郭若婷，魯慧文，歐科鵬，王 穎，劉 乙，顧真真，劉小軍

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003；2.新疆天康畜牧科技有限公司，昌吉 831100；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002)

綿羊Otx-2基因的分子克隆、組織表達(dá)及其與季節(jié)性繁殖關(guān)系的研究

郭若婷1，魯慧文2，歐科鵬1，王 穎1，劉 乙1，顧真真1，劉小軍3*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003；2.新疆天康畜牧科技有限公司，昌吉 831100；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002)

旨在研究綿羊Otx-2基因與綿羊繁殖的關(guān)系，從阿勒泰綿羊下丘腦組織中克隆Otx-2及MT1、KISS-1、GnRH基因CDs(Coding region)區(qū)部分序列，采用RT-PCR分析了這些基因在心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、胃、大腦、小腦、子宮、垂體、松果體、下丘腦和甲狀腺組織中的表達(dá)差異；進(jìn)一步用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析繁殖期和繁殖間期綿羊下丘腦中這些基因在日間和夜間表達(dá)的變化規(guī)律。結(jié)果表明，Otx-2和KISS-1、MT1基因在各組織中均有不同程度的表達(dá)，其中Otx-2和KISS-1在下丘腦中的表達(dá)量較高。Otx-2基因與KISS-1和GnRH基因在繁殖期的表達(dá)量均高于繁殖間期的表達(dá)量，且均表現(xiàn)出夜間的表達(dá)量極顯著高于日間表達(dá)量的相似表達(dá)規(guī)律，綜上表明，Otx-2基因可能參與綿羊的季節(jié)性繁殖調(diào)控。

Otx-2基因；下丘腦；季節(jié)性繁殖；綿羊

動(dòng)物的繁殖活動(dòng)受下丘腦-垂體-性腺軸(Hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPGA)系統(tǒng)的調(diào)控[1]。下丘腦GnRH神經(jīng)元合成分泌的促性腺激素釋放激素(Gonadotrophin-releasing hormone，GnRH)是引起動(dòng)物發(fā)情排卵的關(guān)鍵激素。2003年，兩項(xiàng)獨(dú)立的研究證實(shí)KISS-1基因及其產(chǎn)物Kisspeptin對(duì)動(dòng)物的生殖活動(dòng)具有重要的調(diào)控作用[2-3]。經(jīng)Kisspeptin處理的成年動(dòng)物可觀察到GnRH分泌增加[4-5]，而GnRH拮抗物acyline可阻斷大鼠、小鼠和靈長類動(dòng)物Kisspeptin激發(fā)促性腺激素的釋放[6]，可見Kisspeptin促進(jìn)促性腺激素的分泌是通過下丘腦通路激活GnRH神經(jīng)元實(shí)現(xiàn)的。此外，體外研究也表明，Kisspeptin可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)大鼠下丘腦組織中GnRH的釋放[7]。在GnRH分泌神經(jīng)元細(xì)胞系(GT1-7和GN11)中，GnRH分泌和GnRHmRNA水平隨著Kisspeptin處理以劑量和時(shí)間依賴的方式增加[8]。進(jìn)一步的研究顯示，KISS-1基因的表達(dá)受到褪黑激素(Melatonin，MT)介導(dǎo)的光周期調(diào)控，而褪黑激素的晝夜節(jié)律效應(yīng)由下丘腦視交叉上核(Suprtchiasmtic nucleus，SCN)的褪黑激素受體來完成，其繁殖效應(yīng)由垂體結(jié)節(jié)部(Parstuberalis，PT)的褪黑激素受體來完成[9]。哺乳動(dòng)物褪黑激素受體分兩個(gè)亞型，即MT1(Melatonin receptor 1A，MTNR1A又簡稱MT1)與MT2(Melatonin receptor 1B，MTNR1B又簡稱MT2)。哺乳動(dòng)物褪黑激素主要通過MT1的介導(dǎo)發(fā)揮作用，MT2可能由于其基因編碼區(qū)無義突變導(dǎo)致蛋白功能喪失。褪黑激素受體和KISS-1基因共同表達(dá)于下丘腦基底部[10]，把母綿羊從長日照轉(zhuǎn)換到短日照時(shí)，其下丘腦視前區(qū)和弓狀核尾部Kisspeptin表達(dá)量均增加，從而導(dǎo)致GnRH釋放，綿羊進(jìn)入繁殖期[11]。

GnRH分泌細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠GnRH基因啟動(dòng)子區(qū)存在有Kisspeptin作用的順式反應(yīng)元件(Kisspeptin-response element，KsRE)，而且具有1個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子Otx-2(Orthodenticle homeobox-2，Otx-2)的結(jié)合位點(diǎn)。Kisspeptin處理，使Otx-2 mRNA和蛋白水平都升高，并使結(jié)合于KsRE的Otx-2增加[12]。

Otx-2基因?qū)儆谕葱约棺祫?dòng)物中的果蠅正小齒基因[13]；這個(gè)直系同源組的成員在感光細(xì)胞和延髓腦區(qū)的發(fā)育中發(fā)揮重要作用[14]。Otx-2基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，可激活GnRH基因啟動(dòng)子[15-16]。人、小鼠、山羊、綿羊Otx-2基因的CDs序列已被克隆。綿羊Otx-2基因位于綿羊第7號(hào)染色體，其結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，編碼275個(gè)氨基酸?；蛐蛄械谋容^分析(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)表明，綿羊Otx-2基因核苷酸序列與人、小鼠、山羊的一致性分別為88.93 %、88.55 %和89.90 %。迄今為止，Otx-2基因在綿羊各組織中的表達(dá)水平尚不清楚，在綿羊繁殖調(diào)控中的作用也未見報(bào)道。本研究的目的首先是檢測綿羊Otx-2基因在各組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，以確定Otx-2基因在綿羊下丘腦有較高水平的表達(dá)，進(jìn)而分析綿羊下丘腦中Otx-2基因及其與繁殖季節(jié)性相關(guān)的基因MT1、KISS-1、GnRH在繁殖期與繁殖間期的表達(dá)規(guī)律，從而探討綿羊Otx-2基因與綿羊繁殖調(diào)控的關(guān)系，為揭示綿羊季節(jié)性發(fā)情的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集 試驗(yàn)綿羊選取符合品種特征的同齡阿勒泰成年母羊29只，同條件飼養(yǎng)。繁殖間期(6月份)母羊13只，在日間(10：00-16：00)屠宰5只、夜間(22：00-次日5：00)屠宰8只；繁殖期(同年11月份)母羊16只，在日間(10：00-16：00)屠宰6只、夜間(22：00-次日5：00)屠宰10只，采集下丘腦組織。采集繁殖間期日間包括心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、胃、大腦、小腦、子宮、垂體、松果體、下丘腦和甲狀腺組織，錫紙包裹液氮保存。

1.1.2 主要試劑 瓊脂糖、氨芐青霉素(AMP)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pGM-T克隆試劑盒均購自北京天根生物科技有限公司；2×EasyTaq PCR SuperMix、MarkerⅠ購自北京康為生物科技有限公司；RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司；Primescript RT reagent Kit with gDNA Erase試劑盒購自大連TaKaRa公司；QuantiFast SYBR Green PCR Kit試劑盒購自美國QIAGEN公司；胰蛋白胨、酵母提取物和瓊脂粉購自O(shè)XOID；IPTG、X-gal購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取與反轉(zhuǎn)錄 分別取各組織樣100 mg于液氮中研磨，用Trizol法提取總RNA，采用1 %的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA的完整性，用Nano 2000測定總RNA濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩NA反轉(zhuǎn)錄按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(perfect Real Time) 試劑盒說明書進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA置于-20 ℃保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI上已知的綿羊Otx-2(GenBank：XM_004011036.1)、MT1(GenBank：NM_001009725.1)、KISS-1(GenBank：XM_004013945.1)、GnRH(GenBank：XM_004004179.1)基因的核苷酸序列，用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)用于RT-PCR和熒光實(shí)時(shí)定量PCR；β-actin基因引物根據(jù)NCBI上已知的β-actin(GenBank：NM_001009784.1)基因序列設(shè)計(jì)。引物均由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增片段大小

Table 1 The primer sequences and product size for PCR

引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence序列長度/bpSequencelength退火溫度/℃Tmβ-actinF:AGAGCAAGAGAGGCATCCR:TCGTTGTAGAAGGTGTGGT10855MT1F:GTGGTGGTGTTCCATTTCATAGR:GCTTCAGTTTCGGTTTGTTGT12159KISS-1F:GCCTGATCCCGGCTCCGAR:CGTAGCGCAGGCCGAAGGAG9067Otx-2F:AAGTGCCGCCAACAR:GGGCTCCAGATAGACA18860GnRHF:TCCTGCTGACTTTCTGTGR:CTTAGGTTCTACTGGCTGAT14359

1.2.3Otx-2、MT1、KISS-1和GnRH基因部分CDs序列的克隆 取下丘腦組織總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA產(chǎn)物1 μL作為模板，應(yīng)用2×EasyTaq PCR SuperMix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系均為25 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，上下游引物各1.25 μL(10 μmol·L-1)，cDNA 1.25 μL，補(bǔ)ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 15 s，退火15 s，72 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR產(chǎn)物回收純化后，經(jīng)T4連接酶連入pGM-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，37 ℃過夜培養(yǎng)，藍(lán)白斑篩選陽性菌落，并擴(kuò)大培養(yǎng)8 h，鑒定為單個(gè)陽性克隆，送交深圳華大基因科技服務(wù)有限公司測序。

1.2.4Otx-2、MT1、KISS-1和GnRH基因的組織表達(dá)譜分析 將各組織總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA稀釋成相同濃度為模板，以β-actin基因作對(duì)照，用半定量RT-PCR進(jìn)行組織表達(dá)譜分析，PCR反應(yīng)體系均為25 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，上下游引物(表1)各1.25 μL(10 μmol·L-1)，相同濃度的cDNA 1.25 μL，補(bǔ)ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 2 min；94 ℃ 15 s，退火 15 s，72 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。每個(gè)PCR重復(fù)3次。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5Otx-2、MT1、KISS-1和GnRH基因表達(dá)的定量分析 根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，按照QuantiFast SYBR Green PCR Kit試劑盒的操作說明，以β-actin為內(nèi)參，檢測Otx-2、MT1、KISS-1和GnRH基因在阿勒泰綿羊繁殖期日間和夜間、繁殖間期日間和夜間下丘腦中的表達(dá)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物(表1)各2 μL，cDNA 0.5 μL，補(bǔ)ddH2O至25 μL。β-actin基因的反應(yīng)體系：2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，β-actin上下游引物各2 μL，cDNA 0.5 μL，補(bǔ)ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，退火 30 s，72 ℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。1.2.6 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)熔解曲線來判斷PCR反應(yīng)的特異性，根據(jù)熒光定量PCR所給出的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線中的擴(kuò)增效率計(jì)算出定量試驗(yàn)結(jié)果。所得結(jié)果采用MX3000P定量分析軟件進(jìn)行分析，目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率接近，為100%±5%，相對(duì)定量的結(jié)果采用的2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析，首先計(jì)算出繁殖期、繁殖間期的日間、夜間的下丘腦同一樣品3次重復(fù)的平均Ct值，然后計(jì)算出繁殖期、繁殖間期的日間、夜間的下丘腦目的基因與內(nèi)參基因的Ct差值，以其中同一時(shí)間點(diǎn)的下丘腦為對(duì)照，分別計(jì)算出其他時(shí)間點(diǎn)下丘腦的相對(duì)表達(dá)量。采用SPSS17.0 軟件的單因素方差分析，比較不同季節(jié)同一時(shí)段的下丘腦，以及不同時(shí)間段同一季節(jié)的下丘腦表達(dá)量的差異。P<0.05表明差異顯著，P<0.01表明差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1Otx-2、MT1、KISS-1和GnRH基因部分CDS序列克隆

以綿羊的下丘腦組織的總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長度分別為188、121、90和143 bp的Otx-2、MT1、KISS-1和GnRH的CDs序列。擴(kuò)增片段經(jīng)回收、克隆、測序后進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均為特異性目的基因。

2.2Otx-2、MT1、KISS-1和GnRH基因的組織表達(dá)譜

Otx-2、MT1、KISS-1和GnRH基因的組織表達(dá)譜見圖1。Otx-2、MT1和KISS-1基因在心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、胃、大腦、小腦、子宮、垂體、松果體、下丘腦、甲狀腺組織中均有不同程度的表達(dá)，尤其在子宮、松果體、下丘腦中表達(dá)較高。Otx-2基因在心、腎、小腸、小腦、子宮、松果體和下丘腦組織中表達(dá)較高；KISS-1基因在子宮、垂體、松果體和下丘腦中表達(dá)較高；MT1基因在心、腎、小腸、小腦和子宮中表達(dá)較高；GnRH基因在很多組織中均未檢測到，但在垂體和下丘腦中有較高表達(dá)。

1.心；2.肝；3.脾；4.肺；5.腎；6.大腸；7.小腸；8.胃；9.大腦；10.小腦；11.子宮；12.垂體；13.松果體；14.下丘腦；15.甲狀腺；M.MarkerⅠ1.Heart；2.Liver；3.Spleen；4.Lung；5.Kidney；6.Large intestine；7.Small inestine；8.Stomach；9.Brain；10.Epencephalon；11.Uterus；12.Hypophysis；13.Pineal body；14.Hypothalamus；15.Thyroid；M.MarkerⅠ圖1 阿勒泰綿羊Otx-2、KISS-1、MT1、GnRH和β-actin基因半定量RT-PCR表達(dá)結(jié)果Fig.1 The expression of Otx-2，KISS-1，MT1，GnRH and β-actin genes in different tissues of Altay sheep

2.3 繁殖期和繁殖間期Otx-2、MT1、KISS-1和GnRH基因在日間、夜間下丘腦中的表達(dá)

2.3.1Otx-2、MT1、KISS-1和GnRH基因在下丘腦中的表達(dá)情況 繁殖期和繁殖間期Otx-2及MT1、KISS-1、GnRH基因在日間、夜間下丘腦中的表達(dá)情況見圖2。Otx-2、MT1、KISS-1和GnRH基因在繁殖期和繁殖間期的日間、夜間的下丘腦都有不同程度的表達(dá)。

在繁殖期，Otx-2、KISS-1和GnRH基因夜間的相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于日間(P<0.01)；而在繁殖間期，Otx-2和KISS-1基因的相對(duì)表達(dá)量均為夜間極顯著高于日間(P<0.01)，KISS-1基因的相對(duì)表達(dá)量夜間極顯著高于日間(P<0.01)，但GnRH基因日間與夜間的相對(duì)表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)。日間，Otx-2、KISS-1和GnRH基因在繁殖期與繁殖間期的相對(duì)表達(dá)量無顯著性差異；夜間，Otx-2、KISS-1和GnRH基因在繁殖期的相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于繁殖間期(P<0.01)。無論繁殖期和繁殖間期，MT1基因(圖2C)日間的相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于夜間的相對(duì)表達(dá)量(P<0.01)。但在日間或夜間，繁殖期與繁殖間期的相對(duì)表達(dá)量均無顯著性差異。

同一時(shí)段不同季節(jié)間大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；不同時(shí)段同一季節(jié)間**.差異極顯著(P<0.01)；*.差異顯著(P<0.05)。A.Otx-2基因；B.KISS-1基因；C.MT1基因；D.GnRH基因In different seasons of same time，different uppercase and lowercase letters severally indicate extremely signicant difference(P<0.01) and difference(P<0.05)；In same season of different time，** and *severally indicate extremely signicant difference(P<0.01) and difference(P<0.05).A.Otx-2；B.KISS-1;C.MT1；D.GnRH圖2 阿勒泰綿羊Otx-2、MT1、KISS-1和GnRH基因在繁殖期和繁殖間期的下丘腦相對(duì)表達(dá)量Fig.2 The relative expression of Otx-2，MT1，KISS-1 and GnRH genes in breeding seasons and non-breeding seasons of Hypothalamus of Altay sheep

3 討 論

下丘腦是動(dòng)物繁殖的調(diào)控中心，因此，在證實(shí)KISS-1基因及其產(chǎn)物Kisspeptin對(duì)動(dòng)物的生殖活動(dòng)具有重要的調(diào)控作用后[2-3]，人們首先對(duì)KISS-1基因在下丘腦中的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了研究。運(yùn)用RT-PCR和免疫組織化學(xué)等技術(shù)對(duì)多種動(dòng)物的研究表明，KISS-1基因在下丘腦中表達(dá)，并且證實(shí)在嚙齒類動(dòng)物中，KISS-1基因主要在下丘腦前腹側(cè)室周核(Anteroventral periventricularnucleus，AVPV)和弓狀核(Arcuate nucleus，ARC)上表達(dá)[17-20]，除下丘腦之外，在垂體和卵巢上也發(fā)現(xiàn)KISS-1基因表達(dá)[21-23]，這些區(qū)域都是參與促性腺激素分泌調(diào)控的關(guān)鍵位點(diǎn)。對(duì)綿羊腦室內(nèi)注射Kisspeptin導(dǎo)致GnRH大量釋放入腦脊液中，同時(shí)血液促黃體素(Luteinizing hormone，LH)水平同步升高[24]，對(duì)小鼠、大鼠、猴和豬等多種動(dòng)物的研究表明，KISS-1基因在下丘腦的表達(dá)量于初情期明顯增加，且體內(nèi)注射Kisspeptin能促進(jìn)LH的分泌[25-27]，在小鼠和大鼠的嬰兒期和幼年期，腦室內(nèi)灌注或靜脈注射Kisspeptin均能促進(jìn)GnRH、促卵泡素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)和LH的分泌[28-29]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在蘇淮山羊的KISS-1基因的內(nèi)含子1上，存在一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)有利于提高山羊的產(chǎn)羔數(shù)[30]。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，母羊發(fā)情期下丘腦KISS-1基因的表達(dá)顯著高于發(fā)情周期的其他階段[31]，本研究通過半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，KISS-1基因在下丘腦-垂體-性腺軸系統(tǒng)中的各位點(diǎn)及子宮等性器官都有表達(dá)，并且在下丘腦繁殖期的表達(dá)量顯著高于繁殖間期，這些研究都表明KISS-1基因參與了動(dòng)物的繁殖活動(dòng)，并且對(duì)調(diào)控動(dòng)物生殖激素的分泌有一定促進(jìn)作用。

褪黑素主要是由松果體分泌的一種吲哚類激素，I.Blazer等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在所有動(dòng)物中褪黑素除有晝夜節(jié)律變化外，還存在季節(jié)性節(jié)律變化(夏季分泌期縮短，冬季分泌期延長)這對(duì)機(jī)體活動(dòng)起重要調(diào)節(jié)作用。研究者對(duì)各種哺乳動(dòng)物做了大量的研究發(fā)現(xiàn)，褪黑激素的分泌與動(dòng)物生殖密切相關(guān)[33]，短日照對(duì)綿羊這類動(dòng)物的生殖具有促進(jìn)作用[34]。褪黑激素的晝夜節(jié)律效應(yīng)由SCN的褪黑激素受體來完成，其繁殖效應(yīng)由PT的褪黑激素受體來完成[9]，對(duì)于綿羊，在PT處發(fā)現(xiàn)MT1型受體，提示垂體結(jié)節(jié)部可能是褪黑激素繁殖效應(yīng)的主作用位點(diǎn)。這些研究結(jié)果表明，MT1基因與綿羊的季節(jié)性繁殖活動(dòng)有關(guān)。本研究通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，MT1基因在阿勒泰綿羊的垂體和下丘腦中表達(dá)量很高；實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與前人研究結(jié)果相符[35-36]，在下丘腦中的表達(dá)呈現(xiàn)夜間低、日間高的趨勢，繁殖期與繁殖間期的表達(dá)量差異不顯著，說明下丘腦中的MT1基因與晝夜節(jié)律相關(guān)。

在人類的研究中發(fā)現(xiàn)，Otx-2基因變異可導(dǎo)致眼部畸形、多種垂體激素缺乏癥和垂體柄中斷綜合征[15-16，37-38]；Otx-2基因主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的前部表達(dá)，其表達(dá)的后界位于中腦與后腦的交界處[39]。H.J.Novaira等[8]研究發(fā)現(xiàn)，隨著Kisspeptin處理時(shí)間及處理劑量的增加，GnRHmRNA水平和蛋白分泌水平都有所提高。細(xì)胞體外試驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因小鼠的研究中表明，用Kisspeptin處理后的細(xì)胞，Otx-2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量都提高，并且其結(jié)合到GnRH啟動(dòng)子的活性也有所提高；敲除Otx-2基因的小鼠，與野生型小鼠相比，下丘腦GnRH的分泌量減少了80%，并且用Kisspeptin處理以后不能使GnRHmRNA表達(dá)增加[12]。這些研究都表明，Otx-2是Kisspeptin調(diào)控GnRH基因表達(dá)和動(dòng)物生殖活動(dòng)的重要因子。本研究表明，在Otx-2基因高表達(dá)的組織中，KISS-1、GnRH及MT1基因在這些組織中同樣表達(dá)量較高；在下丘腦中，KISS-1基因在繁殖期的夜間表達(dá)量最高時(shí)，Otx-2和GnRH基因也在這個(gè)生理狀態(tài)下表達(dá)量最高，這樣的現(xiàn)象表明，在綿羊中，Otx-2基因與KISS-1和GnRH基因的表達(dá)規(guī)律間存在一定聯(lián)系，可能協(xié)同調(diào)節(jié)綿羊的生殖和季節(jié)性繁殖活動(dòng)，但Otx-2調(diào)控綿羊繁殖活動(dòng)的分子機(jī)制是否與小鼠相同，還有待于進(jìn)一步研究。大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，Kisspeptin能通過GnRH促進(jìn)LH的分泌，其中在發(fā)情期作用最大，而在間情期的作用最小[40]。本研究顯示，在繁殖間期Otx-2的表達(dá)量與KISS-1和GnRH沒有呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性變化，可能是在繁殖間期，KISS-1基因的表達(dá)量很低，Otx-2基因的表達(dá)受Kisspeptin的調(diào)控作用減弱。Kisspeptin在繁殖間期可能不是調(diào)控Otx-2的主要因素。在復(fù)雜的機(jī)體內(nèi)環(huán)境中，Otx-2基因的表達(dá)量可能還受除Kisspeptin以外的其他因素調(diào)節(jié)，這些相關(guān)因素還需要進(jìn)一步深入探究。

4 結(jié) 論

綿羊Otx-2基因在心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、胃、大腦、小腦、子宮、垂體、松果體、下丘腦和甲狀腺組織中都有表達(dá)，但以下丘腦中的表達(dá)量較高。在繁殖期Otx-2、KISS-1和GnRH基因在下丘腦中的表達(dá)規(guī)律一致，因此推測綿羊Otx-2基因可能具有與小鼠Otx-2基因相似的功能，參與綿羊的季節(jié)性繁殖調(diào)控。

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(編輯 程金華)

Cloning and Tissues Expression Analysis ofOtx-2 and the Associations with Seasonal Breeding in Sheep

GUO Ruo-ting1，LU Hui-wen2，OU Ke-peng1，WANG Ying1，LIU Yi1，GU Zhen-zhen1，LIU Xiao-jun3*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，ShiheziUniversity，Shihezi832003，China；
2.TECONAnimalHusbandryTechnologyCorporation，Changji831100，China；3.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)

In order to understand the effect ofOtx-2 gene on sheep reproductive regulation，the part of CDS(Coding region)Otx-2，MT1，KISS-1，GnRHgenes were cloned from Altay sheep hypothalamus tissue.Semi-quantitative RT-PCR was used to analyze the tissues(heart，liver，spleen，lung，kidney，large intestine，small inestine，stomach，brain，epencephalon，uterus，hypophysis，pineal body，hypothalamus，thyroid) expression profile of the genes.The expression patterns ofOtx-2，MT1，KISS-1 andGnRHgenes in hypothalamus with different periods were further investigated by real-time fluorescence quantitative PCR.The results showed thatOtx-2 andKISS-1，MT1 mRNAs were expressed in many tissues tested，which hypothalamus showed higher expression levels forOtx-2 andKISS-1.In addition，theOtx-2 gene showed a similar expression pattern toKISS-1 andGnRH，which were significantly higher in the breeding seasons than that in the non-breeding seasons(P<0.01)，and also significantly higher in the night than in the day time(P<0.01).It was concluded thatOtx-2 gene might take part in seasonal reproduction in sheep.

Otx-2 gene；hypothalamus；seasonal breeding；sheep

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.003

2014-10-30

教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(博導(dǎo)類)(20126518110004)

郭若婷(1990-)，女，新疆石河子人，碩士生，主要從事綿羊分子遺傳育種研究，E-mail：674470976@qq.com

*通信作者：劉小軍，教授，博導(dǎo)，E-mail：xjliu2008@hotmail.com

S826.2

A

0366-6964(2015)05-0696-08