周英昊，高 曄，劉林麗，曾 潔，楊雨鑫，張恩平*，陳玉林*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100；2.榆林學(xué)院生命科學(xué)研究中心，榆林 719000； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，楊凌 712100)

山羊y+L堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的研究

周英昊1，高 曄2，劉林麗3，曾 潔1，楊雨鑫1，張恩平1*，陳玉林1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100；2.榆林學(xué)院生命科學(xué)研究中心，榆林 719000； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，楊凌 712100)

旨在研究山羊y+L堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中4F2hc、y+LAT1和y+LAT2 mRNA表達(dá)的組織特異性及其在不同年齡山羊小腸中的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律。試驗(yàn)選取健康、體重相近的1日齡、6月齡、8月齡、10月齡、12月齡陜北白絨山羊各3只，共15只，屠宰后采集心、肝、腎、大腦、背最長(zhǎng)肌、體側(cè)皮膚、瘤胃、十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸組織，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)4F2hc、y+LAT1和y+LAT2 mRNA在1日齡山羊上述組織和全部山羊十二指腸、空腸和回腸的表達(dá)情況。結(jié)果表明，(1)4F2hc、y+LAT1和y+LAT2 mRNA在1日齡山羊多種組織中均有表達(dá)，且有一定的組織特異性。其中，4F2hcmRNA在皮膚表達(dá)量最高，y+LAT1 mRNA在回腸表達(dá)量最高，y+LAT2 mRNA在大腦和回腸表達(dá)量最高。(2)4F2hcmRNA在山羊十二指腸、空腸和回腸表達(dá)量均以1日齡山羊?yàn)樽罡?，其他月齡山羊相同腸段之間表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)；y+LAT1 mRNA在十二指腸、空腸和回腸表達(dá)量隨山羊年齡的增加均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)；y+LAT2 mRNA在十二指腸、空腸和回腸表達(dá)量隨山羊年齡的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其在10月齡山羊表達(dá)量最高；y+LAT2 mRNA在回腸表達(dá)量以1日齡山羊?yàn)樽畹停渌慢g山羊之間差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果說明，山羊y+L堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的主要轉(zhuǎn)運(yùn)部位為小腸；該系統(tǒng)中輕鏈y(cè)+LAT1和重鏈4F2hc構(gòu)成的異二聚體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能發(fā)揮更為主要的轉(zhuǎn)運(yùn)作用；4F2hc和y+LAT2基因可能分別在山羊皮膚和大腦中發(fā)揮重要的生理功能；4F2hc、y+LAT1和y+LAT2基因在山羊小腸中受腸段和發(fā)育階段的影響，具有不同的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律。

山羊；y+L堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；mRNA表達(dá)

動(dòng)物對(duì)氨基酸的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過程，是在多種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的參與下完成的。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)按照其底物的不同，可以分為堿性、酸性和中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，這些氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)共同擔(dān)負(fù)著氨基酸在細(xì)胞膜上的跨膜運(yùn)輸功能[1]。y+L堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要位于腸細(xì)胞和腎小管的基底，包含由y+L-型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(y+L-type amino acid transporter 1，y+LAT1)和y+L-型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體2(y+L-type amino acid transporter 2，y+LAT2)分別和細(xì)胞表面抗原4F2重鏈(4F2 heavy chain，4F2hc)共價(jià)結(jié)合構(gòu)成的兩個(gè)不同的異二聚體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。y+L系統(tǒng)主要負(fù)責(zé)堿性氨基酸(賴氨酸、精氨酸、組氨酸等)的轉(zhuǎn)運(yùn)，其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制屬于反向交換轉(zhuǎn)運(yùn)，即在Na+的協(xié)同作用下，在向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入中性氨基酸的同時(shí)，按1︰1的比例轉(zhuǎn)出細(xì)胞中的堿性氨基酸[2]。除行使堿性氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)功能外，4F2hc基因還可參與調(diào)控皮膚穩(wěn)態(tài)[3]；y+LAT1基因的多態(tài)性可能與神經(jīng)膠質(zhì)瘤以及賴氨酸尿性蛋白不耐癥的發(fā)生相關(guān)[4-6]；y+LAT2 基因的其他生理功能還未見報(bào)道。目前對(duì)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的研究主要集中在人、小鼠、豬、雞和魚類中，主要對(duì)其相應(yīng)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因在mRNA水平上進(jìn)行表達(dá)調(diào)控的研究，但是對(duì)反芻動(dòng)物y+L堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的研究還相對(duì)較少，特別是山羊上的研究幾乎未見報(bào)道。

山羊羊毛、羊絨、肌肉的生長(zhǎng)和脂肪的沉積源于胃腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收過程。董曉玲等[7]研究表明，精氨酸和組氨酸是山羊生長(zhǎng)發(fā)育常見的限制性氨基酸，說明堿性氨基酸的消化和吸收同山羊的生長(zhǎng)性能密切相關(guān)。張年[8]研究表明，相同日糧組成下，麻城黑山羊及其雜交后代在0～12月齡體重變化呈“S”曲線，山羊體重拐點(diǎn)均在3.5～5 月齡，即各組山羊在達(dá)到拐點(diǎn)日齡前，體重呈現(xiàn)較快速度增加，6～12月齡山羊體重增加趨于平緩。由此可見，山羊的體重、器官的功能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和利用率等在其體成熟前隨生長(zhǎng)發(fā)育都可能發(fā)生很大的變化，其中包括對(duì)氨基酸需求和利用率的差異，而y+L系統(tǒng)作為重要的堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，其轉(zhuǎn)運(yùn)能力因此可能存在時(shí)間和空間上的雙重差異。有研究表明，小鼠b0，+AT和y+LAT1基因mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)是一致的[9]。譚會(huì)澤等[10]認(rèn)為，測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因mRNA的表達(dá)豐度基本可以反映出其單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白的表達(dá)量，進(jìn)一步可反映出其轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的能力。因此，本試驗(yàn)選擇y+L堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的4F2hc、y+LAT1和y+LAT2基因?yàn)檠芯繉?duì)象，研究其在1日齡山羊多種組織和不同年齡山羊十二指腸、空腸和回腸中的mRNA表達(dá)情況，以探討山羊y+L堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的主要轉(zhuǎn)運(yùn)成分、轉(zhuǎn)運(yùn)部位和相關(guān)基因的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步研究反芻動(dòng)物腸道氨基酸吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以及根據(jù)山羊的生理特點(diǎn)，科學(xué)配制日糧提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

本試驗(yàn)所用山羊品種為陜北白絨山羊，選自榆林市陜北白絨山羊試驗(yàn)基地。選取健康、體重相近的1日齡(已吮奶)、6月齡、8月齡、10月齡、12月齡陜北白絨山羊各3只，共15只，頸動(dòng)脈放血至死(宰前不禁食)，采集其心、肝、腎、大腦、背最長(zhǎng)肌、體側(cè)皮膚、瘤胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸相對(duì)固定位置的組織，用PBS 緩沖液沖洗干凈，濾紙吸干，迅速放入 1.5 mL凍存管中，置液氮速凍，-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

超純RNA提取試劑盒Ultrapure RNA Kit(康為世紀(jì)公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa公司)，熒光染料SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ(TaKaRa公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad IQ5)，核酸濃度測(cè)定儀，高通量組織研磨儀，冷凍離心機(jī)。

1.3 樣品總RNA的提取

采用超純RNA提取試劑盒Ultrapure RNA Kit，按照操作手冊(cè)提取所有組織樣品總RNA。用核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度及純度，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 cDNA第一條鏈的合成

取500 ng經(jīng)檢測(cè)的質(zhì)量良好的山羊各組織總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix，按照操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物設(shè)計(jì)

以山羊β-actin管家基因?yàn)閮?nèi)參基因，從GenBank檢索山羊4F2hc、y+LAT1、y+LAT2和β-actin基因的mRNA序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子的特異性引物(表1)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

Table 1 Primer sequences for Real-time quantitative PCR

基因Gene基因登錄號(hào)GenBankID引物序列(5′→3′)Primersequence產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpProductlengthβ?actin(ACTB)XM＿005694067．1S：TGCGTGACATCAAGGAGAAGCA：GGATGCCACAGGACTCCATACCC1984F2hc(SLC3A2)XM＿005699799．1S：TGGATGGGTTTCAGGTTCGGA：CAACAACAGGTCCTTGGTGGGT176y+LAT1(SLC7A7)XM＿005685276．1S：TCATGGCGTTGATCTACTTGTGA：GAAGAACAGGCTGAGCTTGAGA161y+LAT2(SLC7A6)XM＿005692175．1S：CAGTGATGCTGTGGCTGTGACA：TGAAGCGAAGATAGATGCGTTG118

S.上游引物；A.下游引物 S.Sense primer；A.Antisense primer

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用熒光染料SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，以β-actin為內(nèi)參基因，利用Bio-Rad iQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)各待測(cè)cDNA樣品中4F2hc、y+LAT1和y+LAT2基因mRNA的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×SYBR?Premix Ex Taq II(內(nèi)含TaKaRa Ex TaqHS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，SYBR?Green I)12.5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，10倍稀釋的cDNA模板2 μL，滅菌水8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，45個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集熒光。全部反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線分析，反應(yīng)條件：55～95 ℃，每30 s升溫0.5 ℃，循環(huán)數(shù)81，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集熒光。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有樣品用內(nèi)參基因β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正后，采用2-△△Ct法計(jì)算4F2hcmRNA、y+LAT1 mRNA和y+LAT2 mRNA相對(duì)于β-actinmRNA的表達(dá)量。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)”表示，n=3，用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因子方差分析(one-way ANOVA)，以Duncan法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 4F2hcmRNA在1日齡山羊的組織表達(dá)差異

圖1顯示，4F2hcmRNA在1日齡山羊多種組織中均有表達(dá)。其在皮膚表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)；除皮膚外，空腸表達(dá)量最高；肝、腎和回腸次之，相互之間差異不顯著(P>0.05)；其次為十二指腸、大腦和瘤胃，相互之間差異不顯著(P>0.05)；再次為肌肉和結(jié)腸，二者差異不顯著(P>0.05)；心表達(dá)量顯著低于其他組織(P<0.05)。

2.2y+LAT1 mRNA在1日齡山羊的組織表達(dá)差異

圖2顯示，y+LAT1 mRNA在1日齡山羊多種組織中均有表達(dá)。其在小腸的表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)，小腸中回腸表達(dá)量最高，十二指腸和空腸次之，二者差異不顯著(P>0.05)；除小腸外，肝中表達(dá)量最高；腎、結(jié)腸、大腦、瘤胃和皮膚中表達(dá)量依次降低，相互之間差異不顯著(P>0.05)；所有組織中，心和肌肉表達(dá)量最低，二者差異不顯著(P>0.05)。

各目的基因相對(duì)于β-actin基因表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。圖上標(biāo)注字母不同者表示差異顯著(P<0.05)，Duncan法比較。n=3，下同Statistical results of mRNA relative abundance in target gene and β-actin gene.The datum are shown as “Mean±SE”.With different letters indicate significant difference (P<0.05，Duncan test).n=3.The below figures are same圖1 山羊4F2hc mRNA在不同組織的表達(dá)Fig.1 The expression of 4F2hc mRNA in different tissues of goats

圖2 山羊y+LAT1 mRNA在不同組織的表達(dá)Fig.2 The expression of y+LAT1 mRNA in different tissues of goats

2.3y+LAT2 mRNA在1日齡山羊的組織表達(dá)差異

圖3顯示，y+LAT2 mRNA在山羊多種組織中均有表達(dá)。其在大腦和回腸中表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)，二者差異不顯著(P>0.05)；皮膚和腎次之，二者差異不顯著(P>0.05)；其他組織表達(dá)量從高到低依次為結(jié)腸、空腸、十二指腸、瘤胃、心、肝和肌肉，相互之間差異不顯著(P>0.05)。

圖3 山羊y+LAT2 mRNA在不同組織的表達(dá)Fig.3 The expression of y+LAT2 mRNA in different tissues of goats

2.4 山羊4F2hcmRNA在小腸的發(fā)育性表達(dá)

圖4顯示，4F2hcmRNA在山羊十二指腸、空腸和回腸的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律相似，4F2hcmRNA在各腸段表達(dá)量均以1日齡山羊?yàn)樽罡?P<0.05)，其他月齡山羊相同腸段之間表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖4 4F2hc mRNA在不同年齡山羊小腸的表達(dá)Fig.4 The expression of 4F2hc mRNA in small intestine of goats at different ages

2.5 山羊y+LAT1 mRNA在小腸的發(fā)育性表達(dá)

圖5顯示，y+LAT1 mRNA在山羊十二指腸、空腸和回腸的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律相似。y+LAT1 mRNA在各腸段表達(dá)量隨著山羊年齡的增加均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。y+LAT1 mRNA在1日齡山羊十二指腸、空腸、回腸中表達(dá)量均為最高，在12月齡山羊十二指腸、空腸和回腸表達(dá)量均為最低。

2.6 山羊y+LAT2 mRNA在小腸的發(fā)育性表達(dá)

圖6顯示，y+LAT2 mRNA在山羊十二指腸、空腸和回腸發(fā)育性表達(dá)規(guī)律相似。y+LAT2 mRNA在小腸隨著山羊年齡的增加均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，均以1日齡山羊的表達(dá)量最低，10月齡山羊的表達(dá)量最高，在十二指腸和空腸12月齡山羊表達(dá)量顯著低于10月齡(P<0.05)?；啬cy+LAT2 mRNA在1日齡山羊表達(dá)量最低，其他各月齡山羊表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

3.1 山羊4F2hcmRNA的組織分布

有關(guān)山羊y+L堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)內(nèi)各基因表達(dá)的組織特異性研究至今未見報(bào)道。職愛民[11]研究發(fā)現(xiàn)，仔豬4F2hcmRNA在大腦、肝、腎、肌肉、腸道和心都有表達(dá)，而腸道表達(dá)最高，這與本研究的結(jié)果基本一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，4F2hcmRNA在1日齡山羊皮膚組織中表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)，由此推測(cè)，4F2hc基因可能在幼齡動(dòng)物皮膚組織中發(fā)揮重要的生理功能。E.Boulter等[3]研究稱，4F2hc基因可參與調(diào)控皮膚內(nèi)穩(wěn)態(tài)、修復(fù)表皮創(chuàng)傷以及延緩皮膚衰老，其生理作用隨動(dòng)物年齡的增長(zhǎng)而逐步減弱。S.Estrach等[12]發(fā)現(xiàn)，4F2hc基因的過表達(dá)可能導(dǎo)致皮膚癌癥的發(fā)生，敲除該基因后可使已發(fā)生的腫瘤退化。M.S.Parmacek等[13]發(fā)現(xiàn)，成年鼠4F2hcmRNA在睪丸、大腦和腎中表達(dá)較高，在肌肉和肝等組織中表達(dá)較低，這與本研究的結(jié)果稍有出入，是否是由于物種差異導(dǎo)致的還不清楚。綜合以上研究結(jié)果，推測(cè)4F2hc基因除主要在山羊小腸行使堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能外，可能還在皮膚組織中發(fā)揮其他重要的生理功能。

圖5 y+LAT1 mRNA在不同年齡山羊小腸的表達(dá)Fig.5 The expression of y+LAT1 mRNA in small intestine of goats at different ages

圖6 y+LAT2 mRNA在不同年齡山羊小腸的表達(dá)Fig.6 The expression of y+LAT2 mRNA in small intestine of goats at different ages

3.2 山羊y+LAT1 mRNA的組織分布

R.Pfeiffer等[14]發(fā)現(xiàn)，y+LAT1 mRNA在人的腎中有較高表達(dá)，D.Torrents等[15]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其在人的胎盤、血小板、外周血白細(xì)胞、肺、脾和小腸中均有表達(dá)；其在小鼠小腸和腎表達(dá)量很高，在其他組織中表達(dá)量很低，這些同本研究的結(jié)果基本一致。職愛民[11]發(fā)現(xiàn)，仔豬y+LAT1 mRNA在腸道表達(dá)量最高，在大腦、肌肉和肝中沒有表達(dá)，這與本研究稍有出入。楊吉軒[16]研究發(fā)現(xiàn)，草魚y+LAT1在所有組織中均有表達(dá)，中腸和前腸比其他組織的表達(dá)量高，這和本研究的結(jié)果完全一致。綜合以上研究，發(fā)現(xiàn)人、小鼠、豬和山羊y+LAT1 mRNA的組織分布存在一定的相似性，即y+LAT1 mRNA均在小腸表達(dá)量很高，推測(cè)山羊y+LAT1基因主要表達(dá)部位在小腸。

3.3 山羊y+LAT2 mRNA的組織分布

M.H.Dave等[9]研究表明，小鼠y+LAT2 mRNA在所有腸段、肝、大腦、腎中表達(dá)量均較低，這和本研究的結(jié)果一致。譚會(huì)澤等[10]發(fā)現(xiàn)，黃羽肉雞y+LAT2 mRNA在回腸表達(dá)量最高，但回腸、空腸和十二指腸表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。楊吉軒[16]發(fā)現(xiàn)，草魚y+LAT2 mRNA在前腸和中腸表達(dá)量比其它組織高。這些與本研究的結(jié)果稍有出入。本研究發(fā)現(xiàn)y+LAT2 mRNA在1日齡山羊小腸(回腸)、大腦等組織中有相對(duì)較高的表達(dá)。M.Zielinska等[17]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)y+LAT2基因的表達(dá)可以促進(jìn)大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)精氨酸的吸收。綜合以上研究結(jié)果，推測(cè)山羊y+LAT2 基因主要表達(dá)部位在小腸(回腸)和大腦，其可能對(duì)大腦中堿性氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮重要作用。

1日齡山羊y+LAT2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量同4F2hcmRNA 和y+LAT1 mRNA未在同一數(shù)量級(jí)，前者較后兩者低。由此推測(cè)4F2hc 和y+LAT1構(gòu)成的異二聚體蛋白可能較4F2hc和y+LAT2構(gòu)成的異二聚體蛋白發(fā)揮更為主要的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)作用。根據(jù)4F2hcmRNA、y+LAT1 mRNA和y+LAT2 mRNA在各組織的相對(duì)表達(dá)量，推測(cè)山羊y+L堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要的轉(zhuǎn)運(yùn)部位為小腸。

3.4 山羊小腸4F2hcmRNA的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律

關(guān)于小腸堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因在動(dòng)物發(fā)育的不同階段表達(dá)量變化的研究報(bào)道較少。職愛民[11]研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)塘豬十二指腸和空腸4F2hcmRNA 的表達(dá)豐度在7 d 時(shí)顯著高于其他各日齡(P<0.05)，在26、30、60、90和150 d間表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)，這與本研究的結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)，4F2hcmRNA在各腸段表達(dá)量均以1日齡山羊?yàn)樽罡?，其他月齡山羊相同腸段之間表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。B.D.Humphrey等[18]認(rèn)為，日糧的化學(xué)組成可以直接或間接影響基因的表達(dá)，飼料內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體類型和數(shù)量的變化是動(dòng)物組織對(duì)于飼料成分以及營(yíng)養(yǎng)水平變化適應(yīng)性的一種表現(xiàn)。1日齡山羊4F2hcmRNA高表達(dá)的原因可能是由于本研究中1日齡山羊在屠宰前已吮奶，蛋白質(zhì)品質(zhì)及進(jìn)入腸道的氨基酸種類和含量可能較以采食飼料為主的6～12月齡山羊高和豐富，使4F2hcmRNA在1日齡山羊各腸段均有較高表達(dá)。本研究中，6～12月齡山羊之間相同腸段4F2hcmRNA表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)，一定程度上說明4F2hc基因可能在日糧成分穩(wěn)定的條件下，在山羊小腸內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。N.Reig等[19]研究認(rèn)為，輕鏈在沒有重鏈存在的情況下，就可以發(fā)揮氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)作用，重鏈可能更多起引導(dǎo)定位的作用。還有研究表明，4F2hc除了作為轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白成分外，還是一種細(xì)胞表面分化抗原[20]，這些都可能是4F2hc基因表達(dá)保守的原因。

3.5 山羊小腸y+LAT1 mRNA的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律

E.R.Gilbert等[21]研究了肉雞小腸中多種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體，發(fā)現(xiàn)y+LAT1 mRNA的表達(dá)量隨時(shí)間線性降低，這和本研究的結(jié)果相一致。1日齡山羊小腸y+LAT1 mRNA表達(dá)量很高，可能與日糧中氨基酸的成分和含量有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在日糧成分穩(wěn)定的情況下，山羊y+LAT1 mRNA的表達(dá)量隨年齡的增加而進(jìn)一步降低。J.Pacha[22]認(rèn)為，隨著腸道組織總質(zhì)量的增加，腸道中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體總體轉(zhuǎn)運(yùn)能力增強(qiáng)，但單位面積上腸道組織對(duì)部分氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)能力會(huì)下降，可能是由于氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白密度的下降、不同型的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體之間的替換和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體周轉(zhuǎn)速率的變化等一系列原因?qū)е碌模谝欢ǔ潭壬峡梢杂脕?lái)解釋本研究y+LAT1 mRNA的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律。

3.6 山羊小腸y+LAT2 mRNA的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律

譚會(huì)澤等[10]發(fā)現(xiàn)，嶺南黃肉雞與ArborAcre肉雞十二指腸、空腸y+LAT2 mRNA具有相似的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律，即y+LAT2 mRNA的表達(dá)均隨日齡的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；嶺南黃肉雞與ArborAcre肉雞回腸y+LAT2 mRNA表達(dá)存在明顯不同，且分別不同于十二指腸和空腸，這和本研究的結(jié)果相似。1日齡山羊采食初乳，但是y+LAT2 mRNA在1日齡山羊小腸中的表達(dá)量卻較其他月齡山羊低，其表達(dá)量隨山羊年齡的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，這同本研究發(fā)現(xiàn)的y+LAT1 mRNA的表達(dá)情況明顯不同，可能是由于所有年齡山羊小腸y+LAT2 mRNA表達(dá)量均較y+LAT1 mRNA低，所以在y+LAT1 mRNA表達(dá)量較高的情況下，其受腸道氨基酸調(diào)控的作用并不明顯，進(jìn)一步推測(cè)y+LAT2可能不是山羊y+L系統(tǒng)中主要的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體，而是y+LAT1發(fā)揮主要的轉(zhuǎn)運(yùn)作用。y+LAT2 mRNA表達(dá)量隨山羊年齡的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，一定程度上也說明y+LAT2對(duì)堿性氨基酸的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)可能隨山羊年齡的增加在有限的范圍內(nèi)得到提升。y+LAT2 mRNA在山羊回腸中的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律與十二指腸和空腸存在一定的差異，一定程度上說明腸道近端和遠(yuǎn)端對(duì)堿性氨基酸的吸收可能存在差異。

4 結(jié) 論

山羊y+L堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的主要轉(zhuǎn)運(yùn)部位在小腸；輕鏈y(cè)+LAT1和重鏈4F2hc構(gòu)成的異二聚體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能在該系統(tǒng)中發(fā)揮主要的轉(zhuǎn)運(yùn)作用；4F2hc和y+LAT2基因可能分別在山羊皮膚和大腦中發(fā)揮重要的生理功能；4F2hc、y+LAT1和y+LAT2基因在小腸中受腸段和山羊發(fā)育階段的影響，具有不同的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律。

[1] DEVES R，BOYD C A.Transporters for cationic amino acids in animal cells：discovery，structure，and function[J].PhysiolRev，1998，78(2)：487-545.

[2] BR?ER S.Amino acid transport across mammalian intestinal and renal epithelia[J].PhysiolRev，2008，88(1)：249-286.

[3] BOULTER E，ESTRACH S，ERRANTE A，et al.CD98hc (SLC3A2) regulation of skin homeostasis wanes with age[J].JExpMed，2013，210(1)：173-190.[4] FAN S，ZHAO Y，LI X，et al.Genetic variants in SLC7A7 are associated with risk of glioma in a Chinese population[J].ExpBiolMed，2013，238(9)：1075-1081.

[5] FAN S，MENG D，XU T，et al.Overexpression of SLC7A7 predicts poor progression-free and overall survival in patients with glioblastoma[J].MedOncol，2013，30(1)：1-7.

[6] SPERANDEO M P，ANNUNZIATA P，BOZZATO A，et al.Slc7a7 disruption causes fetal growth retardation by downregulating Igf1 in the mouse model of lysinuric protein intolerance[J].AmJPhysiolCellPhysiol，2007，293(1)：C191-C198.

[7] 董曉玲，王洪榮，盧德勛.內(nèi)蒙古白絨山羊的限制性氨基酸研究[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2006，18(1)：26-31. DONG X L，WANG H R，LU D X.Study on limiting amino acids in Inner Mongolian White Cashmere goats[J].ChineseJournalofAnimalNutrition，2006，18(1)：26-31.(in Chinese)

[8] 張 年.麻城黑山羊及其雜交后代肥育性能及肉品質(zhì)研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012. ZHANG N.Study on fattening performance and meat quality in Macheng Black goats and its crossbred progenies[D].Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences，2012.(in Chinese)

[9] DAVE M H，SCHULZ N，ZECEVIC M，et al.Expression of heteromeric amino acid transporters along the murine intestine[J].JPhysiol，2004，558(2)：597-610.

[10] 譚會(huì)澤，王修啟，蘇海林，等.雞不同腸段堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的差異性研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，38(3)：247-252. TAN H Z，WANG X Q，SU H L，et al.Difference of cationic amino acid transporters mRNA expression in different intestinal segments of chicken[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2007，38(3)：247-252.(in Chinese)

[11] 職愛民.豬堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體cDNA克隆及其mRNA表達(dá)與調(diào)控[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008. ZHI A M.Cloning of porcine cationic amino acid transporters cDNA and its mRNA expression and regulation[D].Guangzhou：South China Agricultural University，2008.(in Chinese)

[12] ESTRACH S，LEE S A，BOULTER E，et al.CD98hc (SLC3A2) loss protects against ras-driven tumorigenesis by modulating integrin-mediated mechanotransduction[J].CancerRes，2014，74(23)：6878-6889.[13] PARMACEK M S，KARPINSKI B A，GOTTESDIENER K M，et al.Structure，expression and regulation of the murine 4F2 heavy chain[J].NucleicAcidsRes，1989，17(5)：1915-1931.

[14] PFEIFFER R，ROSSIER G，SPINDLER B，et al.Amino acid transport of y+L-type by heterodimers of 4F2hc/CD98 and members of the glycoprotein-associated amino acid transporter family[J].EMBOJ，1999，18(1)：49-57.

[15] TORRENTS D，ESTéVEZ R，PINEDA M，et al.Identification and characterization of a membrane protein (y+L amino acid transporter-1) that associates with 4F2hc to encode the amino acid transport activity y+LA candidate gene for lysinuric protein intolerance[J].JBiolChem，1998，273(49)：32437-32445.

[16] 楊吉軒.草魚堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體y+LAT1和y+LAT2的基因克隆及其mRNA表達(dá)研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013. YANG J X.Molecular cloning and expression analysis of cationic amino acid transporters y+LAT1 and y+LAT2 in Ctenopharyngodon idellus[D].Wuhan：Huazhong Agricultural University，2013.(in Chinese)

[17] ZIELINSKA M，SKOWRONSKA M，F(xiàn)RESKO I，et al.Upregulation of the heteromeric y(+)LAT2 transporter contributes to ammonia-induced increase of arginine uptake in rat cerebral cortical astrocytes[J].NeurochemInt，2012，61(4)：531-535.

[18] HUMPHREY B D，STEPHENSEN C B，CALVERT C C，et al.Glucose and cationic amino acid transporter expression in growing chickens (Gallusgallusdomesticus)[J].CompBiochemPhysiolAMolIntegrPhysiol，2004，138(4)：515-525.

[19] REIG N，CHILLARON J，BARTOCCIONI P，et al.The light subunit of system b(o,+) is fully functional in the absence of the heavy subunit[J].EMBOJ，2002，21(18)：4906-4914.

[20] DEVES R，BOYD C A.Surface antigen CD98(4F2)：not a single membrane protein，but a family of proteins with multiple functions[J].JMembrBiol，2000，173(3)：165-177.

[21] GILBERT E R，LI H，EMMERSON D A，et al.Developmental regulation of nutrient transporter and enzyme mRNA abundance in the small intestine of broilers[J].PoultSci，2007，86(8)：1739-1753.

(編輯 郭云雁)

Study on Transcriptional Level of y+L Cationic Amino Acid Transporter System in Goat

ZHOU Ying-hao1，GAO Ye2，LIU Lin-li3，ZENG Jie1，YANG Yu-xin1，ZHANG En-ping1*，CHEN Yu-lin1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China； 2.TheCenterofLifeScience,YulinCollege，Yulin719000，China； 3.CollegeofLifeSciences，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

The objective of this study was to research the mRNA expression of goat 4F2hc，y+LAT1 andy+LAT2 (y+L cationic amino acid transporter system) in various tissues and their developmental expression in small intestine of goats at different ages.A total of 15 Shanbei White Cashmere goats at the ages of day 1，month 6，8，10 and 12 (3 goats at each age) were slaughtered to collect heart，liver，kidney，brain，muscle，skin，rumen，duodenum，jejunum，ileum and colon tissues.Then 4F2hc，y+LAT1 andy+LAT2 mRNA were quantified by Real-time quantitative PCR in all collected tissues of 1-day-old goats and in duodenum，jejunum，ileum of all goats.The results indicated that，(1) 4F2hc，y+LAT1 andy+LAT2 mRNA were widely expressed in all collected tissues of 1-day-old goats and the expression level varied from tissues.Specifically，4F2hcmRNA in skin，y+LAT1 mRNA in ileum andy+LAT2 mRNA in brain and ileum had the highest abundance.(2) 4F2hcmRNA of duodenum，jejunum and ileum on 1-day-old goats had higher abundance than that in goats on the other month-old，and there was no significant difference in the same segment of small intestine in goats on the other month-old (P>0.05)；y+LAT1 mRNA abundance in small intestine of goats decreased with age；y+LAT2 mRNA abundance in small intestine peaked in 10-month-old goats and then dropped with age，while it in ileum of 1-day-old goats had lower abundance than that in goats on the other month-old，and there was no significant difference in ileum between goats on the other month-old (P>0.05).In conclusion，y+L cationic amino acid transporter system played a main role in transferring amino acid in small intestine of goats and the heterodimer consisting of y+LAT1 and 4F2hc might be the main transporter protein in y+L system.4F2hcandy+LAT2 might perform important physiological functions in skin and brain of goats，respectively.4F2hc，y+LAT1 andy+LAT2 were differentially regulated and distributed with the differences of developmental stages and segments of small intestine in goat.

goat；y+L cationic amino acid transporter system；Real-time quantitative PCR；mRNA expression

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.005

2014-10-30

國(guó)家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-40-13)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303059)；陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014K01-17-03)；陜西省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目(2014K01-17-04)

周英昊(1989-)，男，滿族，河北隆化人，碩士生，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)原理與方法研究，E-mail: mymyinghao@163.com

*通信作者：張恩平，教授，E-mail：zhangenping@nwsuaf.edu.cn；陳玉林，教授，E-mail：chenyulin@nwsuaf.edu.cn

S827.2

A

0366-6964(2015)08-1308-09