高亞可，陸鳳花，吳柱連，馬 帆，劉曉華，杜姍姍，石德順

(廣西大學亞熱帶生物資源保護利用國家重點實驗室，南寧 530005)

線粒體移植對水牛卵母細胞發(fā)育潛能的影響

高亞可，陸鳳花，吳柱連，馬 帆，劉曉華，杜姍姍，石德順*

(廣西大學亞熱帶生物資源保護利用國家重點實驗室，南寧 530005)

本研究以水牛卵泡顆粒細胞作為線粒體的來源細胞，初步探討水牛卵母細胞進行線粒體移植(MIT)后對其發(fā)育潛能的影響。試驗比較了不同級別水牛卵母細胞mtDNA的拷貝數(shù)，并研究了水牛卵母細胞進行MIT后，其后續(xù)早期胚胎發(fā)育及胚胎線粒體膜電位(ΔΨm)的變化情況。結果顯示：一級卵母細胞組的平均mtDNA拷貝數(shù)極顯著高于二、三級卵母細胞組((202 101±74 432)vs(118 483±17 028)，(39 177±7 938)，P<0.01)，二級卵母細胞組的平均mtDNA拷貝數(shù)極顯著高于三級卵母細胞組((118 483±17 028)vs(39 177±7 938)，P<0.01)；孤雌激活處理后發(fā)現(xiàn)：一級卵母細胞組的卵裂率和囊胚率也都極顯著高于二、三級卵母細胞組(P<0.01)，而二級卵母細胞組激活后胚胎的卵裂率和囊胚率亦極顯著高于三級卵母細胞組(P<0.01)。用Mito-Tracker探針標記的外源線粒體經(jīng)移植后，會隨著胚胎的發(fā)育而發(fā)生移動，分布到各個卵裂球中；且發(fā)現(xiàn)二級卵母細胞MIT組孤雌激活后的囊胚率顯著高于對照組和空注組(27.3%vs17.4%，7.84%，P<0.05)，而三級卵母細胞MIT組激活后的囊胚率與對照組和空注組差異不顯著(P>0.05)；對胚胎ΔΨm檢測發(fā)現(xiàn)，水牛植入前各時期胚胎ΔΨm總體呈上升趨勢，線粒體移植后胚胎各時期的ΔΨm均顯著高于對照組(P<0.05)。綜上表明：不同質(zhì)量的水牛卵母細胞其mtDNA拷貝數(shù)存在顯著差異，且mtDNA拷貝數(shù)與卵母細胞質(zhì)量和發(fā)育能力成正相關；通過移植外源線粒體可以提高二級水牛卵母細胞的發(fā)育潛能。

線粒體移植；mtDNA拷貝數(shù)；線粒體膜電位；水牛；卵泡顆粒細胞

線粒體是哺乳動物細胞中含量最為豐富的細胞器，其基本功能是為細胞的一切生命活動提供能量(ATP)，同時還對配子的成熟和早期胚胎發(fā)育產(chǎn)生重要的影響。在卵母細胞的成熟過程中，線粒體的數(shù)量、結構及分布不是固定不變的，它會隨著卵母細胞成熟過程中對能量的需求變化而變化。但隨著卵母細胞的成熟完成，mtDNA將不再進行自我復制，直至囊胚孵化階段才恢復復制[1]，因此，早期胚胎發(fā)育各階段所需要的能量主要由卵母細胞自身所攜帶的線粒體提供。J.Van Blerkom等[2]研究發(fā)現(xiàn)，ATP的供應能力對于卵母細胞的受精和早期胚胎發(fā)育至關重要，ATP含量低的卵子雖然也具有一定的受精能力，但僅當ATP含量≥2 pmol時，受精卵才容易繼續(xù)發(fā)育。研究表明，在胚胎發(fā)育早期需要大量的能量，尤其是4-～8-細胞期，如果能量供給不足，胚胎就會分裂減緩，染色體非整倍體率增加，繼而發(fā)育阻滯[3]。C.T.Zeng等[4]進行患者自體顆粒細胞線粒體移植(MIT)后，成功獲得妊娠的臨床報道。2003年，中國首例MIT的雙胞胎兒順利出生并且健康狀況良好[5]。在小鼠，Y.C.Yi等[6]分別對年輕和老齡小鼠進行MIT，與未移植的對照組相比，年輕小鼠組兩者囊胚率差異顯著，老齡小鼠組兩者囊胚率差異極顯著。因此，MIT可以一定程度上改善卵子的質(zhì)量和胚胎的發(fā)育能力。本試驗以水牛卵泡顆粒細胞作為線粒體的來源細胞，嘗試對水牛卵母細胞進行線粒體移植，探討線粒體移植對水牛卵母細胞發(fā)育潛能的影響以及其在水牛卵母細胞上應用的可行性。

1 試驗材料

1.1 材料

水牛卵巢采自于南寧市屠宰場。

1.2 主要試劑

本試驗所用化學試劑除特殊說明外均購自Sigma 公司。TCM-199、DMEM購自Gibco公司，質(zhì)粒PMD18-T Vector、DNATaq酶、10×PCR Buffer、Taq Mastermix 和SYBR Premix Ex TaqTM 購自大連寶生物公司(TaKaRa)；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，瓊脂糖Agarose購自上海北諾生物科技有限公司；卵母細胞裂解液(1×PCR buffer，2.5% Triton X-100，100 μg·mL-1蛋白酶K)購自英國Huntingdon公司；線粒體提取試劑盒購自德國Hermo公司；Mito-Tracker Green線粒體熒光探針購自碧云天生物公司；JC-1線粒體熒光探針購自美國AAT Bioquest。

1.3 主要儀器

電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)，PCR儀(Biometra)，高速離心機和紫外分光光度計(Thermo)，MILLIQ-BioCel 超純水制備系統(tǒng)(Millipore)，超凈工作臺(蘇州佳德凈化科技)，生化恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅醫(yī)療設備)，7500 Real Time PCR(Applied Biosystems)，實體顯微鏡(Nikon)，倒置顯微鏡及顯微操作系統(tǒng)(Nikon)，激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM510 meta，Leica)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，高速冷凍離心機(Sigma)。

1.4 試驗方法

1.4.1 水牛卵母細胞的體外成熟培養(yǎng) 從屠宰場收集的水牛卵巢置于30 ℃左右高壓滅菌生理鹽水中2～3 h運回實驗室。卵巢先用75%酒精潤洗消毒后，再用預熱滅菌生理鹽水清洗2～3遍，用帶有12號針頭的10 mL注射器抽取卵巢皮質(zhì)層2～5 mm直徑的卵泡。抽卵前先吸取少量預熱的CCM液(TCM-199+5 mmol·L-1HEPES+5 mmol·L-1NaHCO3+3% FBS)，體視顯微鏡下揀出卵泡液中的卵丘-卵母細胞復合體(COCs)。經(jīng)CCM液清洗2～3遍后，放入預熱M液(TCM-199+5 mmol·L-1HEPES+26.2 mmol·L-1NaHCO3+0.1 μg·mL-1FSH+5% FBS)中過渡處理3 min，然后移入另一份M液中，每100 μL體積M液中放入10～20枚COCs。置于38.5 ℃ 5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)22～24 h。

1.4.2 體外成熟卵母細胞的分類 根據(jù)體外成熟后卵母細胞的形態(tài)和卵丘顆粒細胞的層數(shù)，可將卵母細胞大致分為5類[7]：A類卵母細胞形態(tài)規(guī)則，卵丘顆粒細胞致密，至少包裹有5層以上卵丘顆粒細胞；B類卵母細胞形態(tài)基本規(guī)則，卵丘顆粒細胞為2～4層，基本上包裹卵母細胞；C類卵母細胞大部分被卵丘顆粒細胞包裹，形態(tài)基本規(guī)則；D類卵母細胞外只有少量卵丘顆粒細胞存在，形態(tài)基本規(guī)則；E類卵母細胞為裸卵，形態(tài)基本規(guī)則。其中A、B類卵母細胞歸為一級，C、D類卵母細胞歸為二級，E類卵母細胞歸為三級。

1.4.3 熒光定量標準品的制備

1.4.3.1 PCR擴增：將去除顆粒細胞后的5枚水牛卵母細胞移入10 μL裂解液進行細胞裂解，作為PCR擴增的模板。參考GenBank中牛線粒體全基因組(NC_006853)和文獻[8]，設計引物序列(上游：5′-CAGTGAGAATGCCCTCTAGG-3′；下游：5′-TTTACGCCGTACTCCTGT-3′)。在200 μL滅菌PCR中依次加入Taq Mastermix 10 μL、引物各0.5 μL、模板1 μL、雙蒸水8 μL，PCR擴增程序：95 ℃變性3 min；95 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，30循環(huán)；72 ℃10 min。擴增后產(chǎn)物點樣電泳(110 V 30 min)，凝膠成像分析系統(tǒng)拍照觀察。

1.4.3.2 目的片段的克隆、鑒定：切下目標條帶，回收并純化PCR產(chǎn)物(天根生化科技有限公司)。利用pMD18-T 載體進行連接，于16 ℃水浴過夜，次日進行轉化。轉化前先預熱復蘇液和培養(yǎng)基，取5 μL連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細菌中冰浴30 min，將混合物放入42 ℃水浴鍋，水浴60 s，冰上放置2 min，加入1 mL復蘇液于混合物中，搖床中混勻45 min后離心。棄去上層800 μL 液體，將剩余液體混勻涂于加入抗生素的LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h 后挑菌、搖菌。提取質(zhì)粒前，先進行菌液cracking鑒定，挑選陽性菌液提取重組質(zhì)粒(天根生化科技公司)。對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，若重組質(zhì)粒構建成功，則測定其濃度，并對其梯度稀釋保存。1.4.3.3 熒光定量PCR：將上述梯度稀釋好的質(zhì)粒作為模板，進行熒光定量PCR擴增，制備標準曲線，作為實時熒光定量標準品。反應體系:SYBR II 10 μL、ROX染料0.4 μL、引物各0.3 μL、雙蒸水8 μL、模板1 μL，共20 μL；反應條件:95 ℃5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，45個循環(huán)。

1.4.4 mtDNA拷貝數(shù)測定 按上述分類標準分別收集不同級別的卵母細胞，5枚一組放入10 μL細胞裂解液內(nèi)，55 ℃水浴鍋內(nèi)放置20～30 min，100 ℃沸水中放置5 min，再以1 000 r·min-1離心2 min，取10 μL上清液稀釋20倍后作為 PCR 模板。熒光定量 PCR 反應體系同1.4.3.3，以雙蒸水和裂解液作為陰性對照組。

1.4.5 孤雌激活處理 分別對各級別卵母細胞進行孤雌激活處理。先用5 μmol·L-1的離子霉素激活處理 5 min，用培養(yǎng)液清洗3遍，然后移入含 2 mmol·L-1的二甲氨基嘌呤(6-DMAP)的培養(yǎng)液中激活處理3 h。激活后用培養(yǎng)液清洗3遍，移入水牛顆粒細胞單層的培養(yǎng)微滴內(nèi)，置于38.5 ℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每48 h換液1次。24 h后統(tǒng)計各組胚胎卵裂率，7 d后統(tǒng)計各組胚胎囊胚率。

1.4.6 水牛卵泡顆粒細胞的分離與體外培養(yǎng) 具體方法參照文獻[9]。

1.4.7 線粒體的提取及活性檢測 水牛顆粒細胞培養(yǎng)匯合至70%～80% 時，用胰酶消化、收集細胞，單次提取的細胞數(shù)量約5×107。依據(jù)線粒體提取試劑盒(Thermo公司)操作要求，將收集的顆粒細胞洗滌后加入預冷的2 mL玻璃勻漿器中，加入800 μL分離液A，冰上研磨30～40 s使細胞破裂(可取少量研磨液鏡下觀察細胞破裂程度)，加入500 μL分離液C并一起轉移到滅菌EP管內(nèi)，1 500 r·min-1離心5 min，取上清12 000 r·min-1離心 20 min，棄上清，加入500 μL分離液C重懸洗滌，1 500 r·min-1離心5 min，取上清12 000 r·min-1離心10 min，棄上清，線粒體沉淀在管底，加入5 μL保存液混勻懸浮備用。活性線粒體經(jīng)Mito-Tracker Green染色后可以發(fā)出綠色熒光，活性較低或失去活性的線粒體則熒光強度較弱或沒有熒光。檢測時，將Mito-Tracker熒光探針工作液200 μL與提取的線粒體混勻，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，洗滌2～3次后12 000 r·min-1離心10 min回收線粒體，熒光顯微鏡下檢測線粒體的熒光強度。

1.4.8 線粒體移植 將事先提取好的線粒體放入CO2培養(yǎng)箱中溫育30 min。在操作盤中分別做5 μL線粒體懸液滴、30 μL胰酶溶液滴各1個，30 μL培養(yǎng)液(CM)液滴(放置卵母細胞)若干滴，覆蓋石蠟油，將操作盤置于CO2培養(yǎng)箱中溫育5～10 min。借助顯微操作系統(tǒng)，使用內(nèi)徑6～7 μm 的顯微注射針，先吸取一定量(相當于1～1.5個卵母細胞直徑長度)的線粒體懸液，再緩緩注入單個卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)。線粒體移植后用CM液清洗卵母細胞2～3次，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)恢復處理1 h后進行孤雌激活處理。1.4.9 胚胎線粒體膜電位(ΔΨm)測定 按照線粒體膜電位檢測試劑盒說明書配制JC-1工作液，染色前先將工作液在CO2培養(yǎng)箱中溫育30 min，使用時與CM培養(yǎng)液1∶1混勻。收集各時期(2-細胞、4-細胞、8-細胞、桑椹胚和囊胚)胚胎，置于JC-1工作液中避光染色30 min。由于JC-1探針的水溶性較差，會有輕微絮狀不容物附在胚胎表面，染色結束后需用CM液多次洗滌，可輕微吹打。熒光顯微鏡下分別于綠色和紅色熒光模塊下觀察，獲取熒光圖像，使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量同一胚胎的紅、綠熒光值，最后計算同一胚胎的紅、綠熒光比值即為胚胎的線粒體膜電位值(ΔΨm)。

1.5 試驗設計

1.5.1 卵母細胞mtDNA拷貝數(shù)與卵母細胞質(zhì)量及胚胎發(fā)育潛能的關系 收集經(jīng)體外成熟培養(yǎng)后不同級別的水牛卵母細胞，采用實時熒光定量PCR檢測卵母細胞mtDNA 的拷貝數(shù)，并分別對各級別卵母細胞進行孤雌激活處理，觀察統(tǒng)計其胚胎發(fā)育情況，初步分析mtDNA拷貝數(shù)與卵母細胞質(zhì)量及胚胎發(fā)育潛能的關系。

1.5.2 線粒體的活性檢測及移植后的追蹤觀察 以水牛卵泡顆粒細胞作為線粒體提取的供源細胞，將提取出的線粒體用Mito-Tracker熒光探針標記后，熒光顯微鏡下觀測線粒體的活性值；同時借助顯微操作系統(tǒng)，將一定量的標記后的線粒體植入體外成熟培養(yǎng)24 h后的卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)，然后進行孤雌激活處理。熒光顯微鏡下觀察外源線粒體在胚胎發(fā)育過程中的分布及存活情況。

1.5.3 線粒體移植對水牛胚胎發(fā)育的影響 試驗以二、三級水牛卵母細胞為研究對象，初步探討MIT對二、三級水牛卵母細胞發(fā)育潛能的影響。將提取的活性線粒體移植到二、三級卵母細胞胞質(zhì)后進行孤雌激活處理，設置空注組(注入等量的線粒體懸浮液)和對照組(不移植)，觀察并統(tǒng)計各組胚胎發(fā)育情況。

1.5.4 線粒體移植對水牛植入前胚胎線粒體膜電位的影響 本試驗旨在探索MIT對水牛植入前胚胎線粒體膜電位的影響。收集體外成熟培養(yǎng)24 h后的水牛二級卵母細胞，隨機分為兩組，一組進行線粒體移植，另一組為對照組，然后分別進行孤雌激活處理并進行胚胎培養(yǎng)。收集兩組各階段胚胎，通過JC-1熒光探針染色來檢測不同時期胚胎的ΔΨm值，熒光顯微鏡下分別于綠色和紅色熒光模塊下觀察，獲取熒光圖像，使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量同一胚胎的紅、綠熒光值，最后計算同一胚胎的紅、綠熒光比值即為胚胎的線粒體膜電位值(ΔΨm)。

2 結 果

2.1 標準品的制備

PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 凝膠電泳檢測，擴增出225 bp大小目的片段(圖1 A)，擴增條帶清晰明亮，沒有拖帶現(xiàn)象。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定(圖1B)：重組質(zhì)粒大小約3 000 bp，條帶清晰明亮，雙酶切檢測切下片段約為300 bp左右，與預期結果一致，說明質(zhì)粒構建成功。

將梯度稀釋的質(zhì)粒經(jīng)real-time PCR反應后，得到的標準曲線如圖2所示。標準曲線的斜率為-3.396，截距為36.492，R2值為0.997，其線性范圍可達6個數(shù)量級，其重組質(zhì)粒濃度與相應的Ct值線性關系良好，可用于量化樣品中mtDNA的拷貝數(shù)。

2.2 不同級別水牛卵母細胞mtDNA拷貝數(shù)

采用qRT-PCR檢測不同級別水牛卵母細胞mtDNA 拷貝數(shù)的分析結果：一級卵母細胞組的平均mtDNA拷貝數(shù)極顯著高于二、三級卵母細胞組((202 101±74 432)vs(118 483±17 028)，(39 177±7 938)，P<0.01)；二級卵母細胞組的平均mtDNA拷貝數(shù)亦極顯著高于三級卵母細胞組((118 483±17 028)vs(39 177±7 938)，P<0.01)。表明不同質(zhì)量的水牛卵母細胞的mtDNA拷貝數(shù)存在顯著差異。

M1.Marker Ⅰ;M2.Super marker;M3.Marker Ⅲ圖1 PCR擴增目的基因片段(A)和重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定(B)Fig.1 The target gene fragment of PCR amplification(A)and double digestion of the recombinant plasmid(B)

圖2 mtDNA 拷貝數(shù)定量PCR標準曲線Fig.2 The standard curve of mtDNA copy number

2.3 不同級別水牛卵母細胞孤雌激活胚胎的發(fā)育

不同級別水牛卵母細胞孤雌激活處理后胚胎發(fā)育情況見表1，一級卵母細胞經(jīng)孤雌激活處理后的胚胎卵裂率和囊胚率都極顯著高于二、三級卵母細胞組(P<0.01)；而二級卵母細胞激活后胚胎的卵裂率和囊胚率亦極顯著高于三級卵母細胞組(P<0.01)。表明水牛卵母細胞的mtDNA拷貝數(shù)與胚胎發(fā)育的能力成正相關(圖3)。

同組不同大寫字母標注表示差異極顯著(P<0.01)Data with different capital letters indicate highly significant difference (P<0.01)圖3 卵母細胞mtDNA 拷貝數(shù)與胚胎發(fā)育能力的關系Fig.3 The relationship between oocyte mtDNA copy number and embryo development

表1 不同級別水牛卵母細胞孤雌激活胚胎的發(fā)育情況

Table 1 The development of parthenogenetic embryos from different quality of buffalo oocytes

組別Groups卵母細胞數(shù)No.ofoocytes分裂率/%Cleavagerate囊胚率/%Blastocystrate一級卵母細胞Thefirstlevelofoocytes11771.83±2.60A42.85±2.86A二級卵母細胞Thesecondlevelofoocytes14341.61±5.52B25.06±2.04B三級卵母細胞Thethirdlevelofoocytes12915.26±1.41C2.25±0.79C

同列標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同

Data with different small letters in the same column mean significant difference (P<0.05)，different capital letters indicate highly significant difference (P<0.01).The same as below

2.4 線粒體的活性檢測及移植后的追蹤觀察

從水牛顆粒細胞中提取線粒體，活性線粒體經(jīng)Mito-Tracker Green熒光探針標記后呈綠色熒光，如圖4A和4B所示，熒光探針標記染色結果顯示從水牛顆粒細胞提取的線粒體活性良好。線粒體移植后，在熒光顯微鏡下觀察外源線粒體在胚胎發(fā)育過程中的分布及存活情況，結果發(fā)現(xiàn)：外源線粒體移植后隨著胚胎發(fā)育而發(fā)生移動，并分配到每個卵裂球中。說明顆粒細胞線粒體移植后，在一定時間內(nèi)，持續(xù)具有活性并參與了早期胚胎發(fā)育的過程(圖4C和4D)。

A．常光下線粒體懸液圖，B.綠色熒光下線粒體懸液圖；C．線粒體移植2 h后熒光下胚胎圖；D.線粒體移植24 h后熒光下胚胎圖A.Suspension droplet of mitochondria under bright-field；B.Suspension droplet of mitochondria under fluorescence；C.The embryos after MIT for 2 h under fluorescence；D.The embryos after MIT for 24 h under fluorescence圖4 線粒體移植前線粒體懸液及注射后胚胎熒光觀察400×Fig.4 The fluorescence observing of suspension droplet of mitochondria before MIT and embryos in different stage after MIT 400×

2.5 線粒體移植對水牛卵母細胞后續(xù)胚胎發(fā)育的影響

線粒體移植對二、三級水牛卵母細胞孤雌激活胚胎發(fā)育的影響(表2)。結果發(fā)現(xiàn)：二級卵母細胞線粒體移植后的孤雌激活胚胎的囊胚發(fā)育率顯著高于對照組和空注組(27.3%vs17.4%，7.84%，P<0.05)；而三級卵母細胞線粒體移植后孤雌激活胚胎的囊胚率與對照組和空注組無顯著差異(4.73%vs3.43%，1.36%，P>0.05)。說明水牛顆粒細胞線粒體移植可以改善二級卵母細胞后續(xù)胚胎的發(fā)育潛能，但對三級卵母細胞無明顯作用。

表2 MIT對水牛二、三級卵母細胞孤雌激活胚胎發(fā)育的影響

Table 2 The effect of MIT on parthenogenetic embryonic development of the second and the third level of buffalo oocytes %

組別Groups二級卵母細胞Thesecondlevelofoocytes三級卵母細胞Thethirdlevelofoocytes細胞數(shù)No.ofoocytes卵裂率Cleavagerate8-細胞胚胎率8-cellembryorate囊胚率Blastocystrate細胞數(shù)No.ofoocytes卵裂率Cleavagerate8-細胞胚胎率8-cellembryorate囊胚率Blastocystrate注射組Injectiongroup143(84)58.7a(70)48.9a(39)27.3a169(31)18.3a(20)11.8a(8)4.73對照組Control115(71)61.8a(45)39.1b(20)17.4b175(34)19.4a(19)10.9a(6)3.43空注組Nothinginjection102(42)41.2b(19)18.6c(8)7.84c147(13)8.84b(7)4.76b(2)1.36

2.6 線粒體移植對水牛胚胎線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位ΔΨm是在線粒體內(nèi)膜兩側離子泵的作用下形成的，是保證線粒體電子傳遞鏈和氧化磷酸化形成的前提，從而保證了ATP的正常供應。本試驗主要通過JC-1熒光探針染色(圖5)來檢測不同時期胚胎的ΔΨm值，其結果見表3，從2-細胞～囊胚的ΔΨm 總體呈上升趨勢，MIT組2-細胞、4-細胞的ΔΨm極顯著高于對照組(P<0.01)，8-細胞期、桑椹胚和囊胚ΔΨm顯著高于對照組(P<0.05)?？梢?，線粒體移植可以明顯提高水牛孤雌激活胚胎各時期的ΔΨm，但不改變在胚胎發(fā)育過程中ΔΨm的總體變化趨勢(圖6)。

表3 MIT對水牛胚胎線粒體膜電位的影響

Table 3 The effect of MIT on mitochondrial membrane potential of buffalo embryo

組別Groups線粒體膜電位值ΔΨm2-細胞2-cell4-細胞4-cell8-細胞8-cell桑椹胚Morula囊胚Blastocyst移植組Transplantation0.3428±0.0742A0.3371±0.0556A0.3079±0.0814a0.4552±0.0427a0.5518±0.0538a對照組Control0.2306±0.0433B0.2318±0.0471B0.2460±0.0533b0.3915±0.0411b0.5165±0.0494b

A1～A3、B1～B3、C1～C3、D1～D3和E1～E3.2-細胞期胚胎、4-細胞期胚胎、桑椹胚、囊胚和孵化囊胚A1-A3，B1-B3，C1-C3，D1-D3，E1-E3.Respectively 2- cell stage embryos，4- cell stage embryos，8- cell stage embryos，morula，blastocyst and hatched blastocyst from top to bottom圖5 各時期胚胎JC-1探針染色后可見光、綠色熒光、紅色熒光圖 400×Fig.5 Images in each row are embryos stained by JC-1 under a visible light，green fluorescence and red fluorescence 400×

圖6 水牛孤雌激活胚胎各時期ΔΨmFig.6 The ΔΨm of buffalo parthenogenetic embryos in different stage

3 討 論

mtDNA拷貝數(shù)是影響哺乳動物卵母細胞成熟質(zhì)量和早期胚胎發(fā)育能力的重要因素。在卵母細胞成熟過程中，細胞內(nèi)的mtDNA不斷進行復制，線粒體的數(shù)量和分布也會隨著卵母細胞成熟過程中對能量需求的變化而變化。細胞成熟后mtDNA停止復制，直到囊胚孵化階段才逐漸恢復復制。T A.Santos等[10]通過對不同受精結局的卵母細胞mtDNA拷貝數(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，正常受精組高于受精失敗組和退化組。J.Hansen等[11]認為，高齡婦女卵母細胞發(fā)育潛能低可能是由于卵母細胞中完整的mtDNA 拷貝數(shù)下降，或者mtDNA轉錄水平下降所至。此外，卵母細胞mtDNA拷貝數(shù)還與卵母細胞凋亡[12]以及胚胎發(fā)育阻滯等密切相關[13]。因此，線粒體mtDNA拷貝數(shù)可以一定程度上作為評估水牛卵母細胞成熟質(zhì)量和隨后胚胎發(fā)育能力的指標。試驗中發(fā)現(xiàn)三級水牛卵母細胞的mtDNA拷貝數(shù)極顯著低于一、二級卵母細胞組，且孤雌激活胚胎的發(fā)育能力顯著低于一、二級卵母細胞組，說明三級水牛卵母細胞(裸卵)在體外成熟過程中未能正常進行mtDNA復制，細胞成熟不完全，同時也表明了水牛卵母細胞的mtDNA拷貝數(shù)與卵母細胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育的能力成正相關。試驗發(fā)現(xiàn)二級卵母細胞經(jīng)線粒體移植后可以顯著提高其孤雌激活胚胎的發(fā)育能力，這一結果與王曉磊等的試驗結果相似[14]；試驗還發(fā)現(xiàn)，雖然MIT組與對照組相比卵裂率無顯著差異，但都顯著高于空注組(P<0.01)，說明了顯微操作會對細胞造成一定的機械損傷，同時也說明線粒體移植對胚胎的發(fā)育有明顯的改善作用。另外試驗結果顯示，MIT對三級卵母細胞的胚胎發(fā)育率并無明顯改善作用，這可能是由于三級水牛卵母細胞的mtDNA拷貝數(shù)過低，卵母細胞胞質(zhì)成熟不完全，顯著降低了其胚胎的發(fā)育能力。同時依據(jù)J.Van Blekrom等[2]的研究結果，卵母細胞內(nèi)ATP的含量要達到一定的閾值胚胎才能正常受精和發(fā)育，而對三級水牛卵母細胞注入有限的外源線粒體可能無法提高其ATP的含量達到這個閾值，因而對胚胎的發(fā)育無明顯改善作用。

在對卵胞質(zhì)移植和體細胞核移植的研究發(fā)現(xiàn)，雖然供體細胞的mtDNA進入受體卵母細胞后會隨著胚胎的發(fā)育發(fā)生遺傳漂變或降解而逐漸減少，甚至全部消失，但也有少量的mtDNA可以被同化并參與受體胚胎的發(fā)育，且可以遺傳給后代[15]。這說明在受體卵母細胞內(nèi)沒有生物學機制上可以徹底破壞外源線粒體的酶類存在，受體卵母細胞胞質(zhì)對外源線粒體具有一定程度的可兼容性。本試驗將顆粒細胞線粒體移植到水牛卵母細胞中并進行孤雌激活處理，發(fā)現(xiàn)被標記的外源線粒體會隨著胚胎的發(fā)育發(fā)生移動，并被分配到卵裂球中，說明外源線粒體移植后在一定時間內(nèi)可持續(xù)具有活性，并參與了胚胎的早期發(fā)育。但多數(shù)細胞熒光強度會隨著胚胎發(fā)育越來越弱，這可能是由于移植的線粒體數(shù)量相對有限，且隨著胚胎發(fā)育部分外源線粒體被逐步降解，同時線粒體活性熒光探針也會隨著觀察次數(shù)的增多而發(fā)生熒光淬滅。線粒體膜電位(ΔΨm)是通過線粒體內(nèi)膜兩側“質(zhì)子泵”的作用形成，是保證電子傳遞以及氧化磷酸化反應正常進行，促使細胞能量物質(zhì) ATP 形成的前提[16]，此外，ΔΨm與卵母細胞成熟、受精和卵裂過程中線粒體的空間穩(wěn)定，細胞信號轉導，維護鈣穩(wěn)態(tài)和細胞凋亡等過程也直接相關[17-19]。因此，ΔΨm被認為是影響卵母細胞和胚胎發(fā)育潛能的重要因素之一。本試驗在對早期胚胎ΔΨm測定時發(fā)現(xiàn)，正常水牛孤雌激活胚胎從2-細胞～囊胚，其ΔΨm總體呈上升趨勢，這與劉延荷等對小鼠的研究結果一致[20]。這可能是由于隨著胚胎的發(fā)育進行，胚胎的耗能越來越多，會不斷激活一些原來可能處于“休眠”狀態(tài)的線粒體參與供能，從而提高了胚胎的ΔΨm值。同時，MIT組的卵母細胞孤雌激活后各個時期胚胎的ΔΨm均明顯高于對照組。這可能是由于被移植的外源線粒體具有較高的活性，并有部分外源線粒體參與了胚胎的發(fā)育過程，從而增加了胚胎整體的ΔΨm值。本試驗結果顯示，外源線粒體移植雖然改變了水牛各時期胚胎的ΔΨm，但未改變胚胎發(fā)育過程中ΔΨm的總體變化趨勢。綜上所述，卵母細胞線粒體移植可以一定程度上提高水牛卵母細胞的發(fā)育潛能。

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(編輯 程金華)

Effects of Mitochondrial Transplant on the Developmental Potential of Buffalo Oocytes

GAO Ya-ke，LU Feng-hua，WU Zhu-lian，MA Fan，LIU Xiao-hua，DU Shan-shan，SHI De-shun*

(StateKeyLaboratoryforConservationandUtilizationofSubtropicalAgro-bioresources，GuangxiUniversity，Nanning530005，China)

The aim of present study was to investigate the effects of mitochondrial transplant (MIT) on the developmental potential of buffalo oocytes.The mitochondrial DNA (mtDNA) copy number in the oocyte，and the developmental competence，exogenous mitochondria distribution，as well as mitochondrial membrane potential (ΔΨm) in the preimplantation embryos after the MIT were examined.The result showed that the average mtDNA copy number of buffalo oocytes in the first level of oocytes was evidently higher than the second and the third level of oocytes ((202 101±74 432)vs(118 483±17 028)，(39 177±7 938)，P<0.01)，and the average mtDNA copy number in the second level of oocytes was significantly higher than that of the third level of oocytes ((118 483±17 028)vs(39 177±7 938)，P<0.01).Furthermore，the cleavage rates and blastocyst rates of the first level of oocytes were significantly higher than those of the second and the third level of oocytes after parthenogenetic activation (P<0.01)，and the cleavage rates and blastocyst rates of the second level of oocytes were remarkably higher than those of the third level of oocytes (P<0.01).The exogenetic mitochondria labeled with Mito-Tracker fluorescent probe distributed into each of blastomeres with the embryonic development after MIT.Moreover，more the second level of oocytes that received MIT developed to the blastocyst stage after parthenogenetic activation in comparison with oocytes that did not received MIT or were injected with solution (27.3%vs17.4%，7.84%，P<0.05)，however，there were no significant difference in the blastocyst rates of the third level of oocytes than the control group and the nothing injection group after MIT.The ΔΨm of buffalo preimplantation embryo presented an increased trend during embryonic development，and the ΔΨm of embryo derived from MIT group was significantly higher than that of the control group (P<0.05).These results showed that the mtDNA copy numbers in different quality buffalo oocytes have significant differences，and the mtDNA copy numbers of buffalo oocytes are positively related with the quality of oocytes and their developmental potential，and the developmental ability of the second level of oocytes can be improve by MIT.

mitochondrial transplantation；mtDNA copy number；mitochondrial membrane potential；buffalo；follicular granulosa cell

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.011

2014-10-30

國家“863”項目(2011AA100607)；教育部高等學校博士學科點博導基金項目(20114501110001)；教育部回國基金項目(AC150070)；廣西科學基金項目(2012GXNSFFA060004)；廣西研究生教育創(chuàng)新計劃資助項目(T3340098603)

高亞可(1987-)，男，河南許昌人，碩士生，主要從事動物胚胎工程研究，E-mail：gaoyake_2008@163.com

*通信作者：石德順，博導，研究員，主要從事動物胚胎工程與轉基因動物研究，E-mail：ardsshi@gxu.edu.cn

S823.8+3；S814

A

0366-6964(2015)04-0583-09