李 妍，侯金龍，牛棟梁， 姜 勝，時(shí) 靜，范宏剛，王洪斌

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑對(duì)大鼠各腦區(qū)p-p38蛋白及c-mycmRNA表達(dá)的影響

李 妍#，侯金龍#，牛棟梁， 姜 勝，時(shí) 靜，范宏剛，王洪斌*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

旨在研究小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑對(duì)大鼠不同腦區(qū)p-p38蛋白及c-mycmRNA表達(dá)的影響，探討小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑的催醒機(jī)制。將18只大鼠隨機(jī)分為C組(對(duì)照組)、J組(麻醉頡頏劑組)。J組又分為2個(gè)亞組，即J1組(注射小型豬專用復(fù)合麻醉頡頏劑5 min)、J2 組(注射小型豬專用復(fù)合麻醉頡頏劑1 h)。各組大鼠到達(dá)相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)后斷頭處死，分離大腦皮層、小腦、海馬、腦干和丘腦，用Western blot的方法檢測(cè)p-p38蛋白的表達(dá)量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)c-myc基因mRNA的轉(zhuǎn)錄量。試驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠大腦皮層、丘腦和腦干的p-p38蛋白和c-mycmRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，而小腦和海馬的p-p38蛋白和c-mycmRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著降低。綜合試驗(yàn)結(jié)果，小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑能夠影響p-p38蛋白和c-mycmRNA的表達(dá)，這可能是其產(chǎn)生催醒作用的機(jī)制之一。

小型豬專用復(fù)合麻醉頡頏劑；催醒機(jī)制；p-p38蛋白；c-mycmRNA

小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑是針對(duì)小型豬復(fù)合麻醉劑(XFM)研制的特異性催醒劑。前期的試驗(yàn)結(jié)果表明該頡頏劑能夠使XFM麻醉狀態(tài)下的小型豬平穩(wěn)蘇醒，無(wú)復(fù)睡現(xiàn)象，且對(duì)機(jī)體生理機(jī)能影響小，安全性較高[1-3]。然而小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑產(chǎn)生催醒作用的機(jī)制尚不明確。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)麻醉劑(如異氟醚、七氟醚和異丙酚等)能夠影響p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，由此推測(cè)p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能與麻醉作用機(jī)制相關(guān)[4-8]。前期的研究表明XFM能夠影響p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游效應(yīng)物c-mycmRNA的轉(zhuǎn)錄[9]。麻醉與催醒是兩個(gè)相對(duì)的藥物作用過(guò)程，小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑產(chǎn)生催醒作用的機(jī)制可能與p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。本試驗(yàn)主要研究小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑對(duì)大鼠不同腦區(qū)p-p38蛋白及c-mycmRNA轉(zhuǎn)錄的影響，探討小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑的催醒機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與催醒作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)外科教研室提供，Trizol試劑(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(東洋紡(上海)生物科技有限公司)，熒光定量PCR試劑(寶生物工程(大連)有限公司)，Mouse Anti-beta Actin Monoclonal Antibody (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)TA-09)、p-p38(Tyr182)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)ZS-101759)、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，Roche Light Cycler 2.0 熒光定量PCR儀，Sigma高速低溫離心機(jī)，Gene Quant 1300紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，電泳儀，酶標(biāo)儀。

1.2 動(dòng)物分組及樣品采集

將18只大鼠隨機(jī)分為C組(對(duì)照組)、J組(頡頏劑組)。J組又分為2個(gè)亞組，即J1組(注射小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑5 min)、J2 組(注射小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑1 h)。每組6只。C組大鼠注射等量的生理鹽水。各組大鼠到達(dá)相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)后分別斷頭處死，取出全腦，迅速置于冰面上，分離大腦皮層、海馬、丘腦、腦干和小腦等部位，置于DEPC處理過(guò)的凍存管中，液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 Western blot測(cè)定p-p38的含量 采用BCA法測(cè)定各腦區(qū)總蛋白濃度，吸取樣品，使每孔加入樣品量為25 μg，加入樣品緩沖液補(bǔ)足至20 μL，置于EP管中，沸水煮5 min，置于-80 ℃環(huán)境中，備用。以兔抗大鼠p-p38為一抗(1∶400稀釋)，辣根酶標(biāo)記羊抗兔Ig為二抗(1∶3 000 稀釋)，采用底物增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光ECL法顯色，用X光片壓片或者凝膠成像系統(tǒng)曝光。應(yīng)用Gel-Pro analyzer 4軟件進(jìn)行光密度掃描定量，目的蛋白光密度值/內(nèi)參光密度值，得到各組蛋白條帶相對(duì)值進(jìn)行比較。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)c-mycmRNA轉(zhuǎn)錄 采用Trizol法提取各腦區(qū)組織中總RNA，并用分光光度計(jì)測(cè)OD260 nm/OD280 nm的比值，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確定產(chǎn)物。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，反轉(zhuǎn)錄總RNA得到第一鏈cDNA。根據(jù)GenBank中大鼠的β-actin(NM_031144.3)、c-myc(NM_012603.2)的基因序列，利用Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，β-actin上下游引物分別為：5′-AGGGAAA-TCGTGCGTGACAT-3′，5′-CCTCGGGGCATCGGAA-3′，擴(kuò)增片段為163 bp；c-myc上下游引物分別為：5′-CGACAGTCACGACGATGCC-3′，5′-CT-GCTGTTGCTGGTGATAGA -3′，擴(kuò)增片段為125 bp；由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各腦區(qū)p-p38蛋白的含量

大鼠注射小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑5min后，大腦皮層和腦干p-p38蛋白的表達(dá)量顯著升高，與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，海馬p-p38蛋白的表達(dá)量顯著降低，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；大鼠注射小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑1h后，大腦皮層p-p38蛋白的表達(dá)量恢復(fù)到正常水平，與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，腦干p-p38蛋白的表達(dá)量顯著升高，與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，小腦p-p38蛋白的表達(dá)量顯著降低，與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，丘腦p-p38蛋白的表達(dá)量顯著升高，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，海馬p-p38蛋白的表達(dá)量恢復(fù)到正常水平，與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果如圖1、表1所示。

圖1 大鼠腦干β-actin和p-p38蛋白免疫印跡結(jié)果Fig.1 The β-actin and p-p38 protein expression of brainstem

組別Group大腦皮層Cerebralcortex小腦Cerebellum海馬Hippocampus腦干Brainstem丘腦ThalamusC組 Cgroup0.31±0.030.34±0.040.13±0.031.54±0.081.41±0.08J1組 J1group0.53±0.11B0.25±0.030.06±0.02A2.49±0.04B1.52±0.06J2組 J2group0.35±0.030.18±0.06B0.16±0.033.58±0.31B1.54±0.03A

與對(duì)照組相比，A表示差異顯著(P<0.05)，B表示差異極顯著(P<0.01)。下表同

Compared with control group，A represented the difference is significant (P<0.05),B represented the difference is very significant (P<0.01).The same as follows

2.2 RNA純度及完整性的鑒定結(jié)果

提取的總RNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，可見(jiàn)28S、18S及5S RNA條帶較清晰，說(shuō)明總RNA無(wú)明顯降解，每個(gè)樣品測(cè)OD260 nm/OD280 nm均在1.8～2.0，說(shuō)明RNA樣品質(zhì)量符合實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)要求。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果

取Real Time PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，產(chǎn)物條帶清晰，且實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物無(wú)引物二聚體和雜帶的出現(xiàn)，熔解曲線分析結(jié)果均為單峰，β-actinTm值為86.6 ℃，c-mycTm值為84.8 ℃，證明引物特異性良好，無(wú)非特異性擴(kuò)增。倍比稀釋的 cDNA 標(biāo)準(zhǔn)模板后得標(biāo)準(zhǔn)曲線，β-actin標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.998 1，擴(kuò)增效率為1.016 3；c-myc標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.992 3，擴(kuò)增效率為1.039。結(jié)果如圖2所示。

2.4 中樞神經(jīng)系統(tǒng)c-mycmRNA轉(zhuǎn)錄變化

大鼠注射小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑5 min(J1組)，大腦皮層c-mycmRNA的轉(zhuǎn)錄量顯著升高，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；小腦c-mycmRNA的轉(zhuǎn)錄量顯著降低，與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)；海馬c-mycmRNA的轉(zhuǎn)錄量顯著降低，與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)；腦干和丘腦c-mycmRNA的轉(zhuǎn)錄量顯著升高，與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。大鼠注射小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑1 h后(J2組)，大腦皮層c-mycmRNA恢復(fù)正常水平，與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)；小腦c-mycmRNA的轉(zhuǎn)錄量1 h后(J2組)有所回升，但與對(duì)照組相比，差異顯著(P<0.05)；海馬c-mycmRNA的轉(zhuǎn)錄量1 h后(J2組)有所升高，但未升高到正常水平，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；腦干和丘腦c-mycmRNA的表達(dá)量1 h后(J2組)有所下降，但未下降到正常水平，與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。(表2)

3 討 論

p38蛋白激酶是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的重要成員，可被外界環(huán)境因素如化學(xué)物質(zhì)、熱/滲透性休克、紫外線、氧化失衡，或者某些生理性原因如促有絲分裂/促發(fā)育信號(hào)、神經(jīng)遞質(zhì)、炎性因子等刺激物激活，繼而介導(dǎo)凋亡等細(xì)胞反應(yīng)[10]。p38MAPK主要在MKK的作用下成為有活性的磷酸化p38[11-12]，然后進(jìn)一步將信號(hào)向下游傳遞。c-myc為p38下游信號(hào)分子之一[13]，是調(diào)控細(xì)胞增殖的重要基因，與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化有關(guān)，對(duì)凋亡也起重要作用[14]。

M.DL2000 DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.β-actin PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果；2.c-myc PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果M.DL2000 DNA marker；1.PCR product of β-actin；2.PCR product of c-myc圖2 β-actin、c-myc PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果及擴(kuò)增曲線Fig 2 The product of β-actin，c-myc PCR and the amplification curve

組別Group大腦皮層Cerebralcortex小腦Cerebellum海馬Hippocampus腦干Brainstem丘腦ThalamusC組 Cgroup2.88±0.091.51±0.051.02±0.101.23±0.031.75±0.05J1組 J1group3.13±0.12A1.15±0.06B0.73±0.11B3.79±0.11B2.67±0.08BJ2組 J2group2.76±0.081.40±0.06A0.94±0.07A3.19±0.17B2.45±0.06B

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用，尤其是在學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中。手術(shù)、麻醉等因素能夠引起術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)，研究報(bào)道p38MAPK通路可被應(yīng)激刺激、炎性因子等激活，全身麻醉藥(異氟烷等)誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)，并通過(guò)炎癥因子進(jìn)一步激活p38MAPK通路，從而誘發(fā)新生大鼠的學(xué)習(xí)與記憶功能損害[4]。全身麻醉藥與p38MAPK信號(hào)通路密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)吸入麻醉劑——異氟醚、七氟醚能夠影響大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中p38的表達(dá)[5-6]；此外也有靜脈麻醉劑(異丙酚)對(duì)大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞中p38表達(dá)的影響[7-8]的報(bào)道。綜上，可以看出p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與麻醉機(jī)制存在一定的聯(lián)系。

通過(guò)預(yù)試驗(yàn)，大鼠在注射XFM翻正反射消失后，注射小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑，大鼠翻正反射恢復(fù)的時(shí)間大約為5.2 min，說(shuō)明小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑在這個(gè)時(shí)間范圍內(nèi)發(fā)揮了催醒作用，因此設(shè)定了5 min為頡頏劑組的一個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)，為了觀察小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑的催醒之后的作用，設(shè)定了1 h為頡頏劑組的另一個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)。

在本試驗(yàn)中，大鼠根據(jù)不同組別進(jìn)行處理后，分別注射小型豬專用復(fù)合麻醉頡頏劑在不同的時(shí)間點(diǎn)采取大腦皮層、小腦、海馬、腦干和丘腦，應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)p-p38蛋白的相對(duì)表達(dá)量，試驗(yàn)結(jié)果顯示大腦皮層、丘腦和腦干的p-p38蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，而小腦和海馬的p-p38蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著降低；結(jié)果提示小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑對(duì)大腦皮層、丘腦和腦干的p-p38蛋白的相對(duì)表達(dá)量有促進(jìn)作用，對(duì)小腦和海馬的p-p38蛋白的相對(duì)表達(dá)量有抑制作用。綜合以上分析可知小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑影響腦內(nèi)p-p38蛋白的表達(dá)。有研究表明，靜脈麻醉劑異丙酚能夠降低氨處理大鼠腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞磷酸化p38蛋白的含量，抑制p38MAPK信號(hào)通路的激活[7]，這與本試驗(yàn)中大腦皮層p-p38蛋白的含量升高結(jié)果相反。吸入麻醉劑異氟醚能夠提高海馬腦區(qū)p38蛋白的含量激活p38MAPK信號(hào)通路，從而誘發(fā)大鼠認(rèn)知功能障礙[6]，這與本試驗(yàn)中海馬腦區(qū)p-p38蛋白的含量降低結(jié)果相反。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示大腦皮層、丘腦和腦干的c-mycmRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量顯著升高，而小腦和海馬的c-mycmRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量顯著降低。提示小型豬專用復(fù)合麻醉頡頏劑對(duì)大腦皮層、丘腦和腦干的c-mycmRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量有促進(jìn)作用，對(duì)小腦和海馬的c-mycmRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量有抑制作用。大鼠各腦區(qū)c-mycmRNA的變化趨勢(shì)與p-p38蛋白的變化趨勢(shì)基本一致。以往研究表明，p38MARK可以通過(guò)增強(qiáng)c-myc轉(zhuǎn)錄引起細(xì)胞凋亡[13-14]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑對(duì)大鼠海馬和小腦區(qū)p-p38蛋白表達(dá)和c-mycmRNA轉(zhuǎn)錄均有抑制作用，所以推測(cè)小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑可能通過(guò)降低大鼠海馬和小腦區(qū)p-p38蛋白表達(dá)和c-mycmRNA轉(zhuǎn)錄從而降低對(duì)中樞神經(jīng)的抑制作用，達(dá)到催醒效果。這可能是小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑產(chǎn)生催醒作用的機(jī)制之一。

4 結(jié) 論

小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑能夠降低大鼠海馬和小腦區(qū)p-p38蛋白表達(dá)和c-mycmRNA轉(zhuǎn)錄，這可能是小型豬復(fù)合麻醉頡頏劑催醒XFM麻醉的重要機(jī)制之一。

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(編輯 白永平)

Effect of the Antagonist for the Combined Anaesthetic for Miniature Pigs on p-p38 Protein andc-mycGene in Brain Regions of Rats

LI Yan#，HOU Jin-long#，NIU Dong-liang，JIANG Sheng， SHI Jing，F(xiàn)AN Hong-gang，WANG Hong-bin*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

In order to investigate the effects of antagonist for the Combined Anaesthetic for Miniature Pigs (XFM) on p-p38 protein andc-mycgene in different encephalic region of rats，and discuss the mechanism of XFM antagonist.Eighteen Wistar rats were divided randomly into C (Control group) and J (Antagonist group) group.J group consisted of two subgroups，J1(5 min after rats received the XFM antagonist intraperitoneally) and J2 (1 h after rats received the XFM antagonist intraperitoneally).The brain tissues were collected at each time point.The expression of p-p38 in different brains regions were detected by Western blot.The transcription ofc-mycmRNA in different brains regions were detected by real time PCR.The results showed that the expression of p-p38 andc-mycmRNA in cerebral cortex，thalamus and brain stem increased significantly；the expression of p-p38 andc-mycmRNA in cerebellum and hippocampus decreased significantly.These results indicated that p-p38 protein andc-mycgene were affected by the XFM antagonist，this may be one of the antagonism mechanisms.

antagonist for XFM；antagonism mechanism；p-p38 protein；c-mycmRNA

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.020

2014-04-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272617；31001092)

李 妍(1988-)，女，河南安陽(yáng)人，碩士，主要從事麻醉與鎮(zhèn)痛研究，E-mail：liyan8835@yeah.net；侯金龍(1986-)，男，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事動(dòng)物麻醉研究，E-mail：2680310282@qq.com。二人對(duì)本文同等貢獻(xiàn)，共為第一作者

*通信作者：王洪斌，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：neau1940@yahoo.com.cn

S859.791

A

0366-6964(2015)02-0317-06