崔曉鋼，楊少華，謝 巖，張勝利，張 勤，孫東曉

(中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，畜禽育種國家工程實驗室，北京 100193)

應(yīng)用生物信息學預測牛新microRNA及驗證

崔曉鋼，楊少華，謝 巖，張勝利，張 勤，孫東曉*

(中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，畜禽育種國家工程實驗室，北京 100193)

本研究旨在通過比較基因組學和結(jié)構(gòu)序列分析方法預測?；蚪M中的新miRNAs并進行試驗驗證。根據(jù)miRNA 分子序列具有一定保守性，將人、小鼠、綿羊、豬和狗5種哺乳動物已知的miRNA 分子與NCBI中牛的全基因組序列(UMD3.1)對比，獲得牛miRNAs；隨機選取部分預測的miRNAs進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證。結(jié)果，基于物種間序列同源比對共計預測到44條新的牛miRNAs，選取其中4條miRNAs，通過qRT-PCR方法，發(fā)現(xiàn)他們在泌乳期中國荷斯坦牛乳腺、心、子宮和肝組織中均有表達。結(jié)果表明，基于比較基因組學和生物信息學預測新的miRNA 分子可行，為奶?；虮磉_調(diào)控及其性狀形成機制研究提供了前期基礎(chǔ)。

牛；miRNA；預測；生物信息學

microRNAs(miRNAs)是一類大約18～24 nt左右的非編碼RNA小分子，通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)完全或不完全互補配對從而抑制靶基因的翻譯過程，在多種生物學過程起重要調(diào)控作用[1]。大多數(shù)miRNAs位于基因間，但也有一些miRNAs位于內(nèi)含子?；蜷g的miRNAs首先由細胞內(nèi)RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ Drosha加工形成70～80 nt具有發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的pre-miRNA(前體miRNA)[1-2]；隨后pre-miRNA被exportin 5轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)， 而后被RNA聚合酶Ⅲ Dicer識別剪切為22 nt左右的成熟miRNA；成熟的miRNA與一些特別的蛋白結(jié)合形成沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC通過與靶mRNA的3′UTR結(jié)合發(fā)揮抑制其翻譯作用[2-3]。

目前，在動物中已經(jīng)有超過5 000 條的miRNAs分子被確定并被收錄到公開的miRNA 數(shù)據(jù)庫中，即miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/)。該數(shù)據(jù)庫中已有798條牛的miRNAs前體被收錄。最初發(fā)現(xiàn)的牛miRNA為lin-4和let-7，通過基因篩選獲得[3]，由于效率低下，目前已不采用此方法。之后，人們通過直接克隆獲得miRNAs：首先分離純化得到小分子量RNA，然后分別在其5′和3′端連接RNA接頭，根據(jù)接頭序列設(shè)計逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA 單鏈并進行PCR 擴增，挑選單克隆測序[4]，其缺點是很難克隆到表達量很低的miRNAs，一些大RNA分子降解的碎片同樣有可能被分離克隆[5-6]。陳海漩等[7]2008年通過分子克隆從牛腦和肝組織中得到了13條新的miRNAs。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在不同物種間具有高度的序列保守性[8]。因此，基于不同物種間已知miRNAs這種保守性，可以應(yīng)用生物信息學預測新的miRNAs。這種方法具有速度快和通量大的特點，能夠獲得一些表達量低且無法克隆到的miRNAs。但是，通過這種方法獲得的候選miRNAs必須通過后續(xù)試驗驗證，如分子克隆、Nothern雜交和qRT-PCR。陳海璇等[7-8]通過生物信息學方法獲得了147條牛的候選miRNAs和11條山羊的候選miRNAs；穆松等[9]通過生物信息學方法得到了17條牛的候選miRNAs。

近幾年，隨著miRBase數(shù)據(jù)庫的不斷更新，已知miRNA數(shù)量大幅度增長。miRNA預測的生物信息學方法主要有比較基因組方法、結(jié)構(gòu)序列分析方法和機器學習方法。趙東宇等[10]根據(jù)預測效果與理論基礎(chǔ)綜合分析以上3類方法并進行比較發(fā)現(xiàn)預測效果準確性依次為65%、80%和90%。但是，機器學習方法需要一定的計算機基礎(chǔ)。鑒于此，本研究通過比較基因組學和結(jié)構(gòu)序列分析方法預測牛的新miRNA 分子，并通過實時熒光定量PCR技術(shù)進行驗證，為研究奶牛重要性狀基因表達調(diào)控及其性狀形成機制提供有價值的前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 miRNAs和ESTs序列的獲得

人、小鼠、綿羊、豬、狗和牛6個物種的miRNA序列來自miRBase數(shù)據(jù)庫(http://miRNA.sanger.ac.uk；版本：20.0)。牛的EST和mRNA序列來自美國國家生物技術(shù)信息中心的GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.2 miRNA分子的預測

miRNA預測步驟：將下載得到的miRNA 分子序列與NCBI中牛的全基因組序列(UMD3.1)進行在線Blast比對，尋找存在0～3 個堿基差異的同源序列并刪除重復和表達蛋白的序列；利用mFold 3.1軟件，選取包含miRNA 序列的100 nt 左右的片段進行預測二級結(jié)構(gòu)，獲得可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列并與miRNA 前體數(shù)據(jù)庫對比，確定是否為可能的新miRNA 分子或miRNA 基因。 按照下列原則[11-12]預測新的miRNAs分子：①與成熟的miRNA只能存在0～3個堿基差異；②前體能折疊成發(fā)夾的二級結(jié)構(gòu)；③發(fā)夾結(jié)構(gòu)必須有較小的自由能；④A+U含量在30%～70%；⑤與其互補序列的差異不能多于6個；⑥不能存在環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

1.3 靶基因預測

采用在線軟件TargetScan 6.2(http://www.targetscan.org/)和PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/)對本研究得到的miRNAs預測靶基因，TargetScan中有牛mRNA：miRNA互作關(guān)系，直接應(yīng)用該互作關(guān)系進行預測；Pictar沒有反芻動物數(shù)據(jù)，因此，本研究基于人的mRNA：miRNA互作關(guān)系進行預測，將預測的人靶基因與牛該基因3′UTR進行比對，若預測靶點完全匹配即確定此基因為牛miRNA的靶基因；最后將兩個軟件的預測結(jié)果進行交集。

對上述預測得到的靶基因，利用KOBAS2.0在線軟件和KEGG pathday公共數(shù)據(jù)庫進行通路和GO分析。

1.4 實時熒光定量PCR驗證

采集泌乳期中國荷斯坦牛乳腺、心、子宮和肝4種組織樣品，快速放入液氮保存。使用TRIzol試劑盒(Invitrogen)分別提取乳腺、心、子宮和肝組織樣品總RNA。隨機選取4條預測得到的新miRNAs，采用莖環(huán)引物實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法驗證其成熟miRNA序列是否存在，即利用其莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特異反轉(zhuǎn)錄引物進行cDNA合成；反轉(zhuǎn)錄試劑為Taqman?Transcription Kit 200 Reactions反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(ABI)，miRNA特異引物由北京六合華大基因科技有限公司合成；以cDNA作為模板，用miRNA的特異引物和通用下游引物(表1)進行qRT-PCR反應(yīng)，以U6 snoRNA(廣東銳博生物)作為內(nèi)參基因；miRNA qRT-PCR擴增體系20 μL：SYBR Green buffer 9 μL、ddH2O 7.4 μL、上下游引物各0.8 μL(200 μmoL·L-1)、cDNA2 μL；反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min，45個循環(huán)(95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s)，72 ℃ 6 min。

采用2-ΔΔCt法對3個重復樣本進行相對miRNA表達分析。利用SAS v8.02軟件對不同組織的miRNA相對表達量進行顯著性差異分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 新miRNAs分子篩選

本研究從miRBase數(shù)據(jù)庫中下載了人、小鼠、綿羊、豬和狗5種哺乳動物共3 767條miRNAs分子；在NCBI上與牛全基因組序列(UMD3.1)進行Blast，得到具有0～6個堿基差異同源性序列共2 606條(表2)，其中僅存在0～3 個堿基差異且不表達蛋白質(zhì)的序列共796條；下載上述796條序列，選取包含有miRNA 序列的100 nt 左右的片段，通過mFold在線軟件http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form預測得到可能的發(fā)夾結(jié)構(gòu)1 481個；按照材料與方法1.2預測原則篩選發(fā)夾結(jié)構(gòu)，得到44條牛新miRNAs 分子，各項參數(shù)見表3。

圖1展示了上述44條牛新miRNAs分子的二級結(jié)構(gòu)，其成熟序列均在發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的一條臂上，且與其互補序列的差異小于6個堿基，自由能為-229.80～-69.90 kJ·mol-1(表3)，均符合miRNA預測原則，可能為牛的新miRNAs分子。

表1 4個牛新miRNAs qRT-PCR 所用引物

Table 1 Primers for qRT-PCR validation of 4 predicted bovine miRNAs

miRNA名稱Name莖環(huán)特異引物Stem?LoopRTprimer引物Primer退火溫度/℃Tmssc?miR?9?2CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC?AATTCAGTTGAGF：TGGGTTGGGCTTCTTTGGTTATCTR：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC60hsa?miR?7CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG?CAATTCAGTTGAGF：GGGTCTGGGTGGAAGACTAGTR：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC60mmu?miR?467cCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCG?GCAATTCAGTTGAGF：GGTCGGGTAAGTGCGTGCATR：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC60cfa?miR?143CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCG?GCAATTCAGTTGAGF：GGTTCTGGGTGAGAGAAGCACR：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC60U6ForwardssD0904071006(引物編號)60U6ReversessD0904071007(引物編號)60

表2 同源比對篩選miRNA結(jié)果

Table 2 The results of miRNA Blast

哺乳動物Mammal用于比對的miRNA數(shù)目No．ofmiRNAsforBlast具有同源性的牛序列數(shù)目No．ofbovinehomologoussequences0～3個堿基差異且不表達蛋白的序列數(shù)目No．ofsequenceswith0?3mismatchesandnon?codingprotein可能的發(fā)夾結(jié)構(gòu)Hairpincandidates可能的新miRNAsPotentialnovelmiRNAs人Human18721611505102126小鼠Mouse11864921512427綿羊Sheep1059915171豬Pig28019565947狗Dog324209601073總計Total37672606796148144

表3 預測到的新miRNAs

Table 3 The results of predicted novel miRNAs

新miRNAsNovelmiRNAs折疊自由能/(kJ·mol-1)Foldingfreeenergy成熟miRNA序列MaturemiRNAsequence成熟miRNA長度/ntThelengthofmaturemiRNAhsa?let?7e-143．57UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU22hsa?miR?7-153．20UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU23hsa?miR?9-141．48UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA23hsa?miR?24-141．48UGCCUACUGAGCUGAUAUCAGU22hsa?miR?24-116．79UGCCUACUGAGCUGAUAUCAGU22hsa?miR?29b?2-128．51CUGGUUUCACAUGGUGGCUUAG22hsa?miR?29b?2-128．50CUGGUUUCACAUGGUGGCUUAG22hsa?miR?147-125．99GUGUGUGGAAAUGCUUCUGC20hsa?miR?191-187．11CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG23hsa?miR?345-83．30GCUGACUCCUAGUCCAGGGCUC22hsa?miR?425-157．39AAUGACACGAUCACUCCCGUUGA23hsa?miR?450a-140．64UUUUGCGAUGUUCCUAAUAU22hsa?miR?486?3p-184．18CGGGGCAGCUCAGUACAGGAU21hsa?miR?486?5p-184．60UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG22hsa?miR?568-100．88AUGUAUAAAUGUAUACACAC20hsa?miR?671?3p-178．74UCCGGUUCUCAGGGCUCCACC21hsa?miR?671?5p-229．80AGGAAGCCCUGGAGGGGCUGGAG23hsa?miR?2054-77．02CUGUAAUAUAAAUUUAAUUUAUU23hsa?miR?4292-157．39CCCCUGGGCCGGCCUUGG18hsa?miR?4294-150．27GGGAGUCUACAGCAGGG18hsa?miR?4479-133．11CGCGCGGCCGUGCUCGGAGCAG22hsa?miR?4516-128．51GGGAGAAGGGUCGGGGC17hsa?miR?4674-69．90CUGGGCUCGGGACGCGCGGCU21hsa?miR?4680?5p-88．32AGAACUCUUGCAGUCUUAGAUGU23hsa?miR?4716?3p-164．50AAGGGGGAAGGAAACAUGGAGA22hsa?miR?4753?3p-92．09UUCUCUUUCUUUAGCCUUGUGU22mmu?miR?467c-137．30UAAGUGCGUGCAUGUAUAUGUG22mmu?miR?467e-103．81AUAAGUGUGAGCAUGUAUAUGU22mmu?miR?467g-106．74UAUACAUACACACACAUAUAU22mmu?miR?671?5p-229．80AGGAAGCCCUGGAGGGGCUGGAG23mmu?miR?1898-113．02AGGUCAAGGUUCACAGGGGAUC22mmu?miR?3107-184．60UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG22mmu?miR?3473-117．20UGGAGAGAUGGCUCAGCA18oar?miR?370?5p-128．92CAGGUCACGUCUCUGCAGUUAC22ssc?let?7e-143．57UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU22ssc?miR?9?1-141．90UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA23ssc?miR?9?1-158．23UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA23ssc?miR?9?2-158．23UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA23ssc?miR?374b?5p-146．50AUAUAAUACAACCUGCUAAGUG21ssc?miR?421-138．13CCUCAUUAAAUGUUUGUUGAAUGA24ssc?miR?421-140．64CCUCAUUAAAUGUUUGUUGAAUGA24cfa?miR?9-158．23UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA23cfa?miR?143-135．20UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC21cfa?let?7c-143．57UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU22

圖1 候選miRNAs前體分子二級結(jié)構(gòu)預測Fig.1 Prediction of secondary structure of pre-miRNA molecule

2.2 qRT-PCR驗證

從44個候選miRNAs分子中隨機選取hsa-miR-7、 ssc-miR-9-2、 mmu-miR-467c和cfa-miR-143進行qRT-PCR驗證，結(jié)果如圖2所示，4個miRNAs分子在泌乳期中國荷斯坦牛乳腺、心、子宮和肝中均有表達，證實為真實的牛miRNAs。如圖2所示，差異顯著檢驗結(jié)果表明，cfa-miR-143在心組織的mRNA表達量與其他3個組織間差異顯著(P<0.05)，其他3個miRNAs在這4個組織中的mRNA表達量差異不顯著(P>0.05)。

A.ssc-miR-9-2在牛4個組織表達情況；B.hsa-miR-7在牛4個組織表達情況；C.mmu-miR-467c在牛4個組織表達情況；D.cfa-miR-143在牛4個組織表達情況。*.P<0.05A.The expression of ssc-miR-9-2 in 4 tissues of lactating Chinese Holstein cows；B.The expression of has-miR-7 in 4 tissues of lactating Chinese Holstein cows；C.The expression of mmu-miR-467c in4 tissues of lactating Chinese Holstein cows；D.The expression of cfa-miR-143 in 4 tissues of lactating Chinese Holstein cows.*.P<0.05圖2 4個牛新miRNAs qRT-PCR驗證結(jié)果Fig.2 The results of qRT-PCR validation of 4 predicted bovine miRNAs

2.3 靶基因預測

采用TargetScan和PicTar軟件分別對44個miRNAs進行了靶基因預測，分別得到9 526和5 658個靶基因，二者共有的靶基因為4 524個。

利用KOBAS2.0在線軟件和KEGG 通路對4 524個靶基因進行通路和GO分析，顯著富集的信號通路包括： MAPK信號通路、Wnt 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、TGF-beta 信號通路、ErbB 信號通路(P<0.05為顯著富集的信號通路)等；顯著富集的GO條目包括：序列特異性DNA結(jié)合、細胞發(fā)育、解剖結(jié)構(gòu)形態(tài)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域、核酸結(jié)合調(diào)節(jié)區(qū)域(P<0.05為顯著富集的GO條目)等。

3 討 論

由于miRNA序列很短，在基因組中找到匹配序列的概率較大，僅僅搜索相似序列將會產(chǎn)生大量的假陽性結(jié)果，如果結(jié)合這些相似序列的側(cè)翼序列可能形成二級結(jié)構(gòu)來進一步篩選，能大大減少假陽性率[13]。由表3可以看出，本研究得到的發(fā)夾結(jié)構(gòu)有很多，因此我們在對發(fā)夾結(jié)構(gòu)篩選中要求嚴格符合上述預測原則以減少假陽性率。本研究通過生物信息學預測到44條牛新的候選miRNAs。在對這44 條miRNAs的前體分子進行分析的時候，我們發(fā)現(xiàn)兩條序列相似的miRNAs分子可由不同的前體分子產(chǎn)生,如表4中的hsa-miR-24、hsa-miR-29b-2、ssc-miR-421、ssc-miR-9-1，其形成的兩條發(fā)夾結(jié)構(gòu)均符合miRNA的預測原則，而且這8條發(fā)夾結(jié)構(gòu)自由能較小，這些miRNAs各項指標均符合預測標準，可以推測它們同樣是存在的。這些miRNAs分子前體處于基因序列的不同位置，具有某些miRNA基因成簇排列的特性[14-15]。P.Landgraf等[16]發(fā)現(xiàn)，有的前體分子能同時產(chǎn)生多條miRNAs分子且符合miRNA篩選原則，說明同一前體分子在特定條件下通過特定的剪切方式產(chǎn)生不同miRNAs分子，本研究由于嚴格遵守篩選原則，并未發(fā)現(xiàn)由同一前體形成的多條miRNAs分子。

在相同的條件下，qRT-PCR結(jié)果顯示，4個新預測miRNAs分子在奶牛乳腺、心、子宮和肝中均有表達，但具有組織特異表達的特點。本研究通過對子宮中不同miRNAs表達量的分析，發(fā)現(xiàn)miRNA表達量不同，M.Castoldi 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在同一組織中，不同的miRNA的表達量完全不同，與本研究結(jié)果一致。

本研究對3 767條miRNAs分子進行比對，最后只獲得44條候選miRNAs分子，與芯片技術(shù)相比得率較低。芯片技術(shù)通過雜交可以發(fā)現(xiàn)大量的miRNAs分子，但是無法直接得到miRNA的前體序列、基因位置以及可能的靶基因等信息。通過生物信息學，能夠彌補芯片技術(shù)的不足，還可預測其靶基因，成本低。該研究證實，通過miRNA的保守性和物種之間基因組的同源性，用生物信息學篩選和尋找新的miRNA候選序列的方法能夠在較短時間里尋找出一定量的新miRNAs分子，速度快、通量大，為我們以后尋找更多的miRNAs提供了新思路、新途徑。

隨著各物種中miRNAs的大量分離和鑒定，miRNAs功能鑒定成為了一項重要課題，而靶基因預測成為了這項課題的重要環(huán)節(jié)。自2003年起，各種靶基因預測軟件被相繼開發(fā)。盡管有多種靶基因預測軟件的輔助，但miRNA靶基因鑒定仍然存在一定困難。這些軟件各有特點，預測結(jié)果各不相同，而且一個miRNA會預測到上百甚至上千個靶基因[18-19]。有研究表明，TargetScan和PicTar均把miRNAs種子序列與靶基因的互補以及保守性作為一個重要特征，兩者預測結(jié)果相似程度達80%～90%，PicTar被證明是與試驗驗證結(jié)果相符程度最高的軟件[20]。為提高靶基因預測準確性，本研究同時采用TargetScan和PicTar軟件進行預測，并進行并集。

由顯著富集的信號通路和GO條目可以看出，本研究鑒定得到的miRNA靶基因主要參與了蛋白合成、脂肪代謝以及核酸形成。結(jié)合這些信息，為進一步研究miRNA及其靶基因調(diào)控通路以及奶牛重要性狀形成的遺傳機制提供了依據(jù)。

總體來說，本研究通過miRNA的保守性和物種之間基因組的同源性，通過生物信息學篩選，然后qRT-PCR驗證尋找牛新的miRNA是一種行之有效的方法，為奶?；虮磉_調(diào)控及其性狀形成機制研究提供了前期基礎(chǔ)。

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(編輯 郭云雁)

Computational and Experimental Identification of Novel MicroRNAs in Bovine by Bioinformatics

CUI Xiao-gang，YANG Shao-hua，XIE Yan，ZHANG Sheng-li，ZHANG Qin，SUN Dong-xiao*

(NationalEngineeringLaboratoryforAnimalBreeding，KeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproductionofMinistryofAgriculture，CollegeofAnimalScienceandTechnology，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China)

This study aimed to predict novel miRNAs of bovine by comparative genomics and bioinformatics analysis.According to the conservation of miRNAs sequence，we compared the known miRNAs in human，mouse，sheep，pig and dog with the bovine genome sequence (UMD3.1) in NCBI to predict novel miRNAs，some of which were validated by qRT-PCR.A total of 44 novel miRNAs of bovine were obtained.Four of these were randomly selected to be validated.It was found that the 4 predicted miRNAs were expressed in mammary gland，cardiac muscle，uterus and liver of lactating Chinese Holstein cows.The methodology provides an alternative approach to predict the novel miRNAs and provide a groundwork for gene expression and trait formation mechanisms in dairy cattle.

bovine；miRNA；prediction；bioinformatics

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.006

2014-04-30

863課題(2013AA102504)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市奶牛創(chuàng)新團隊

崔曉鋼(1985-)，男，山西太原人，博士，主要從事動物分子數(shù)量遺傳學研究，Tel：010-62732768，E-mail:398304310@qq.com

*通信作者：孫東曉，教授，E-mail：sundx@cau.edu.cn

S823.2

A

0366-6964(2015)08-1317-08