余長松，賈 剛，鄧秋紅，陳小玲，趙 華，劉光芒，王康寧

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，農(nóng)業(yè)部動物抗病營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014)

胰高血糖素樣肽-2對脂多糖應(yīng)激的IPEC-J2細(xì)胞形態(tài)和緊密連接相關(guān)基因表達(dá)的影響

余長松，賈 剛*，鄧秋紅，陳小玲，趙 華，劉光芒，王康寧

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，農(nóng)業(yè)部動物抗病營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014)

本研究旨在考察胰高血糖素樣肽-2(Glucagons-like peptide-2，GLP-2)和脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)對仔豬空腸上皮細(xì)胞及其緊密連接(Tight Junctions，TJ)相關(guān)蛋白基因表達(dá)的影響，并探討GLP-2調(diào)控仔豬腸道TJ蛋白基因表達(dá)可能的作用機(jī)理。試驗(yàn)一設(shè)對照、GLP-2、LPS、LPS+GLP-2 共4個組，考查各處理對IPEC-J2細(xì)胞形態(tài)和緊密連接關(guān)鍵蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1基因表達(dá)的影響。結(jié)果：添加100 nmol·L-1GLP-2能顯著改善IPEC-J2細(xì)胞形態(tài)，顯著提高Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA表達(dá)(P<0.01)；100 μg·mL-1LPS處理能顯著破壞細(xì)胞形態(tài)、降低IPEC-J2細(xì)胞緊密連接蛋白mRNA的表達(dá)(P<0.01)；在添加LPS基礎(chǔ)上添加100 nmol·L-1GLP-2能有效維護(hù)細(xì)胞形態(tài)，顯著增加IPEC-J2細(xì)胞TJ相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達(dá)(P<0.01)，增加量分別為46.3%、65.1%和30.3%。試驗(yàn)二考察了添加PI3K特異性抑制劑Wortmannin(Wort)和LY294002(LY)阻斷PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑后Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA表達(dá)量的變化，試驗(yàn)共設(shè)對照、GLP-2、GLP-2+Wort、GLP-2+LY等4個組。結(jié)果：添加抑制劑Wort后可顯著降低IPEC-J2細(xì)胞Akt、mTOR、Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達(dá)(P<0.01)，降低量分別為46.9%、50.5%，38.1%、49.6%和18.9%；添加 LY后上述mRNA的表達(dá)量分別顯著降低了67.2%、70.8%，49.6%、60.9%和25.8%(P<0.01)。以上結(jié)果表明：添加GLP-2能夠有效抑制LPS應(yīng)激對IPEC-J2細(xì)胞形態(tài)和TJ相關(guān)基因表達(dá)的損傷，PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能是GLP-2調(diào)控腸道緊密連接蛋白基因表達(dá)的重要信號通路之一。

胰高血糖素樣肽-2；脂多糖；仔豬空腸上細(xì)胞IPEC-J2；緊密連接；PI3K-Akt-mTOR

仔豬斷奶時受到的應(yīng)激，特別是免疫應(yīng)激，能對仔豬腸道緊密連接(TJ)以及屏障功能產(chǎn)生不利影響，進(jìn)而嚴(yán)重地影響到仔豬健康以及生產(chǎn)性能[1-3]。斷奶應(yīng)激導(dǎo)致仔豬腸道屏障功能受損與腸道TJ表達(dá)水平下降以及蛋白結(jié)構(gòu)重排有重要關(guān)系[4]。GLP-2屬于胰高血糖素原衍生肽類，其氨基酸序列在哺乳動物中具有高度的保守性[5-6]，能通過多條細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑最終促進(jìn)正常小腸的生長和病理性腸黏膜的恢復(fù)[7]。GLP-2不僅能夠有效促進(jìn)腸道細(xì)胞的增殖、分化，抑制細(xì)胞的凋亡[8-9]，還能降低腸道上皮細(xì)胞的通透性，提高腸道的屏障功能[10-11]。 PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是參與調(diào)控腸道TJ表達(dá)和屏障功能的一條重要途徑，同時也是GLP-2調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的重要細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[12-13]。然而，也有研究表明GLP-2在調(diào)控部分細(xì)胞的增殖和生長中并沒有通過PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[14]。因此，在仔豬腸上皮細(xì)胞中，GLP-2能否通過PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，上調(diào)下游TJ蛋白基因的表達(dá)尚不清楚，有待深入研究。IPEC-J2細(xì)胞作為未分化的細(xì)胞系，建立于仔豬空腸上皮，能準(zhǔn)確代表正常生理情況下的斷奶仔豬腸上皮細(xì)胞，而脂多糖(LPS)是仔豬斷奶過程中造成免疫應(yīng)激的一種重要誘發(fā)因子，是引起細(xì)胞免疫損傷的常用誘發(fā)劑[15]。

本試驗(yàn)將以仔豬空腸上皮細(xì)胞IPEC-J2為模型，探究GLP-2對LPS應(yīng)激的IPEC-J2細(xì)胞形態(tài)和TJ基因表達(dá)的保護(hù)效應(yīng)，探討GLP-2是否通過PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控TJ基因的表達(dá)，研究結(jié)果可幫助人們認(rèn)識腸道損傷、腸道屏障功能變化的分子機(jī)制，也為今后應(yīng)用GLP-2改善腸道屏障功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、主要試劑及儀器

IPEC-J2細(xì)胞系，建立于出生后24 h內(nèi)的仔豬空腸上皮細(xì)胞。由丹麥哥本哈根大學(xué)生命科學(xué)院人類營養(yǎng)系Per Sangild教授惠贈。

GLP-2(純度≥95%，Phoenix pharmaceuticals，美國)；LPS (Sigma，L2880)；Wortmannin (Beyotime，S1952)；LY294002(Beyotime，S1737)；胰島素(Sigma，I5500)；EGF(Peprotech，100-15)；ITS-G(Gibco，41400-045)；Trizol(TaKaRa)；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，RR047A)；實(shí)時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa，RR820A)。其他常用試劑為國產(chǎn)分析純或者進(jìn)口分裝試劑。

Ⅱ型注水式CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)、1300-SERIES-A2生物安全柜(Thermo)、A200型倒置相差多功能生物顯微鏡及全自動顯微攝影裝置(Zeiss)、RT-PCR儀(Effendorf)、CFX-96熒光定量PCR儀(Bio-Rad)、DU520分光光度計(Beckman)、UV-1100/1200紫外可見分光光度計(上海美譜達(dá))等。

1.2 試驗(yàn)內(nèi)容

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計 試驗(yàn)一采用單因子設(shè)計，共設(shè)4個處理，每個處理4個重復(fù)，每個重復(fù)1孔，詳見表1。試驗(yàn)二采用單因子設(shè)計，共設(shè)4個處理，每個處理4個重復(fù)，每個重復(fù)1孔，詳見表2。

表1 試驗(yàn)1設(shè)計方案

Table 1 The design of trial 1

處理Treatment對照組ControlLPS處理組LPSGLP-2處理組GLP-2LPS+GLP-2處理組LPS+GLP-2LPS/(μg·mL-1)01000100GLP-2/(nmol·L-1)00100100

表2 試驗(yàn)2設(shè)計方案

Table 2 The design of trial 2

處理Treatment對照組ControlGLP-2組GLP-2GLP-2+Wort組GLP-2+WortGLP-2+LY組GLP-2+LYGLP-2/(nmol·L-1)0100100100Wortmanin/(nmol·L-1)00100LY294002/(μmol·L-1)00010

1.2.2 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng) IPEC-J2細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)、傳代。細(xì)胞培養(yǎng)于T 75 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(89% DMEM/F12培養(yǎng)液，5%胎牛血清，5% ITS-G，1%青鏈霉素混合液，10 ng·mL-1EGF)，隔天換液，80%融合時用0.25%的胰酶-EDTA消化液傳代。培養(yǎng)瓶二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2，95%濕度，定期觀察細(xì)胞貼壁、增殖等生長情況。取處于對數(shù)生長期的生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)中均采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞處理 取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰蛋白酶常規(guī)消化計數(shù)接種至6孔板上(1×105個·孔-1)，完全匯合后棄掉原培養(yǎng)液，37 ℃預(yù)熱PBS洗滌3次，含抑制劑處理組加入37 ℃預(yù)熱的只含有相應(yīng)濃度抑制劑的DMEM/F12培養(yǎng)液，同時其余處理組加入DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h，而后根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計替換為37 ℃預(yù)熱試驗(yàn)用培養(yǎng)液，于37 ℃，5% CO2，95%濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h(激酶基因表達(dá))或24 h(緊密連接基因表達(dá))。

1.2.4 樣品收集 將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出后棄去培養(yǎng)液，用預(yù)熱的PBS輕輕洗滌兩次，加入Trizol(1 mL·孔-1)裂解液，仔細(xì)吹打后收集于1.5 mL無菌EP管中保存于-80 ℃用于基因相對表達(dá)量的測定。

1.2.5 考察指標(biāo)及方法

1.2.5.1 各處理組IPEC-J2細(xì)胞形態(tài)觀察：使用A200型倒置相差多功能生物顯微鏡及全自動顯微攝影裝置，AxioVision Rel.4.6程序觀察各處理組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.5.2 細(xì)胞Akt、mTOR、Occludin、Claudin-1和ZO-1基因的相對表達(dá)量：Akt、mTOR作為PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要信號激酶，其基因表達(dá)量的變化表明該途徑的活化狀態(tài)，采用實(shí)時熒光定量PCR法測定Akt、mTOR、Occludin、Claudin-1和ZO-1的相對表達(dá)量。(1)總RNA的提取和cDNA的合成：細(xì)胞總RNA提取按照Trizol試劑說明書進(jìn)行，提取的總RNA最后溶解于DEPC處理水，使用核酸蛋白質(zhì)檢測儀測定總RNA OD260 nm/OD280 nm的值為1.8～2.0，說明提取的RNA純度較高并經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性后采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系為5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，Total RNA 2.0 μL，RNase Free dH2O 5.0 μL。反應(yīng)條件:42 ℃ 2 min(去除基因組DNA反應(yīng))。上樣反應(yīng)液 10.0 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 μL，5×PrimeScript Buffer 2 (for real-time) 4.0 μL，RNase Free dH2O→反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)) →85 ℃ 5 s (反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))，4 ℃保存。(2)實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)：使用CFX-96 real-time PCR系統(tǒng)，按照SYBR?PremixExTaqTMII(Tli RNaseH Plus)步驟采用兩步法進(jìn)行。參照NCBI提供的目的基因序列，采用Primer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計，引物合成委托上海生工生物工程公司。各基因引物序列及退火溫度見表3。PCR反應(yīng)體系(25 μL)為：SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus) (2×) 12.5 μL，PCR Forward Primer(10 μmol·L-1) 1.0 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol·L-1) 1.0 μL，DNA模板(<100 ng) 2.0 μL，dH2O 8.5 μL。采用兩步法并參考試劑盒說明步驟，根據(jù)Ct值最小以及熒光信號強(qiáng)度最大確定反應(yīng)條件。PCR循環(huán)反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，各基因退火溫度30 s，循環(huán)40次；95 ℃ 10 s，隨后進(jìn)行熔解曲線分析，溫度以0.5 ℃/5 s的速率從65 ℃遞增到95 ℃。采用雙△Ct +標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率校正法，采用l0倍梯度稀釋法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個樣品4個重復(fù)，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。計算公式為相對表達(dá)量=2-△△Ct，△△Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)試驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。

表3 基因擴(kuò)增引物序列及退火溫度

Table 3 Gene primers sequence and annealing temperature

基因GeneGenBank登錄號AccessionNo.引物序列(5'→3')Primersequence退火溫度/℃Tm產(chǎn)物大小/bpSizeGAPDHNM_001206359.1Forward:GATGGTGAAGGTCGGAGTGAACReversed:TGGGTGGAATCATACTGGAACA60.9153OccludinNM_001163647.2Forward:ACGAGCAGCAAAGGGATTCTTCReversed:TCACACCCAGGATAGCACTCATT61.2152Claudin-1NM_001244539.1Forward:TGCCTCAGTGGAAGATTTACTCCReversed:TGGTGTTCAGATTCAGCAAGGA60.1147ZO-1XM_005659811.1Forward:AGTTTGATAGTGGCGTTGACACReversed:GCTGAAGGACTCACAGGAACA60.0106AktNM_001159776.1Forward:GCACAAACGAGGCGAGTAReversed:CAGCGGATGATGAAGGTGTT61.4195mTORXM_003127584.4Forward:GGATGCTGGTGTCCTTTGTGAReversed:TGCTCTGGATGGAGGTGTTCAT60.09102

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有指標(biāo)均以孔為統(tǒng)計單位。采用Excel對測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理之后，用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果以相對表達(dá)量“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，P<0.05為顯著水平，P<0.01為極顯著水平。

2 結(jié) 果

2.1 GLP-2與LPS對IPEC-J2細(xì)胞形態(tài)的影響

各處理組IPEC-J2細(xì)胞形態(tài)結(jié)果如圖1所示，與對照組相比，添加100 nmol·L-1GLP-2后細(xì)胞邊界亮度增強(qiáng)，細(xì)胞大小形態(tài)更為勻稱，細(xì)胞密度增大，表明細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接更為緊密；添加100 μg·mL-1LPS后部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜模糊化，細(xì)胞間喪失連接失去原有形態(tài)，處理24 h后細(xì)胞萎縮脫落死亡，細(xì)胞形態(tài)與整體性受到嚴(yán)重破壞；在100 μg·mL-1LPS處理的基礎(chǔ)上添加100 nmol·L-1GLP-2后細(xì)胞形態(tài)能夠得到有效的恢復(fù)，與100 μg·mL-1LPS組相比，細(xì)胞形態(tài)顯著改善，表明GLP-2能夠有效地抑制LPS對IPEC-J2細(xì)胞形態(tài)造成的破壞，維護(hù)細(xì)胞正常形態(tài)。

2.2 GLP-2與LPS對緊密連接蛋白mRNA相對表達(dá)量的影響

實(shí)時熒光定量檢測的基因相對表達(dá)量結(jié)果如表4所示。與對照組相比100 nmol·L-1GLP-2處理可顯著增加IPEC-J2細(xì)胞Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達(dá)(P<0.01)，分別比對照組增加了148%、261%和54%； 100 μg·mL-1LPS處理顯著降低了IPEC-J2細(xì)胞Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達(dá)(P<0.01)，降低量分別為46%、57%和34%；在100 μg·mL-1LPS處理的基礎(chǔ)上添加100 nmol·L-1GLP-2能顯著地抑制由LPS造成的IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)量的下降(P<0.01)，與LPS組相比，添加100 nmol·L-1GLP-2后Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達(dá)量分別增加了46.3%、65.1%和30.3%。

圖1 GLP-2和LPS對IPEC-J2細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.1 Effects of GLP-2 and LPS on the morphology of IPEC-J2 cells

表4 GLP-2和LPS對IPEC-J2細(xì)胞Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA相對表達(dá)量的影響

Table 4 Effects of GLP-2 and LPS on the mRNA relative expression ofOccludin，Claudin-1 andZO-1 in IPEC-J2 cells

基因Gene處理組Treatment對照組ControlLPS組LPSGLP-2組GLP-2LPS+GLP-2組LPS+GLP-2Occludin1.00±0.040.54±0.06**2.48±0.07**0.79±0.08**Claudin-11.00±0.020.43±0.04**3.61±0.08**0.71±0.10**ZO-11.00±0.030.66±0.05**1.54±0.05**0.86±0.04**

**.P<0.01.The same as Table 5

2.3 GLP-2與抑制劑對Akt、mTOR和緊密連接蛋白mRNA相對表達(dá)量的影響

圖2和表5反映了GLP-2和兩種抑制劑對IPEC-J2細(xì)胞PI3K-Akt-mTOR途徑重要信號激酶Akt、mTOR和緊密連接蛋白 mRNA相對表達(dá)量的影響。可以看出，100 nmol·L-1GLP-2處理顯著增加了IPEC-J2細(xì)胞Akt、mTORmRNA的表達(dá)(P<0.01)，增加量分別為378%、490%；而相對應(yīng)的下游Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達(dá)也分別增加了160%、270%和59%，說明GLP-2可能激活了PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。而添加兩種抑制劑驗(yàn)證時結(jié)果表明，10 nmol·L-1Wort能夠顯著地抑制由100 nmol·L-1GLP-2處理造成的Akt以及下游mTORmRNA的增加，降低量分別為46.9%、50.5%；而Occludin、Claudin-1和

表5 阻斷劑對GLP-2處理的IPEC-J2細(xì)胞Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA相對表達(dá)量的影響

Table 5 Effects of signaling inhibitors on the relative mRNA expression ofOccludin，Claudin-1 andZO-1 in IPEC-J2 cells

基因Gene處理組Treatment對照組ControlGLP-2組GLP-2GLP-2+Wort組GLP-2+WortGLP-2+LY組GLP-2+LYOccludin1.00±0.042.60±0.08**1.61±0.05**1.31±0.04**Claudin-11.00±0.063.71±0.06**1.87±0.05**1.45±0.05**ZO-11.00±0.051.59±0.07**1.29±0.07**1.18±0.08**

ZO-1 mRNA的表達(dá)同樣受到抑制，降低量分別為38.1%、49.6%和18.9%。與Wort類似，添加10 μmol·L-1LY同樣能夠顯著降低100 nmol·L-1GLP-2處理造成的Akt以及下游mTORmRNA的增加，降低量分別為67.2%、70.8%，Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達(dá)也受到抑制，降低量分別為49.6%、60.9%和25.8%。

**P<0.01圖2 阻斷劑對GLP-2處理的IPEC-J2細(xì)胞Akt和mTOR mRNA相對表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of signaling inhibitors on the relative mRNA expression of Akt and mTOR in IPEC-J2 cells

3 討 論

3.1 LPS免疫應(yīng)激對仔豬腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白mRNA表達(dá)的影響

在LPS對IPEC-J2細(xì)胞上的研究表明，LPS能造成細(xì)胞炎性細(xì)胞因子大量增加，誘發(fā)細(xì)胞炎性反應(yīng)[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IPEC-J2細(xì)胞遭受LPS造成的免疫應(yīng)激時，細(xì)胞緊密連接關(guān)鍵蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1的mRNA表達(dá)水平顯著下降，表明LPS能造成IPEC-J2細(xì)胞緊密連接的嚴(yán)重破壞進(jìn)而破壞細(xì)胞形態(tài)。Y.Hou等[18]研究發(fā)現(xiàn)，LPS能夠顯著降低斷奶仔豬空腸和回腸上皮細(xì)胞中Claudin-1和Occludin的mRNA表達(dá)，此外還能降低空腸總RNA和總蛋白的含量。此外，Y.Liu等[19]研究結(jié)果表明，LPS能夠造成小腸形態(tài)的改變進(jìn)而使小腸上皮的通透性增加，破壞小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)和屏障功能。本研究中還發(fā)現(xiàn)，100 μg·mL-1的LPS免疫應(yīng)激并不能完全破壞IPEC-J2細(xì)胞的整體結(jié)構(gòu)和緊密連接關(guān)鍵蛋白mRNA的表達(dá)。該結(jié)果與M.M.Geens等[20]和C.Arce等[21]的研究結(jié)果一致，說明IPEC-J2細(xì)胞對LPS免疫應(yīng)激具有一定的抵抗能力，在遭遇LPS免疫應(yīng)激后能避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能被徹底破壞。

3.2 GLP-2對應(yīng)激仔豬腸上皮緊密連接蛋白基因表達(dá)的保護(hù)效應(yīng)

C.X.Dong等[22]報道，GLP-2能夠顯著提高小鼠空腸緊密連接關(guān)鍵蛋白Occludin和Claudin-3，7基因的表達(dá)。G.W.Moran等[23]研究發(fā)現(xiàn)，GLP-2不僅能夠顯著增加Caco-2細(xì)胞緊密連接關(guān)鍵蛋白Occludin和ZO-1的表達(dá)，還能有效抑制由TNFα應(yīng)激造成的緊密連接蛋白Occludin和ZO-1表達(dá)量的降低。以上結(jié)果表明，GLP-2能夠有效地促進(jìn)腸上皮細(xì)胞緊密連接的表達(dá)，增強(qiáng)腸道屏障功能。在以IPEC-J2細(xì)胞為研究模型研究GLP-2之前，必須明確的是IPEC-J2細(xì)胞是否存在GLP-2R表達(dá)，本研究前期試驗(yàn)證明了該細(xì)胞存在GLP-2R的表達(dá)，GLP-2可能對IPEC-J2細(xì)胞產(chǎn)生作用。本試驗(yàn)在仔豬空腸細(xì)胞模型上的研究結(jié)果表明，GLP-2能夠顯著地改善正常培養(yǎng)條件下IPEC-J2細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高緊密連接關(guān)鍵蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1基因的表達(dá)。此外，GLP-2還能有效的抑制LPS應(yīng)激造成的IPEC-J2細(xì)胞形態(tài)的破壞和緊密連接關(guān)鍵蛋白基因表達(dá)量的下降。該結(jié)果提示，GLP-2能促進(jìn)健康仔豬腸道上皮細(xì)胞緊密連接基因的表達(dá)，有效的抑制LPS造成的免疫應(yīng)激，維護(hù)上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，能作為未來緩解仔豬斷奶應(yīng)激的一種理想營養(yǎng)手段。

3.3 GLP-2通過PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞緊密連接

C.I.Cheeseman[24]研究表明，GLP-2能夠通過增加小鼠空腸刷狀緣膜鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的含量從而促進(jìn)空腸的生長發(fā)育，進(jìn)一步使用PI3K特異性抑制劑Wortmannin研究表明GLP-2的促蛋白表達(dá)和促細(xì)胞生長的作用效應(yīng)可能通過了PI3K。B.Yusta等[25]研究表明，GLP-2能夠通過PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)到途徑促進(jìn)幼倉鼠腎上皮細(xì)胞的生長抑制細(xì)胞的凋亡。X.Shi等[26]研究表明，GLP-2能夠通過PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，從而確定了mTOR在GLP-2促進(jìn)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)中的重要地位。

然而，J.A.Koehler等[27]研究報道，GLP-2并沒有通過PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控小鼠或人結(jié)腸癌細(xì)胞的生長和存活。該研究提示我們，不是在所有的細(xì)胞或組織中GLP-2都能通過PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控細(xì)胞的生長，細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)。因此，明確PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在GLP-2調(diào)控仔豬空腸上皮細(xì)胞緊密連接基因表達(dá)中的作用具有重要的研究意義。本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，GLP-2能夠顯著的增加PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑重要激酶Akt和mTOR基因的表達(dá)，其作用不僅增加了相應(yīng)該信號分子蛋白的表達(dá)，更重要的是增加了信號分子蛋白被磷酸化的可能，下游緊密連接關(guān)鍵蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1基因的表達(dá)量也相應(yīng)提高。在進(jìn)行細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究時，在細(xì)胞正常狀態(tài)下、在關(guān)鍵位點(diǎn)使用兩種抑制劑或激活劑能更準(zhǔn)確檢測出該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否參與信號物質(zhì)的傳導(dǎo)[28]。本研究使用PI3K特異性抑制劑Wortmannin和LY294002阻斷PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑后Akt和mTOR基因表達(dá)量顯著下降，而下游緊密連接關(guān)鍵蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1的基因表達(dá)量的提高量顯著下降。本試驗(yàn)結(jié)果與X.Shi等[29]的研究結(jié)果一致，提示我們PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是GLP-2調(diào)節(jié)細(xì)胞緊密連接基因表達(dá)的重要信號途徑之一。

4 結(jié) 論

GLP-2能夠提高正常培養(yǎng)條件下IPEC-J2細(xì)胞緊密連接基因的表達(dá)量、改善細(xì)胞形態(tài)，而且能夠有效抑制LPS應(yīng)激造成的IPEC-J2細(xì)胞緊密連接基因的表達(dá)量的降低和細(xì)胞形態(tài)的破壞，從而提高IPEC-J2細(xì)胞抵抗LPS應(yīng)激的能力；GLP-2能通過PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控IPEC-J2細(xì)胞緊密連接基因的表達(dá)，PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能是GLP-2調(diào)控仔豬空腸上皮細(xì)胞緊密連接基因表達(dá)的重要途徑之一。

[1] NIEKAMP S R，SUTHERLAND M A，DAHL G E，et al.Immune responses of piglets to weaning stress：Impacts of photoperiod[J].JAnimSci，2007，85(1)：93-100.

[2] SMITH F，CLARK J E，OVERMAN B L，et al.Early weaning stress impairs development of mucosal barrier function in the porcine intestine[J].AmJPhysiol-GastrL，2010，298(3)：G352-G363.

[3] ZHAO Y，QIN G，SUN Z，et al.Effects of soybean agglutinin on intestinal barrier permeability and tight junction protein expression in weaned piglets[J].IntJMolSci，2011，12(12)：8502-8512.

[4] 劉海萍，胡彩虹，徐 勇.早期斷奶對仔豬腸通透性和腸上皮緊密連接蛋白 Occludin mRNA 表達(dá)的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報，2008，20(4)：442-446. LIU H P，HU C H，XU Y.Effects of early weaning on intestinal permeability and tight junction protein occludin mRNA expression levels of piglets[J].ChineseJournalofAnimalNutrition，2008，20(4)：442-446.(in Chinese)

[5] SIGALET D L，DE HEUVEL E，WALLACE L，et al.Effects of chronic glucagon-like peptide-2 therapy during weaning in neonatal pigs[J].RegulPeptides，2014，188：70-80.

[6] NAIMI R M，MADSEN K B，ASKOV-HANSEN C，et al.A dose-equivalent comparison of the effects of continuous subcutaneous glucagon-like peptide 2 (GLP-2) infusions versus meal related GLP-2 injections in the treatment of short bowel syndrome (SBS) patients[J].RegulPeptides，2013，184：47-53.

[7] SHI X，WEN S，CHANG B，et al.GLP-2 receptor is required for glucose homeostasis and energy balance[J].FASEBJ，2013，27：1160.

[8] PETERSEN Y M，HARTMANN B，HOLST J J，et al.Introduction of enteral food increases plasma GLP-2 and decreases GLP-2 receptor mRNA abundance during pig development[J].JNutr，2003，133(6)：1781-1786.

[9] BURRIN D G，PETERSEN Y，STOLL B，et al.Glucagon-like peptide 2：a nutrient-responsive gut growth factor[J].JNutr，2001，131(3)：709-712.

[10] BENJAMIN M A，MCKAY D M，YANG P C，et al.Glucagon-like peptide-2 enhances intestinal epithelial barrier function of both transcellular and paracellular pathways in the mouse[J].Gut，2000，47(1)：112-119.[11] CAMERON H L，PERDUE M H.Stress impairs murine intestinal barrier function：improvement by glucagon-like peptide-2[J].JPharmacolExpTher，2005，314(1)：214-220.

[12] DONG C X.Mechanisms of glucagon-like peptide-2-mediated effects on intestinal barrier function in health and irinotecan-induced enteritis[D].Toronto，Ontario，Canada：University of Toronto，2013.

[13] GU M J，SONG S K，PARK S M，et al.Bacillus subtilis protects porcine intestinal barrier from deoxynivalenol via improved zonula occludens-1 expression[J].Asian-AustJAnimSci，2014，27(4)：580-586.

[14] KOEHLER J A，HARPER W，BARNARD M，et al.Glucagon-like peptide-2 does not modify the growth or survival of murine or human intestinal tumor cells[J].CancerRes，2008，68(19)：7897-7904.

[15] JIANG Z Y，SUN L H，LIN Y C，et al.Effects of dietary glycyl-glutamine on growth performance，small intestinal integrity，and immune responses of weaning piglets challenged with lipopolysaccharide[J].JAnimSci，2009，87(12)：4050-4056.

[16] PASZTI-GERE E，MATIS G，F(xiàn)ARKAS O，et al.The effects of intestinal LPS exposure on inflammatory responses in a porcine enterohepatic co-culture system[J].Inflammation，2014，37(1)：247-260.

[17] RAZZUOLI E，VILLA R，AMADORI M.IPEC-J2 cells as reporter system of the anti-inflammatory control actions of interferon-alpha[J].JInterfCytokRes，2013，33(10)：597-605.

[18] HOU Y，WANG L，ZHANG W，et al.Protective effects of N-acetylcysteine on intestinal functions of piglets challenged with lipopolysaccharide[J].AminoAcids，2012，43(3)：1233-1242.

[19] LIU Y，HUANG J，HOU Y，et al.Dietary arginine supplementation alleviates intestinal mucosal disruption induced byEscherichiacolilipopolysaccharide in weaned pigs[J].BritJNutr，2008，100(3)：552-560.[20] GEENS M M，NIEWOLD T A.Preliminary characterization of the transcriptional response of the porcine intestinal cell line IPEC-J2 to enterotoxigenicEscherichiacoli，Escherichiacoli，andE.colilipopolysaccharide[J].CompFunctGenomics，2010，2010：469583.

[21] ARCE C，RAMIREZ-BOO M，LUCENA C，et al.Innate immune activation of swine intestinal epithelial cell lines (IPEC-J2 and IPI-2I) in response to LPS fromSalmonellatyphimurium[J].CompImmunolMicrob，2010，33(2)：161-174.

[22] DONG C X，ZHAO W，SOLOMON C，et al.The intestinal epithelial insulin-like growth factor-1 receptor links glucagon-like peptide-2 action to gut barrier function[J].Endocrinology，2013，155(2)：370-379.

[23] MORAN G W，O′NEILL C，MCLAUGHLIN J T.GLP-2 enhances barrier formation and attenuates TNFα-induced changes in a Caco-2 cell model of the intestinal barrier[J].RegulPeptides，2012，178(1)：95-101.

[24] CHEESEMAN C I.Upregulation of SGLT-1 transport activity in rat jejunum induced by GLP-2 infusioninvivo[J].AmJPhysiol-RegI，1997，273(6)：R1965-R1971.

[25] YUSTA B，ESTALL J，DRUCKER D J.Glucagon-like peptide-2 receptor activation engages bad and glycogen synthase kinase-3 in a protein kinase A-dependent manner and prevents apoptosis following inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase[J].JBiolChem，2002，277(28)：24896-24906.

[26] SHI X，LI X，WANG Y，et al.Glucagon-like peptide-2-stimulated protein synthesis through the PI 3-kinase-dependent Akt-mTOR signaling pathway[J].AmnJPhysiol-EndocM，2011，300(3)：E554-E563.

[27] KOEHLER J A，HARPER W，BARNARD M，et al.Glucagon-like peptide-2 does not modify the growth or survival of murine or human intestinal tumor cells[J].CancerRes，2008，68(19)：7897-7904.

[28] NAN L，JOSEF N.Glutamine deprivation alters intestinal tight junctions via a PI3-K/Akt mediated pathway in Caco-2 cells[J].JNutr，2009，139(4)：710-714.[29] SHI X，ZHOU F，LI X，et al.Central GLP-2 enhances hepatic insulin sensitivity via activating PI3K signaling in POMC neurons[J].CellMetab，2013，18(1)：86-98.

(編輯 郭云雁)

The Effects of GLP-2 on Cell Morphology and the Gene Expression of Tight Junction in LPS Stressed IPEC-J2 Cells

YU Chang-song，JIA Gang*，DENG Qiu-hong，CHEN Xiao-ling，ZHAO Hua，LIU Guang-mang，WANG Kang-ning

(KeyLaboratoryofAnimalDisease-resistantNutritionandFeedofMinistryofAgriculture，AnimalNutritionInstitute，SichuanAgriculturalUniversity，Ya’an625014，China)

The purpose of this research was to investigate the effect of glucagon-like peptide-2(GLP-2) and lipopolysaccharide (LPS) on the gene expression of tight junction in piglets jejunum epithelial IPEC-J2 cells and to deeply discuss the possible mechanism of GLP-2 regulating the expression of intestinal TJ gene of the piglet.Trial 1，single factor design was adopted and 4 treatments(control，GLP-2，LPS，LPS+GLP-2) were used to test the effect of GLP-2 and LPS on the mRNA expression ofOccludin，Claudin-1 andZO-1 in IPEC-J2 cells.The results showed that：100 nmol·L-1GLP-2 could improve cellular morphology and significantly increase the expression level ofOccludin，Claudin-1 andZO-1 mRNA in IPEC-J2 cell (P<0.01)；100 μg·mL-1LPS could significantly destroy cellular morphology and significantly reduce the mRNA expression of TJ in IPEC-J2 cells (P<0.01).LPS with 100 nmol·L-1GLP-2 could improve cellular morphology and significantly increase the expression ofOccludin，Claudin-1 andZO-1 mRNA in IPEC-J2 cell (P<0.01) for 46.3%，65.1% and 30.3%，respectively.Trial 2，PI3K specific inhibitor，Wortmannin (Wort) and LY294002 (LY)，were added to investigate whether GLP-2 modulates TJ’s mRNA expression in IPEC-J2 cells through PI3K-Akt-mTOR signal transduction pathway.Four treatments(control，GLP-2，GLP-2+Wort，GLP-2+LY) were designed.The results showed that：100 nmol·L-1GLP-2 with 10 nmol·L-1Wort could significantly decrease the expression ofAkt，mTOR，Occludin，Claudin-1 andZO-1 mRNA in IPEC-J2 cells (P<0.01) for 46.9%，50.5%，38.1%，49.6% and 18.9%，respectively；GLP-2 with LY could significantly decrease the expression ofAkt，mTOR，Occludin，Claudin-1 andZO-1 mRNA in IPEC-J2 cells (P<0.01) for 67.2%，70.8%，49.6%，60.9% and 25.8%，respectively.In summary，the results showed that GLP-2 can effectively inhibit the damnification of TJ mRNA expression by LPS.GLP-2 may modulate TJ’s mRNA expression through PI3K-Akt-mTOR signal transduction pathway in IPEC-J2 cells.

glucagon-like peptide-2；lipopolysaccharide；piglet intestinal epithelial cell jejunum 2；tight junctions；PI3K-Akt-mTOR

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.012

2014-06-20

四川省杰出青年基金(2010JQ0043)；教育部博士點(diǎn)基金(2015103110011)

余長松(1988-)，男，四川樂山人，碩士，主要從事飼料資源開發(fā)與高效利用研究，E-mail:yuchangsong0327@163.com

*通信作者：賈 剛，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：jiagang700510@163.com

S828；S815

A

0366-6964(2015)04-0592-08