ℃、5.0% CO2飽和濕度培養(yǎng)。當(dāng)細胞生長至匯合度90%時，用0.25%胰蛋白酶液消化細胞，400 g 離心10 min，洗滌收集細胞，用于電轉(zhuǎn)染和細胞基因組檢測。

1.2.4 電轉(zhuǎn)染 按照Amax Nucleofector II電轉(zhuǎn)儀操作說明，1∶50倍預(yù)混S1溶液和S2溶液。收集2×106個細胞，用100 μL電轉(zhuǎn)液懸浮細胞，加入5 μg除內(nèi)毒素的TALENs質(zhì)粒(每個TALEN加2.5 μg)，混勻轉(zhuǎn)入電擊杯中。選擇小鼠胚胎成纖維細胞電轉(zhuǎn)程序CZ-165，對綿羊成纖維細胞實施電轉(zhuǎn)。靜置10 min，加入培養(yǎng)液懸浮細胞，將細胞轉(zhuǎn)入6孔培養(yǎng)板，31 ℃、5.0% CO2飽和濕度培養(yǎng)96 h。1.2.5 Surveyor檢測TALENs活性 取1/3細胞收集于200 μL PCR管中，用20 μL QuickExtract DNA 抽提液懸浮細胞，68 ℃ 15 min、95 ℃ 8 min裂解細胞。細胞裂解液做模板，熱啟動PfuDNA聚合酶擴增靶點DNA序列，引物FGF5svF/FGF5svR：ATTCGCCCTCTCCCATCTCCTC/CG-ATGCCCACTCTGCAGTAGAG。PCR反應(yīng)：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，68 ℃ 1 min，35個循環(huán)；68 ℃ 3 min。PCR擴增DNA片段長629 bp，ATG起始密碼子位于該DNA片段5′端332～334位堿基。根據(jù)高愛琴報道，本研究擴增的DNA片段5′端340位堿基可能存在TG多態(tài)(圖2)[5]。綿羊野生型基因組DNA擴增作為陽性對照。凝膠電泳膠回收純化DNA目的片段。為了實現(xiàn)DNA異源雙鏈和同源雙鏈雜交。取300 ng膠回收純化DNA，用1×Pfubuffer稀釋至20 μL體積，采用PCR儀控溫進行緩慢變性復(fù)性過程[10]?；旌蟂urveyor突變檢測試劑成份，42 ℃水浴1 h，加2 μL終止液停止Surveyor 核酸內(nèi)切酶反應(yīng)。10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測確定TALENs組合的活性。

FGF5svF、FGF5svR.PCR擴增629 bp DNA目的片段的引物；FGF5cxF、FGF5cxR.PCR擴增406 bpDNA目的片段的引物；ATG.綿羊FGF 5基因起始密碼子；T/G.SNP位點[5]；G/C.SNP位點FGF5svF and FGF5svR.A pair of primers for 629 bp DNA fragment amplified by PCR；FGF5cxF and FGF5cxR.A pair of primers for 406 bp DNA fragment amplified by PCR；ATG.The initiation codon of ovine FGF 5；T/G.A point mutation identified by A.Q.Gao[5]；G/C mutation.Identified by the experiment圖2 PCR擴增FGF 5基因示意圖Fig.2 DNA fragment schematic diagram of ovine FGF 5 gene amplified by PCR

1.2.6 細胞篩選 將TALENs處理有效的試驗組細胞經(jīng)有限稀釋接種于96孔培養(yǎng)板。細胞培養(yǎng)采用添加15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5.0%CO2飽和濕度培養(yǎng)。經(jīng)15 d培養(yǎng)，換液1次。96孔板中細胞生長至2/3底面積時，0.25%胰蛋白酶消化，直接傳代至24孔板，6 h后換新鮮培養(yǎng)液。細胞繼續(xù)培養(yǎng)12～18 d，生長至匯合度90%時，胰酶消化細胞，取2/3細胞凍存，剩余1/3細胞裂解。試驗期共獲得71孔細胞。用引物FGF5cxF：GTGCACGGAGCAGTGAGAT，F(xiàn)GF5cxR：AGAAGAGG-AAGACACGGTGC，PCR反應(yīng)：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，68 ℃ 40 s，35個循環(huán)；68 ℃ 3 min。PCR擴增406 bp DNA片段，10% SDS-PAGE電泳檢測，篩選基因型突變細胞。采用DNA A-Tailing Kit 處理，PCR擴增DNA片段，實現(xiàn)末端加A，T載體連接測序。

2 結(jié) 果

2.1 TALENs活性檢測

1.TALFGF5F1/TALFGF5R1；2.TALFGF5F1/TALFGF5R2；3.TALFGF5F2/TALFGF5R4；4、5.TALFGF5F2/TALFGF5R3；6.綿羊肌肉組織基因組PCR擴增片段的Surveyor檢測結(jié)果；7.綿羊FGF 5基因組的PCR擴增片段變性復(fù)性電泳圖；M1、M2.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1，2，4，5.Invalid TALEN combinations.3.Cleavage activity by TALFGF5F2 and TALFGF5R4 combination；6.Surveyor result of wild-type genome of sheep；7.PCR production with primers FGF5svF and FGF5svR from muscle DNA of sheep；M1，M2.DL2000 and 100 bp Plus DNA Ladder marker圖3 Surveyor檢測TALENs的裂解活性電泳圖Fig.3 Gel showing the Surveyor nuclease result from different TALEN pairs

Surveyor突變檢測電泳顯示(圖3)，3號泳道樣本存在不同的DNA異源雙鏈雜交酶切帶型，說明TALFGF5F2/TALFGF5R4組合成功誘導(dǎo)斷裂綿羊成纖維細胞的FGF5基因DNA雙鏈，產(chǎn)生突變重組結(jié)果。6號泳道是綿羊肌肉組織基因組PCR擴增片段的Surveyor檢測結(jié)果，7號泳道是綿羊FGF5基因組的PCR擴增片段變性復(fù)性電泳圖，說明擴增片段自身也含有多態(tài)。如果該多態(tài)位點是T/G，其Surveyor突變檢測電泳條帶應(yīng)該是包含340和289 bp。而第6泳道電泳條帶大小是400和220 bp左右。這與高愛琴等[5]發(fā)現(xiàn)的綿羊FGF5基因第1外顯子中的T/G多態(tài)性結(jié)果不相符。根據(jù)第6、7泳道判斷，PCR擴增的該綿羊個體基因組的FGF5 基因629 bp片段存在多態(tài)位點，且是雜合子，目的基因PCR擴增Surveyor檢測片段自身存在多態(tài)性，變性退火后產(chǎn)生異源雙鏈DNA雜交分子(圖3)。

設(shè)計TALENs作用于ATG位點，如果TALENs有活性，用Surveyor突變檢測，電泳結(jié)果將產(chǎn)生290和330 bp左右的DNA片段。由于3號泳道含有大小接近于290和330 bp的DNA條帶，說明TALFGF5F2/TALFGF5R4組合具有酶切活性。由于Surveyor酶切條帶較多，較難使用光密度值對DNA電泳條帶進行定量，所以未計算TALFGF5F2/TALFGF5R4組合的活性。

2.2 細胞篩選結(jié)果

有限稀釋法將TALENs處理的細胞接種于96孔板，增殖傳代至24孔培養(yǎng)板。收集2/3的細胞凍存，1/3的細胞進行PCR檢測。PCR擴增后PAGE電泳分析DNA帶型。從71孔細胞中得到3個明顯不同于其它樣品的帶型。圖4中的12、40和64號細胞樣品的DNA帶型不同于肌肉組織樣品(“+”泳道)和2號樣品。

M.100 bp Plus DNA Ladder；+.綿羊肌肉組織樣品；2、12、40、64.有限稀釋后獲得的不同細胞樣品M.100 bp Plus DNA Ladder marker；+.Ovine muscle；2，12，40，64.Different cell samples圖4 綿羊成纖維細胞FGF 5基因PCR片段PAGE檢測結(jié)果Fig.4 PAGE result of FGF 5 gene fragment of ovine fibroblasts with FGF5cxF and FGF5cxR primers

2.3 測序結(jié)果

不同細胞基因組擴增DNA片段連接T載體測序。序列比對結(jié)果如圖5A，缺失堿基位點見圖5B。分析顯示，12反向測序，黑色豎線標(biāo)記處缺失A堿基；40正向測序，標(biāo)記處缺失35個堿基；64反向測序缺失38個堿基。其中40和64缺失堿基包含ATG起始密碼子位點(圖5a，方框內(nèi)ATG是起始密碼子)。測序結(jié)果驗證了圖3檢測結(jié)果，確定獲得針對綿羊FGF5基因ATG起始密碼子位點有活性的TALENs。

A．不同細胞FGF 5起始密碼子位點部分堿基序列比對。野生型序列位于頂行，其余是不同克隆細胞的序列。B.不同細胞測序峰圖。.堿基缺失位置A.Sequence comparison within the ATG initiation codon of ovine FGF 5 sequence of the mutations from different cells.The wild-type sequence was shown at the top.Other sequences are different cells；B.Sequence map of different cells.Black lines showed deletion sites of different cells圖5 測序結(jié)果序列比對圖和測序圖Fig.5 Sequence comparison and sequence map of different cells

比對測序結(jié)果，證實在綿羊FGF5基因ATG起始密碼子上游104堿基位點存在一個G/C點突變(圖6)。對該位點單核苷酸多態(tài)進行Surveyor突變檢測理論分析，酶切DNA片段(629 bp)應(yīng)該產(chǎn)生228和401 bp大小的DNA條帶。這與圖3電泳結(jié)果相符。

圖6 綿羊FGF 5基因ATG起始密碼子上游104 bp處點突變測序圖Fig.6 A point mutation was identified at 104 base site of the ATG initiation codon upstream of ovine FGF 5 gene

3 討 論

綿羊毛長是一個數(shù)量性狀，長期選育改善了該性狀的表型。綿羊被毛生長的生理過程和性狀的遺傳機理復(fù)雜。從分子水平上探索羊毛的發(fā)生、生長機制，對進一步發(fā)掘細毛羊的遺傳潛力具有理論意義。

FGF5基因是小鼠、大鼠皮膚毛囊周期性生長的重要調(diào)控因子，參與調(diào)控毛囊從興盛期向休眠期轉(zhuǎn)化，其蛋白直接或間接誘導(dǎo)退行期的啟動，對毛發(fā)生長具有抑制作用[1-2]。綿羊群體中存在FGF5基因多態(tài)性，該基因?qū)ρ蛎L作用有待進一步研究證實[5]。本研究中新發(fā)現(xiàn)的SNP處于綿羊FGF5基因mRNA 5′UTR區(qū)(JQ941956)，其生物學(xué)功能需要進一步試驗確認(rèn)。

將目的基因定點突變或敲除，是研究基因功能的直接途徑之一。J.M.Hébert等[1]構(gòu)建的FGF5基因敲除純合體小鼠，為證實FGF5基因抑制毛發(fā)生長提供了直接生物學(xué)證據(jù)。新的基因編輯技術(shù)，拓寬了基因敲除技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域。TALENs技術(shù)已經(jīng)成功用于斑馬魚、小鼠、家蟬、豬和牛等動物，產(chǎn)生基因組定點突變[13-17]。應(yīng)用TALENs技術(shù)定點突變綿羊成纖維細胞FGF5基因，篩選得到有生物學(xué)活性的TALENs組合，實現(xiàn)FGF5基因定點突變，獲得起始密碼子ATG缺失的細胞基因組測序證據(jù)，為獲得該位點發(fā)生突變的綿羊成纖維細胞和直接闡明綿羊FGF5基因?qū)ρ蛎L影響提供基礎(chǔ)。

家畜成纖維細胞轉(zhuǎn)染人工核酸酶后，在30 ℃低溫環(huán)境培養(yǎng)，提高了基因組編輯效率[18-19]。這一簡單措施被多次采用[17，20]。本實驗室環(huán)境封閉，培養(yǎng)箱設(shè)定30 ℃時，持續(xù)報警，很難穩(wěn)定。為了利用低溫培養(yǎng)提高人工核酸酶編輯效率這個結(jié)論，本研究采用31 ℃低溫培養(yǎng)。

2013年10月6日-11月6日，實驗室選擇FGF5基因起始密碼子敲除的64號細胞克隆株作為核供體，進行了體細胞核移植，并移植克隆胚300枚，受體綿羊30只，未獲得妊娠結(jié)果。

應(yīng)用TALENs敲除綿羊FGF5基因起始密碼子，為研究綿羊FGF5基因功能提供了可能性。要獲得FGF5基因?qū)d羊毛發(fā)生長的功能性研究結(jié)果，需要進一步完善試驗過程多個環(huán)節(jié)，如優(yōu)良的細胞、單細胞傳代培養(yǎng)等。在哺乳動物受精卵原核期，胞質(zhì)注射TALENs 的mRNA，是獲得基因靶向定點突變個體動物的有效途徑[17，20]。應(yīng)用有效編輯綿羊FGF5基因位點的TALENs，對綿羊原核期受精卵實施胞質(zhì)內(nèi)注射mRNA，可能是獲得FGF5基因突變個體綿羊的更好途徑。研究獲得的有效TALENs、確定新SNP位點，將為推進綿羊FGF5基因功能研究提供基礎(chǔ)。

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(編輯 程金華)

Editing Fibroblast Growth Factor 5 Gene in Ovine Fibroblasts Using TALENs

PI Wen-hui，ZHOU Ping，WANG Li-min，TANG Hong，GUO Yan-hua，ZHANG Yi-yuan，LIU Shou-ren，WANG Xin-hua*

(KeyLaboratoryofSheepGeneticImprovementandHealthyProduction，XinjiangAcademyofAgriculturalandReclamationScience，Shihezi832000，China)

Transcriptional activator-like effector (TALE) technologies were established over the last decade as useful tools for genomic editing and transcriptional modulation.Moreover，TALE nucleases (TALENs) technology can be used to bring about targeted gene deletion，insertion and mutagenesis in a siries of species genome.TALENs were designed to target the ATG initiation codon site of ovineFGF5 gene.According to the results of comparing normal culture and genome editing ovine fibroblasts，the activities of TALEN pairs were tested and screened by Surveyor nuclease after electric transfection TALEN plasmid pairs into ovine fibroblasts.After ovine fibroblast clones were cultured by limiting dilution，the screening of mutant cells was identified by PAGE electrophoresis after PCR amplification.The deletion mutations were introduced into ovineFGF5 gene of fibroblasts and identified by DNA sequencing.Mutated cells missing the ATG initiation codon of ovineFGF5 were obtained by valid TALENs.The acquisition of a pair of valid TALENs provides the basis for targeted disruption ovineFGF5 gene.A point mutation was identified at 104 base site of the ATG initiation codon upstream of ovineFGF5 gene by Surveyor mutation detection and sequence analysis.

transcription activator-like effector nuclease(TALEN)；genome editing；fibroblast growth factor 5 (FGF5) gene；single nucleotide polymorphism(SNP)；sheep

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.004

2014-11-02

兵團國際合作(2013BC004)；新疆兵團綿羊繁育生物技術(shù)重點實驗室項目(2013KLS01)；國家自然科學(xué)基金項目(31360276)；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(2015CB150300)

皮文輝(1972-)，男，新疆石河子人，博士，研究員，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail：wzjpwh@163.com

*通信作者：王新華，研究員，主要從事轉(zhuǎn)基因動物方面的研究，E-mail：wangxinhua5751@163.com

S826.2

A

0366-6964(2015)05-0704-07