尹 磊，祁克宗， 涂 健，周秀紅，劉紅梅，王 曼，張艷娜

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036)

非編碼小RNA (RyhB)調(diào)控禽致病性大腸桿菌毒力相關(guān)基因的分析

尹 磊，祁克宗*， 涂 健，周秀紅，劉紅梅，王 曼，張艷娜

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036)

以小RNA(RyhB)為研究對象，探索RyhB對禽致病性大腸桿菌相關(guān)毒力基因的調(diào)控研究。采用Red同源重組技術(shù)構(gòu)建APEC野生株(AE17)RyhB的缺失株△RyhB以及構(gòu)建出回復(fù)株△RyhB-comp。運(yùn)用活菌計(jì)數(shù)法分別觀察AE17、△RyhB、△RyhB-comp黏附雞胚成纖維細(xì)胞DF-1的能力，并且利用Real-time PCR檢測AE17、△RyhB和△RyhB-comp的 8個(gè)毒力基因轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果成功構(gòu)建出了基因缺失株△RyhB和回復(fù)株△RyhB-comp，△RyhB黏附細(xì)胞能力較AE17均有顯著地降低，約為AE17的62.5%，△RyhB-comp較△RyhB黏附能力顯著上升，為△RyhB的1.4倍。同時(shí)，Real-time PCR結(jié)果顯示，△RyhB的bcfA、fyuA、tsh、luxS、fimC、ompA毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平均極顯著下降(P<0.01)，其mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別約為AE17的19%、52%、20%、14%、28%、52%；△RyhB的iss、ibeA毒力基因表達(dá)水平分別上調(diào)約1.14倍和1.2倍。表明RyhB的缺失能夠減弱APEC黏附DF-1的能力，并且使毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平有所降低。根據(jù)以上結(jié)果，推測RyhB對APEC的毒力具有極其重要的調(diào)節(jié)作用。

禽致病性大腸桿菌； 非編碼小RNA；Red同源重組；RyhB；毒力基因

禽大腸桿菌病(avian colibacillosis)是由致病性大腸桿菌(pathogenicEscherichiacoli)引起的一種傳染病，該病存在于世界各地的家禽群體中。臨床表現(xiàn)為氣囊炎、心包炎、肝周炎、腦炎、腹膜炎、臍炎、輸卵管炎等癥狀，給養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展帶來了嚴(yán)重的危害[1]。

非編碼RNA (small non-coding regulatory RNA，sRNA)，又稱小RNA，是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類基因調(diào)節(jié)子，其長度為40～500個(gè)核苷酸，在基因組中被轉(zhuǎn)錄，但是不編碼蛋白質(zhì)[2]。它是致病菌諸多調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵組成部分，致病菌進(jìn)入宿主體內(nèi)后感受到環(huán)境的改變，通過快速調(diào)整自身的毒力基因表達(dá)和生理特征來適應(yīng)變化的環(huán)境，從而利于致病菌在宿主中的侵染和存活，對細(xì)菌致病性的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用[3]。

RyhB是目前己知調(diào)控細(xì)菌靶mRNA數(shù)目最多的sRNA，它作為一種有效的調(diào)節(jié)分子，對細(xì)胞內(nèi)鐵代謝的調(diào)控和對致病菌致病力的調(diào)節(jié)具有重要作用[4-5]。RyhB最初是在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的。隨著研究的深入，在其他細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了許多與大腸桿菌RyhB同源的或者功能類似的小分子RNA。該類小分子RNA對細(xì)菌致病力的調(diào)節(jié)主要通過影響細(xì)菌鐵代謝、生物膜生成、趨化性和耐酸性的方面來實(shí)現(xiàn)的[6-7]?；魜y弧菌和大腸桿菌同源性很高，其Fur和鐵負(fù)調(diào)控RyhB[8-9]，當(dāng)RyhB基因缺失后，小鼠體內(nèi)生物膜的形成和趨化性能力喪失，當(dāng)加入鐵后其能力又恢復(fù)[10-12]。所以RyhB本身不是毒力形成所必須的，而后兩者是毒力決定因子。RyhB可抑制VirB來調(diào)控毒力，VirB是重要的毒力致病基因(ipa、mxi、spa)激活劑。對于寄居在腸道中的弗氏志賀菌，其毒力致病因子的表達(dá)是通過RyhB解除對VirB的抑制，從而有利于細(xì)菌在腸道的感染[13]。這些都表明RyhB的功能與細(xì)菌的毒力有關(guān)，但是RyhB與APEC毒力相關(guān)的靶mRNA，以及對APEC毒力的影響卻還不清楚。

因此，本試驗(yàn)以sRNA(RyhB)為研究對象，通過Red重組系統(tǒng)構(gòu)建RyhB的缺失株，并構(gòu)建了可回復(fù)表達(dá)的回復(fù)株，以此來研究RyhB缺失對禽致病性大腸桿菌的毒力基因表達(dá)以及對細(xì)胞黏附能力的影響，為RyhB對禽致病性大腸桿菌毒力調(diào)控機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與試劑盒

PremixTaq、PrimeSTAR Max Premix(2x)、DNA Marker、DNA膠回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、T4 DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ、Hind Ⅲ)均購自大連寶生物公司；TransStart Top Green qPCR SuperMix、EasyPureTMRNA Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 菌株與質(zhì)粒

選取的同源重組出發(fā)菌株為經(jīng)過分離鑒定的大腸桿菌AE17(從患有敗血癥的禽源分離，經(jīng)傳代培養(yǎng)，血清凝集試驗(yàn)以及一系列生化試驗(yàn)后，鑒定為O2血清型的大腸桿菌)。Red同源重組所用到的質(zhì)粒：pKD46(同源重組的協(xié)助質(zhì)粒，可在阿拉伯糖的誘導(dǎo)下表達(dá)3個(gè)λ噬菌體重組酶——Gam、Beta和Exo，具有溫度敏感性，在溫度高于37 ℃時(shí)會丟失)；pKD3(氯霉素抗性基因PCR擴(kuò)增模板，并且氯霉素抗性基因兩端攜帶可被FLP重組酶識別的FRT位點(diǎn))；pCP20(溫度敏感型，42 ℃可表達(dá)FLP重組酶，用于消除FRT位點(diǎn)間的氯霉素抗性基因)。以上質(zhì)粒均為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所禽病研究室惠贈(zèng)。pSTV28用于構(gòu)建回復(fù)質(zhì)粒，購自大連寶生物公司。

1.3 禽致病性大腸桿菌缺失株△RyhB和回復(fù)株△RyhB-comp的構(gòu)建

1.3.1 PCR引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中已發(fā)布的APEC O1型基因序列設(shè)計(jì)引物，對AE17、RyhB-IN、RyhB-OUT進(jìn)行鑒定。根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)用于red同源重組的引物RyhB-UP、RyhB-Down、PKD3-Cm-lap-RyhB，其中RyhB-lap-cm-UP和RyhB-lap-cm-Down下劃線的序列與質(zhì)粒pKD3-F、pKD3-R上的氯霉素抗性基因的序列互補(bǔ)，而PKD3-Cm-lap-RyhB下劃線序列與RyhB-UP-R、RyhB-Down-F的基因序列互補(bǔ)。用于構(gòu)建回復(fù)株的AE17-RyhB下劃線分別為保護(hù)性堿基和酶切位點(diǎn)(EcoRⅠ、Hind Ⅲ)。引物序列見表1。

表1 用于基因敲除和回復(fù)的引物序列

Table 1 Primers used in the gene deletion and complemented

引物名稱Primer引物序列(5′?3′)Sequence(5′?3′)大小/bpSizeAE17?FGAGCGATCTTGGCTATACC1023AE17?RGTGAAGCTATCTAACAACGGRyhB?IN?FACCCGGCTGGCTAAGTAATAC157RyhB?IN?RCTTTCAAATGCGAGTCAAATGRyhB?OUT?FCATAATCGCCCATCTCTGG1999RyhB?OUT?RCTTCCTTGTTGTTCTCCCGRyhB?UP?FGACAATCTCTCCCAGCTTG568RyhB?lap?cm?UP?RCCAGCCTACAGACCTTTCGTTCTCAATTTPKD3?Cm?lap?RyhB?FACGAAAGGTCTGTAGGCTGGAGCTGCTT1033PKD3?Cm?lap?RyhB?RTTTCAACATCCATATGAATATCCTCCTTAGTTCRyhB?lap?cm?Down?FTATTCATATGGATGTTGAAAGGGACATTT547RyhB?Down?RGGCACTATCTTACTTCACCCGpKD46?FGATACCGTCCGTTCTTTCCTT888pKD46?RTGATGATACCGCTGCCTTACTpCP20?FTTAGTGGTTGTAAAAACACCTGACC409pCP20?RGTTAGCGTTGAAGAATTTAGCCCAE17?RyhB?FGCCGAATTCTACTCGAAGTGGCTGTCCG676AE17?RyhB?RGCCAAGCTTGGCACCTGTAGCGTGTTGTAM13?FCAGGAAACAGCTATGAC676M13?RGTTTTCCCAGTCACGAC

1.3.2 禽致病性大腸桿菌缺失株△RyhB的構(gòu)建

1.3.2.1RyhB同源重組片段構(gòu)建：利用Red 同源重組的方法對AE17中的RyhB進(jìn)行敲除構(gòu)建。首先，用RyhB-UP-F、RyhB-lap-cm-UP-R和RyhB-lap-cm-Down-F、RyhB-Down-R以及PKD3-Cm-lap-RyhB-F、PKD3-Cm-lap-RyhB-R三對引物擴(kuò)增出RyhB上游、下游同源臂及氯霉素抗性片段，進(jìn)行膠回收。然后，運(yùn)用Overlap的方法，將RyhB上下游同源臂及氯霉素抗性片段等摩爾混合，以此混合模板為DNA模板，用RyhB的上游引物(RyhB-UP-F)及下游引物(RyhB-Down-R)擴(kuò)增，擴(kuò)增出來的RyhB上游同源臂-cm-下游同源臂即為用于Red同源重組片段。

1.3.2.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備和電轉(zhuǎn)化：將電轉(zhuǎn)化有pKD46的AE17菌株接種于2 mL LB液體培養(yǎng)基(氨芐青霉素質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1)，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜作為種子液，次日按1∶100比例接種至100 mL LB培養(yǎng)基， 28 ℃振蕩培養(yǎng)至 OD600 nm為0.2～0.3，加入L-阿拉伯糖至終濃度為20～30 mmol·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600 nm為0.5～0.6，使 pKD46充分表達(dá)Exo、Bet和Gam三個(gè)重組酶。50 mL離心管分裝，冰浴20 min，4 ℃ 6 000 r·min-1離心5 min，棄培養(yǎng)基；然后用預(yù)冷的雙蒸水重懸，4 ℃ 6 000 r·min-1離心5 min，重復(fù)洗滌2次；最后用預(yù)冷的10%甘油離心洗滌1次，最后用1/100體積的甘油重懸，濃縮成1 mL的感受態(tài)細(xì)胞，每管分裝100 μL，存放在-70 ℃冰箱待用。

取制備好的100 μL感受態(tài)細(xì)胞與1 μg擴(kuò)增出的RyhB上游同源臂-cm-下游同源臂PCR產(chǎn)物混勻，將混合物加入冰上預(yù)冷的0.2 cm Bio-Rad電擊杯中進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，電擊條件為電壓 2.5 kV，電阻200 Ω，脈沖25 μF，電擊。電擊后迅速加入900 μL 預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)1 h，常溫6 000 r·min-1離心5 min，取200 μL SOC重懸后涂于氯霉素平板 (氯霉素34 μg·mL-1)。37 ℃培養(yǎng)24 h后，篩選陽性菌落，用RyhB-IN-F/RyhB-IN-R、RyhB-OUT-F/ RyhB-OUT-R兩對引物進(jìn)行陽性氯霉素重組子的鑒定，以確定AE17是否敲除了RyhB基因。

1.3.2.3 氯霉素抗性基因的消除：鑒定正確的陽性重組子按上述方法制成感受態(tài)細(xì)胞，將pCP20質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入該感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐和氯霉素雙抗性 LB 平板上，28 ℃過夜培養(yǎng)，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。然后將獲得的陽性轉(zhuǎn)化子接種于無抗性的LB培養(yǎng)基中，42 ℃培養(yǎng)過夜，熱誘導(dǎo) FLP 重組酶表達(dá)，通過重組刪除 FRT位點(diǎn)間的序列，只保留一個(gè) FRT位點(diǎn)，用RyhB-IN-F/RyhB-IN-R、RyhB-OUT-F/ RyhB-OUT-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.3.3 禽致病性大腸桿菌回復(fù)株△RyhB-comp的構(gòu)建

1.3.3.1RyhB基因擴(kuò)增：根據(jù)已發(fā)布的APEC O1型基因序列設(shè)計(jì)AE17-RyhB-F/AE17-RyhB-R引物，用PCR擴(kuò)增出RyhB完整片段，膠回收目的片段待用。

1.3.3.2 RyhB-pSTV28回復(fù)質(zhì)粒的構(gòu)建：將1.3.3.1所得RyhB目的片段和pSTV28載體分別用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，然后用T4連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，氯霉素抗性平板篩選陽性克隆。

1.3.3.3 回復(fù)質(zhì)粒的鑒定：挑單克隆接種含CM抗性的LB培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)，采用菌液PCR的方法，以檢測引物m13-F/m13-R擴(kuò)增，電泳鑒定，以確定獲得回復(fù)質(zhì)粒pSTV28-RyhB。

1.3.3.4 回復(fù)株的構(gòu)建：將回復(fù)質(zhì)粒pSTV28-RyhB電擊導(dǎo)入△RyhB，經(jīng)CM抗性篩選獲得回復(fù)株△RyhB-comp，用RyhB-OUT-F/RyhB-OUT-R和m13-F/m13-R兩對引物進(jìn)行鑒定。

1.4 qRT-PCR檢測缺失株和回復(fù)株毒力基因轉(zhuǎn)錄水平的變化

1.4.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中已發(fā)布的內(nèi)參基因dnaE，同時(shí)選取禽致病性大腸桿菌毒力基因bcfA、fyuA、tsh、iss、luxS、fimC、ompA、ibeA，用 Primer(Version 5.0)軟件分析并設(shè)計(jì)特異性引物。引物序列見表2。

1.4.2 細(xì)菌總RNA的提取和cDNA的合成 挑取禽致病性大腸桿菌AE17、△RyhB和△RyhB-comp的單菌落，于液體培養(yǎng)基37 ℃過夜培養(yǎng)；第2天轉(zhuǎn)接于相應(yīng)的LB培養(yǎng)基或氯霉素抗性LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期，取適量的菌液，4 ℃、12 000 g離心2 min，收集菌液，徹底去除所有培養(yǎng)基上清，用含有溶菌酶的100 μL TE緩沖液(1 mg lysozyme溶于100 μL TE中)徹底重懸菌體。參照EasyPureTMRNA Kit說明書提取三組細(xì)菌的總RNA。核酸蛋白濃度測定儀檢測RNA濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。釆用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser消除提取產(chǎn)物中的基因組DNA并對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄?；蚪MDNA去除反應(yīng)體系20 μL：5×gDNA Eraser Buffer 4.0 μL，gDNA Eraser2.0 μL，Total RNA 1.0 μg，RNase-free ddH2O補(bǔ)至20 μL。42 ℃水浴2 min后迅速置于冰上；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系40 μL：PrimerScript RT Enzyme MIX 2.0 μL，RTprimer MIX 2.0 μL，5×PrimerScript Buffer2 8.0 μL，RNase-free ddH2O 8.0 μL，上一步除去DNA的總RNA 20.0 μL。37 ℃水浴 15 min后，85 ℃水浴5 s。將合成的cDNA保存于-20 ℃。1.4.3 qRT- PCR反應(yīng) 采用TransStart Top Green qPCR SuperMix熒光定量試劑盒，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對APEC毒力基因的表達(dá)進(jìn)行相對定量的檢測。將各樣品的cDNA 10倍系列稀釋，反應(yīng)體系20 μL：Forward Primer(10 μmol·L-1)0.4 μL，Reverse Primer(10 μmol·L-1)0.4 μL，2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10.0 μL，Passive Reference Dye(50×)0.4 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 7.8 μL。擴(kuò)增條件：50 ℃2 min，95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s；60 ℃熒光信號采集1 min，循環(huán)次數(shù)40次，測試樣品重復(fù)三管；熔解曲線分析并鑒定引物特異性：95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。數(shù)據(jù)采用2-△△CT法計(jì)算毒力基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。

1.5 AE17、△RyhB、△RyhB-comp對DF-1細(xì)胞的黏附試驗(yàn)

1.5.1 細(xì)菌的培養(yǎng)和處理 將菌株AE17、△RyhB和△RyhB-comp接種于相應(yīng)的LB培養(yǎng)基或氯霉素抗性LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，離心收集菌體并用無菌PBS洗滌3～4次，最后用無抗生素DMEM營養(yǎng)液重懸細(xì)菌待用。

表2 用于熒光定量的引物序列

Table 2 Primers used in the Real time PCR

目標(biāo)基因Gene引物名稱Primer引物序列(5′—3′)Sequence(5′—3′)大小/bpSizednaEdnaE?FdnaE?RGATTGAGCGTTATGTCGGAGGCGCCCCGCAGCCGTGAT80luxSluxS?FluxS?RACGCCATTACCGTTAAGATGAGTGATGCCAGAAAGAGGGA81Tshtsh?Ftsh?RGCACGAACTGGGAAGTATGGAGGCATAGAAACCACCACCCC118ibeAibeA?FibeA?RTTGTTTTGGCGGAATGATGCATTGATTTTGCCGTTTCTTCT118Ississ?Fiss?RCCGACAGCAGTAACACCAAAGGTTCTGCACCGCCAACAAATT105ompAompa?Fompa?RTCCAGAGCAGCCTGACCTTCGCTGAGCCTGGGTGTTTCCT152Fimcfimc?Ffimc?RGCCGATGGTGTAAAGGATGGAACTTTCCCGATCCTGTGGC127fyuAfyuA?FfyuA?RTTGGCGACCAGGGTAAGAGCAGACCCGCAGTAGGCACGAT145bcfAbcfA?FbcfA?RTGACGCTGCCTGTTCTGTTTGCAGTCTTCCAGTTTGATGGTG136

1.5.2 DF-1細(xì)胞的培養(yǎng)和處理 將液氮中凍存的DF-1細(xì)胞取出在37 ℃水浴中溶解1～2 min，使其復(fù)溫；迅速加入含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM營養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的條件下在細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行復(fù)蘇傳代。當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好并穩(wěn)定時(shí)，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200 μL約含105個(gè)細(xì)胞懸液培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞長滿孔底時(shí)，吸去培養(yǎng)基并用無菌PBS洗滌3～4次備用。

1.5.3 細(xì)胞黏附試驗(yàn) 將處理好的三組細(xì)菌以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=200分別加入到DF-1細(xì)胞中，對照組加入等體積的無抗生素DMEM，每個(gè)菌株重復(fù)3孔。400 r·min-1低速離心5 min，使細(xì)菌沉降到孔底與細(xì)胞充分結(jié)合。37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，無菌PBS洗5次，然后每孔加入200 μL 0.1% Triton X-100，室溫下作用10 min，用于裂解細(xì)胞，取細(xì)胞液倍比稀釋，用掛板計(jì)數(shù)法37 ℃培養(yǎng)過夜后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 禽致病性大腸桿菌缺失株△RyhB的鑒定

將含氯霉素抗性基因的△RyhB-cat PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)入含質(zhì)粒pKD46的AE17中，通過氯霉素抗性LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆，挑取陽性菌接種LB液體培養(yǎng)基，運(yùn)用PCR檢測的方法鑒定缺失株△RyhB-cat是否構(gòu)建成功。第一次重組后，以RyhB-IN-F/RyhB-IN-R為引物， AE17未擴(kuò)增出目的片段；而以 RyhB-OUT-F/RyhB-OUT-R為引物，AE17擴(kuò)增出2 875 bp大小的目的片段。將質(zhì)粒pCP20導(dǎo)入一次重組菌，于28 ℃培養(yǎng)并篩選陽性克隆，將鑒定正確的陽性克隆接種于LB液體培養(yǎng)基，42 ℃過夜培養(yǎng)，消除質(zhì)粒pCP20。運(yùn)用PCR檢測的方法鑒定缺失株△RyhB是否構(gòu)建成功，結(jié)果如圖1，其中以RyhB-IN-F/RyhB-IN-R為引物，第二次重組后，AE17未擴(kuò)增出目的片段；而以 RyhB-OUT-F/RyhB-OUT-R為引物，第二次重組后，AE17擴(kuò)增出1 842 bp大小的目的片段。

M.10 000 bp DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.RyhB-IN-F/RyhB-IN-R PCR產(chǎn)物(157 bp)；2.RyhB-OUT-F/RyhB-OUT-R PCR產(chǎn)物(1 999 bp)；3.RyhB-IN-F/RyhB-IN-R，第二次重組產(chǎn)物；4.RyhB-OUT-F/RyhB-OUT-R，第二次重組PCR產(chǎn)物(1 842 bp)M.10 000 bp DNA marker；1.RyhB-IN-F/RyhB-IN-R PCR amplification(157 bp)；2.RyhB-OUT-F/ RyhB-OUT-R PCR amplification (1 999 bp)；3.RyhB-IN-F/RyhB-IN-R，the PCR amplification of second crossing over；4.RyhB-OUT-F/RyhB-OUT-R，the PCR amplification of second crossing over (1 842 bp) 圖1 二次重組菌AE17△RyhB的PCR鑒定Fig.1 Identification of AE17△RyhB mutant by PCR

2.2 禽致病性大腸桿菌回復(fù)株△RyhB-comp的鑒定

將構(gòu)建的回復(fù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，將鑒定正確的回復(fù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入相應(yīng)的缺失株，挑取陽性轉(zhuǎn)化菌株即為回復(fù)菌株。PCR檢測方法鑒定回復(fù)株△RyhB-comp構(gòu)建成功，如圖2。

2.3RyhB調(diào)控毒力基因的表達(dá)量變化

內(nèi)參基因和毒力基因的熔解曲線分析結(jié)果均具有良好的特異性，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率均為95% 以上，可以運(yùn)用2-△△CT法對毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。

M.10 000 bp DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.RyhB-OUT-F/ RyhB-OUT-R PCR產(chǎn)物(1 842 bp)；2.m13-F/m13-R PCR產(chǎn)物(676 bp) M.10 000 bp DNA marker；1.RyhB-OUT-F/RyhB-OUT-R PCR amplification(1 842 bp)；2.m13-F/m13-R PCR amplification (676 bp)圖2 回復(fù)株△RyhB-comp的PCR鑒定Fig.2 Identification of △RyhB-comp by PCR

對AE17、△RyhB和△RyhB-comp毒力基因的mRNA轉(zhuǎn)錄分析顯示，△RyhB的bcfA、fyuA、tsh、luxS、fimC、ompA毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平均極顯著下降(P<0.01)，其mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別約為AE17的19%、52%、20%、14%、28%、52%；△RyhB的iss、ibeA毒力基因表達(dá)水平上調(diào)，分別約為AE17的1.14倍和1.2倍?！鱎yhB-comp的bcfA、fyuA、tsh、luxS毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平相比缺失株，其回復(fù)力和缺失株無明顯差異(P>0.05)；△RyhB-comp的iss、ibeA毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平相比缺失株，其回復(fù)力極顯著下降(P<0.01)，分別為62%、64%；△RyhB-comp的fimC和ompA毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平相比缺失株，其回復(fù)力極顯著上升(P<0.01)，分別為69%、48%(圖3)。

2.4 DF-1細(xì)胞黏附試驗(yàn)

對DF-1細(xì)胞的黏附試驗(yàn)結(jié)果顯示，AE17菌株對DF-1的黏附能力為24×105CFU·孔-1；△RyhB相比野生株，其黏附能力極顯著減弱(P<0.01)，為13×105CFU·孔-1；△RyhB-comp相比缺失株，其黏附能力顯著恢復(fù)(P<0.05)，為20×105CFU·孔-1(圖4)。

3 討 論

本試驗(yàn)基于λRed重組系統(tǒng)，由PCR反應(yīng)介導(dǎo)的抗性基因片段與目的基因發(fā)生同源重組，用抗性基因替換染色體中的目的基因，該方法不需要構(gòu)建打靶質(zhì)粒，縮短了試驗(yàn)的周期。因其方法具有試驗(yàn)周期短、重組效率高、操作方便以及可以在任何位置進(jìn)行點(diǎn)突變、缺失、插入等優(yōu)點(diǎn)，所以逐漸成為探索基因功能的有效手段[14]。sRNA的長度一般為50～200 bp，一步敲除法往往很難成功，本試驗(yàn)中RyhB是177 bp大小的片段，使用一步法敲除重組效率低，未能成功，但使用二步敲除法，通過構(gòu)建上下游同源臂與抗性基因片段連接，同源重組效率增強(qiáng)，成功構(gòu)建了RyhB的敲除株，為研究sRNA功能提供了有力的工具。

圖3 AE17、△RyhB和△RyhB-comp各毒力基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平Fig.3 The virulence genes mRNA levels of AE17，△RyhB和△RyhB-comp strains

圖4 AE17、△RyhB和△RyhB-comp對DF-1細(xì)胞的黏附試驗(yàn)Fig.4 DF-1 cells adherence assays of AE17、△RyhB和△RyhB-comp strains

毒力因子是指通過吸附在宿主細(xì)胞上，進(jìn)而破壞宿主細(xì)胞代謝或阻撓宿主免疫反應(yīng)來直接影響宿主，從而促進(jìn)細(xì)菌本身生存、生長和傳播的因子。本試驗(yàn)中選取的毒力因子包括密度感應(yīng)系統(tǒng)、鐵攝取調(diào)控系統(tǒng)、外膜蛋白、侵襲素、黏附素以及菌毛亞單位等，這些毒力因子都是APEC通過在宿主內(nèi)黏附、侵襲、抗吞噬以及宿主細(xì)胞毒性來完成其致病過程所必需的。而研究表明，病原菌 sRNA在調(diào)控細(xì)菌代謝尤其是毒力基因的表達(dá)上具有十分重要的作用[15]。因此通過構(gòu)建缺失株△RyhB和回復(fù)株△RyhB-comp，開展RyhB在APEC中的毒力相關(guān)基因的表達(dá)和細(xì)胞的黏附能力等方面的研究，其目的在于揭示RyhB對APEC毒力的影響，為防控疾病和開發(fā)sRNA核酸藥物提供新的靶點(diǎn)。

Real-time PCR結(jié)果顯示，△RyhB的毒力基因bcfA、fyuA、tsh、luxS、fimC、ompA表達(dá)水平均下調(diào)，推測RyhB可能通過調(diào)控外膜蛋白、黏附素相關(guān)因子、與攝鐵相關(guān)因子、菌毛及其它未發(fā)現(xiàn)的病原相關(guān)基因的表達(dá)來影響細(xì)菌的毒力；DF-1細(xì)胞黏附試驗(yàn)結(jié)果表明△RyhB的黏附能力顯著低于AE17，而△RyhB-comp的黏附能力相比較△RyhB有所回復(fù)。黏附素是存在于細(xì)菌表面的一些特殊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，它通過與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合，避免被宿主清除體外，是病原菌重要的毒力因子之一。它與致病性密切相關(guān)。研究表明ompA和bcfA、fimC基因編碼相關(guān)黏附因子，對細(xì)菌黏附宿主細(xì)胞的能力有一定的影響[16]，推測ompA、bcfA、fimC基因轉(zhuǎn)錄水平的下降可能會導(dǎo)致APEC的黏附能力下降，與試驗(yàn)結(jié)果相一致。

綜合試驗(yàn)結(jié)果，RyhB的缺失對APEC毒力的降低是顯著的，提示低致病性、無抗性的RyhB缺失株是否可以作為新型疫苗，來防控APEC的感染還有待進(jìn)一步的研究和探討。同時(shí)，RyhB對細(xì)菌毒力的調(diào)控往往不是單方面的，它可能是多種毒力基因、調(diào)控系統(tǒng)同時(shí)作用；MicA在基因組中的位置與群體感應(yīng)信號分子AL-2合成酶luxS毗鄰，它是生物膜形成過程中十分重要的sRNA分子，其多種靶基因如phoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)和外膜蛋白o(hù)mpA等均與生物膜的形成有關(guān)[17]。揭示了RyhB對APEC致病性調(diào)控的過程中，可能涉及了多個(gè)毒力基因，多個(gè)調(diào)控系統(tǒng)的共同作用，其與phoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)是否存在著必然的關(guān)系，共同調(diào)控APEC的致病性以及RyhB在致病菌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中以何種機(jī)制觸動(dòng)其發(fā)揮作用，將是我們以后需要研究解決的問題。

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建禽致病性大腸桿菌的RyhB缺失株和回復(fù)表達(dá)株，RyhB的缺失能顯著地降低禽致病性大腸桿菌毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平和對DF-1細(xì)胞的黏附能力，為探明RyhB對禽致病性大腸桿菌毒力調(diào)控機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

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(編輯 白永平)

Analysis of the Regulation of Small Non-coding RNA (RyhB) on Avian PathogenicEscherichiacoliVirulence-related Genes

YIN Lei，QI Ke-zong*，TU Jian，ZHOU Xiu-hong，LIU Hong-mei，WANG Man，ZHANG Yan-na

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036，China)

Taking small RNA(RyhB)as the object of study，the experiment explored the regulation ofRyhBon avian pathogenicEscherichiacoli(APEC) virulence-related genes.The Red homologous recombination method was used to construct theRyhBgene deletion strain (△RyhB) and the complemented strain (△RyhB-comp) by transforming the fusion plasmid pSTV28-RyhB into △RyhB.Viable bacteria counting method was used to evaluate the effects of AE17，△RyhB and △RyhB-comp on the capability of APEC to adhere and invade DF-1 cell.Their effects on the mRNA levels of the eight virulence genes were analyzed by Real-time PCR.The results showed that APEC strains △RyhB and △RyhB-comp were constructed successfully.The adherence of △RyhB was decreased by 62.5% compared to AE17，and that of △RyhB-comp was increased about 1.4 folds compared to △RyhB.Real-time PCR revealed that the transcription ofbcfA,fyuA，tsh，luxS，fimC，ompAgenes of △RyhB were decreased by 19%，52%，20%，14%，28% and 52%，respectively；while theissandibeAgenes were increased about 1.14 folds and 1.2 folds respectively.It showed that the deletion of RyhB can reduce the adhesive power of APEC to DF-1 cells and decrease the transcription of virulence genes.Our study demonstrates thatRyhBplays a very important role in regulating the virulence of APEC.

avian pathogenicEscherichiacoli；small non-coding RNA；Red recombination；RyhB；the virulence genes

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.017

2014-11-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372402)

尹 磊(1989-)，男，安徽巢湖人，碩士，主要從事動(dòng)物病理學(xué)研究，E-mail：ylshouhu1989@163.com

*通信作者：祁克宗，教授，E-mail：qkz@ahau.edu.cn

S852.612

A

0366-6964(2015)08-1409-08