劉騰飛，田 靜，耿智霞，李會(huì)敏，余祖功

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095)

抗菌藥物對(duì)LPS誘導(dǎo)雞肝細(xì)胞損傷的影響及復(fù)方甘草酸單胺的修復(fù)效應(yīng)

劉騰飛，田 靜，耿智霞，李會(huì)敏，余祖功*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095)

旨在探索LPS誘導(dǎo)雞肝細(xì)胞損傷過(guò)程中抗菌藥物的影響及復(fù)方甘草酸單胺(CAG)的修復(fù)作用。選用半原位灌流法分離雞肝細(xì)胞，原代培養(yǎng)48 h，篩選LPS最佳致肝細(xì)胞損傷劑量；固定其最佳致?lián)p半量，并添加不同質(zhì)量濃度的恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林，觀察致?lián)p效果；LPS(30 μg·mL-1)+恩諾沙星(80 μg·mL-1)致?lián)p24 h，給予不同濃度CAG，檢測(cè)細(xì)胞存活率及ALT、AST、SOD、GSH、MDA活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明，LPS ≤ 50 μg·mL-1，肝細(xì)胞損傷不明顯，LPS ≥ 60 μg·mL-1，肝細(xì)胞存活率極顯著降低(P<0.01)，ALT、AST活性極顯著升高(P<0.01)。LPS(30 μg·mL-1)各組隨恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林添加量增加，肝細(xì)胞損傷程度相應(yīng)加大，LPS(30 μg·mL-1)+恩諾沙星(80 μg·mL-1)、LPS(30 μg·mL-1)+氟苯尼考(40 μg·mL-1)、LPS(30 μg·mL-1)+阿莫西林(60 μg·mL-1)可達(dá)肝細(xì)胞損傷標(biāo)準(zhǔn)。CAG劑量依賴性(25、50、100、200、400 μg·mL-1)抑制LPS(30 μg·mL-1)+恩諾沙星(80 μg·mL-1)引起的ALT、AST、MDA活性和肝細(xì)胞早期凋亡比率的升高，提高SOD、GSH及肝細(xì)胞存活率。結(jié)果提示，LPS可致肝細(xì)胞損傷；抗菌藥物使LPS更易誘發(fā)肝損傷；CAG通過(guò)抗氧化，并抑制細(xì)胞凋亡對(duì)雞肝細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

LPS；恩諾沙星；氟苯尼考；阿莫西林；復(fù)合式肝細(xì)胞損傷；復(fù)方甘草酸單胺

家禽集約化趨勢(shì)明顯，受困于養(yǎng)殖密度與環(huán)境，大腸桿菌、沙門菌等感染多發(fā)，抗菌藥物廣為使用。諸多類抗菌藥物在殺菌的同時(shí)，會(huì)促進(jìn)內(nèi)毒素釋放，以阿莫西林、頭孢類、氟喹諾酮類、氟苯尼考等報(bào)道促釋明顯[1-2]。內(nèi)毒素即革蘭陰性菌細(xì)胞壁上的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，細(xì)菌裂解或黏附其他細(xì)胞時(shí)釋放，過(guò)量LPS進(jìn)入血液，導(dǎo)致肝損傷[3]。

獸醫(yī)臨床病雞肝損傷癥狀多見(jiàn)，LPS作用明確[3]?？咕幬锸褂门c存在是否影響LPS致肝損傷的發(fā)生、病理及轉(zhuǎn)歸等未見(jiàn)報(bào)道。作者采用體外雞原代肝細(xì)胞培養(yǎng)的方法，探索恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林等對(duì)LPS致肝細(xì)胞損傷的影響，并研究復(fù)方甘草酸單胺(CAG)對(duì)該復(fù)合損傷的保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

40～50日齡健康海藍(lán)公雞，購(gòu)自南京湯泉雞場(chǎng)，體重(1.5±0.2) kg。

1.2 主要藥品、試劑和儀器

恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林(≥99.0%)，浙江國(guó)邦藥業(yè)有限公司。CAG，實(shí)驗(yàn)室自制，每100 g含甘草酸單胺2.8 g(西安富捷藥業(yè)有限公司)，甘氨酸和蛋氨酸各2 g(南寧贏創(chuàng)藥業(yè)有限公司)。膠原酶(Ⅳ型)、牛胰島素、MTT、內(nèi)毒素(LPS)、Williams′ medium E培養(yǎng)液(Sigma公司)，胎牛血清、青鏈霉素(雙抗)(Gibco公司)，Annexin V-FITC/PI(Ebioscience公司)。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、微量還原性谷胱甘肽(GSH)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測(cè)試試劑盒(南京建成生物工程研究所)。流式細(xì)胞儀(Facscalibur，BD Bioscience)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀和分光光度計(jì)(iMark和SmartSpec3000，Bio-Rad)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 雞肝細(xì)胞分離 在P.O.Seglen[4]兩步法的基礎(chǔ)上改進(jìn)，翅靜脈注射肝素鈉(1 750 IU·kg-1)抗凝，腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)麻醉供試雞。無(wú)菌打開(kāi)腹腔，結(jié)扎腸系膜總靜脈、胰十二指腸靜脈和腺胃脾靜脈，肝門靜脈插管，打開(kāi)前腔靜脈，37 ℃沖洗液A(33 mmol·L-1HEPES，127.8 mmol·L-1NaCl，3.15 mmol·L-1KCl，0.7 mmol·L-1Na2HPO4·12H2O，0.6 mmol·L-1EGTA，pH 7.6)沖洗。然后，37 ℃沖洗液B(33 mmol·L-1HEPES，127.8 mmol·L-1NaCl，3.15 mmol·L-1KCl，0.7 mmol·L-1Na2HPO4·12H2O，3 mmol·L-1CaCl2)沖洗。將肝轉(zhuǎn)移到無(wú)菌燒杯中，37 ℃ 100 mL 0.5% Ⅳ型膠原酶循環(huán)灌注20～25 min，流速約為20 mL·min-1。撕開(kāi)肝包膜，D-Hanks洗脫肝細(xì)胞，100、200目濾網(wǎng)過(guò)濾，500 r·min-1離心3 min，棄上清，重復(fù)2次。生長(zhǎng)培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，2%雙抗，0.5 mg·L-1牛胰島素的Williams' medium E培養(yǎng)液)重懸細(xì)胞。

1.3.2 肝細(xì)胞培養(yǎng) 臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)>95%，調(diào)整細(xì)胞濃度以5×105·mL-1接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2、飽和濕度靜置培養(yǎng)。細(xì)胞48～144 h處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期，可用于試驗(yàn)。

1.3.3 LPS致肝細(xì)胞損傷試驗(yàn)分組 取正常培養(yǎng)48 h的肝細(xì)胞分2組(n=6)，對(duì)照組：用生長(zhǎng)培養(yǎng)液換液；LPS組：分別用含10、20、30、40、50、60、80、100 μg·mL-1LPS的生長(zhǎng)培養(yǎng)液換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.4 LPS聯(lián)合恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林致肝細(xì)胞損傷試驗(yàn)分組 取正常培養(yǎng)48 h的肝細(xì)胞分4組(n=6)，對(duì)照組：用生長(zhǎng)培養(yǎng)液換液；LPS+恩諾沙星組：分別用含30+20、30+40、30+60、30+80、30+100 μg·mL-1LPS+恩諾沙星的生長(zhǎng)培養(yǎng)液換液；LPS+氟苯尼考組：分別用含30+20、30+40、30+60、30+80、30+100 μg·mL-1LPS+氟苯尼考的生長(zhǎng)培養(yǎng)液換液；LPS+阿莫西林組：分別用含30+20、30+40、30+60、30+80、30+100 μg·mL-1LPS+阿莫西林的生長(zhǎng)培養(yǎng)液換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.5 CAG對(duì)肝細(xì)胞保護(hù)作用試驗(yàn)分組 取正常培養(yǎng)48 h肝細(xì)胞分3組(n=6)，對(duì)照組：生長(zhǎng)培養(yǎng)液換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；模型組：含 LPS(30 μg·mL-1)+恩諾沙星(80 μg·mL-1)的生長(zhǎng)培養(yǎng)液換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；CAG組：含 LPS(30 μg·mL-1)+恩諾沙星(80 μg·mL-1)的生長(zhǎng)培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，用含CAG質(zhì)量濃度為25、50、100、200、400 μg·mL-1的生長(zhǎng)培養(yǎng)液換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。1.3.6 MTT法測(cè)定細(xì)胞活率 各組終止培養(yǎng)前加入20 μL MTT(5 g·L-1)，37 ℃，5% CO2孵育4 h。棄去上清液，每孔內(nèi)加入 DMSO 150 μL，靜置10 min。在酶標(biāo)儀 570 nm 下測(cè)定各孔吸光度值，細(xì)胞相對(duì)存活率=(OD試驗(yàn)孔-OD空白孔)/(OD對(duì)照孔-OD空白孔)×100%，OD=(optical density)。1.3.7 細(xì)胞酶學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 細(xì)胞上清液丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)；細(xì)胞勻漿液超氧化物歧化酶(SOD)、微量還原性谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)活力或含量均由酶標(biāo)儀檢測(cè)，按試劑盒說(shuō)明操作。

1.3.8 肝細(xì)胞凋亡檢測(cè) 按Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明操作，在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞形態(tài)儀器室由流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0 進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 LPS對(duì)肝細(xì)胞上清液中ALT、AST活性及存活率影響

由表1所示，隨LPS濃度增加，ALT、AST釋放度與肝細(xì)胞存活率呈劑量依賴性上升和降低。與對(duì)照組相比，LPS質(zhì)量濃度≥50 μg·mL-1時(shí)ALT、AST升高極顯著(P<0.01)；LPS質(zhì)量濃度為60 μg·mL-1，細(xì)胞存活率為48.19%±2.56%，該質(zhì)量濃度處理下細(xì)胞存活率與ALT、AST釋放度均較為適宜，適合作為L(zhǎng)PS誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷最佳劑量。

組別GroupALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)細(xì)胞存活率/%Cellviability(%)對(duì)照組Controlgroup36.33±6.6665.02±9.01100LPS(10μg·mL-1)43.54±5.0964.41±11.8893.27±2.37LPS(20μg·mL-1)49.37±3.60*61.68±8.5090.75±1.86LPS(30μg·mL-1)52.21±2.72*71.68±11.1280.30±2.09LPS(40μg·mL-1)67.26±6.92**87.09±11.02*73.53±3.49LPS(50μg·mL-1)79.03±2.59**113.50±11.27**61.12±5.01LPS(60μg·mL-1)91.72±9.45**138.50±9.29**48.19±2.56LPS(80μg·mL-1)96.87±11.25**155.40±22.60**25.70±3.14LPS(100μg·mL-1)108.70±8.99**142.5±10.59**12.00±2.65

與對(duì)照組比較*.P<0.05，**.P<0.01；與模型組比較#.P<0.05，##.P<0.01，下表同*.P<0.05，**.P<0.01，compared to control group；#.P<0.05，##.P<0.01，compared to model group，the same as below

2.2 LPS聯(lián)合恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林對(duì)肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST活性及存活率影響

由表2所示，隨LPS中添加的恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林質(zhì)量濃度的增加，肝細(xì)胞損傷程度相應(yīng)加大。其中LPS(30 μg·mL-1)+恩諾沙星(80 μg·mL-1)、LPS(30 μg·mL-1)+氟苯尼考(40 μg·mL-1)、LPS(30 μg·mL-1)+阿莫西林(60 μg·mL-1)使肝細(xì)胞存活率下降50%，ALT、AST活性極顯著升高(P<0.01)，故確定以上組合質(zhì)量濃度作為新型復(fù)合式肝細(xì)胞損傷最佳造模劑量。

組別GroupALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)細(xì)胞存活率/%Cellviability(%)對(duì)照組Controlgroup36.33±6.6665.02±9.01100LPS(30μg·mL-1)+ENR(20μg·mL-1)55.07±6.61*80.53±10.4379.31±2.19LPS(30μg·mL-1)+ENR(40μg·mL-1)68.45±7.67**90.93±10.50*68.85±2.22LPS(30μg·mL-1)+ENR(60μg·mL-1)92.47±9.23**111.00±14.40**65.93±1.93LPS(30μg·mL-1)+ENR(80μg·mL-1)109.70±4.79**126.60±1039**52.68±2.31LPS(30μg·mL-1)+ENR(100μg·mL-1)113.30±14.70**127.20±8.43**25.80±1.52LPS(30μg·mL-1)+FFC(20μg·mL-1)65.07±3.39**98.20±7.96**69.24±4.32LPS(30μg·mL-1)+FFC(40μg·mL-1)76.11±3.97**107.60±12.25**53.18±2.34LPS(30μg·mL-1)+FFC(60μg·mL-1)95.80±7.18**117.62±4.86**42.59±4.01LPS(30μg·mL-1)+FFC(80μg·mL-1)109.70±7.04**130.00±5.41**32.68±3.21LPS(30μg·mL-1)+FFC(100μg·mL-1)114.60±17.17**130.54±9.16**19.13±2.07LPS(30μg·mL-1)+AML(20μg·mL-1)66.41±3.48**78.20±10.45*72.18±1.60LPS(30μg·mL-1)+AML(40μg·mL-1)75.78±2.89**97.59±5.11**60.93±4.77LPS(30μg·mL-1)+AML(60μg·mL-1)97.14±7.15**104.30±10.94**49.34±3.29LPS(30μg·mL-1)+AML(80μg·mL-1)113.54±6.06**123.30±6.53**22.47±2.63LPS(30μg·mL-1)+AML(100μg·mL-1)111.63±15.58**133.90±3.42**20.11±1.45

2.3 CAG對(duì)肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST活性及存活率影響

由表3所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST活性極顯著上升(P<0.01)，顯示肝細(xì)胞受損明顯；與模型組相比，CAG各質(zhì)量濃度處理均對(duì)肝細(xì)胞有保護(hù)作用，其中100、200、400 μg·mL-1CAG處理組極顯著抑制2種酶的溢出量(P<0.01)。細(xì)胞存活率測(cè)定結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率極顯著下降(P<0.01)，為49.33%±3.09%；與模型組相比，CAG組細(xì)胞存活率均極顯著升高(P<0.01)，其中200、400 μg·mL-1CAG處理組細(xì)胞存活率較高，分別為87.68%±2.85%、90.45%±2.51%。

組別GroupALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)細(xì)胞存活率/%Cellviability(%)對(duì)照組Controlgroup36.33±6.6665.02±9.01100模型組Modelgroup98.62±10.39**153.06±16.45**49.33±3.09**CAGⅠ(25μg·mL-1)90.09±7.20133.00±18.9057.80±1.89##CAGⅡ(50μg·mL-1)81.41±8.00#117.65±12.44##70.55±0.84##CAGⅢ(100μg·mL-1)69.70±7.70##95.51±9.88##79.24±1.10##CAGⅣ(200μg·mL-1)55.32±9.03##80.77±8.88##87.68±2.85##CAGⅤ(400μg·mL-1)48.85±10.21##74.91±6.75##90.45±2.51##

2.4 CAG對(duì)肝細(xì)胞中SOD、GSH、MDA活性或含量影響

表4結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組SOD、GSH、MDA活性下降極顯著(P<0.01)；與模型組相比，CAG組各個(gè)劑量均能提高SOD、GSH、MDA活性，其中200、400 μg·mL-1CAG處理組極顯著升高SOD活性(P<0.01)；100 μg·mL-1CAG處理組可極顯著升高GSH含量(P<0.01)；100、200、400 μg·mL-1CAG處理組可有效抑制肝細(xì)胞MDA生成(P<0.01)。

組別GroupSOD/(U·mg-1)GSH/(nmol·mg-1)MDA/(nmol·mg-1)對(duì)照組Controlgroup81.09±9.96117.30±15.346.33±1.55模型組Modelgroup30.57±8.66**58.04±12.51**17.19±1.96**CAGⅠ(25μg·mL-1)33.34±9.1572.50±10.0116.40±1.89CAGⅡ(50μg·mL-1)41.46±10.9570.47±12.0513.53±1.82#CAGⅢ(100μg·mL-1)49.26±8.32#87.91±13.90##12.43±2.46##CAGⅣ(200μg·mL-1)59.38±8.90##82.07±10.61#12.00±1.28##CAGⅤ(400μg·mL-1)67.51±8.15##85.62±8.63#10.2±51.59##

2.5 CAG對(duì)肝細(xì)胞凋亡率影響

Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果表明，模型組早期凋亡細(xì)胞比例為71.32%±7.59%，與對(duì)照組3.57%±1.23%相比極顯著增加(P<0.01)；CAG 50，100，200，400 μg·mL-1處理后，早期凋亡比例分別降至41.43%±2.98%，29.38%±5.24%，13.97%±2.33%和12.35%±1.98%，與模型組相比有極顯著差異(P<0.01)。具體數(shù)值見(jiàn)圖1與表5。

組別Group細(xì)胞早期凋亡率/%Earlyapoptosisrate對(duì)照組Controlgroup3.57±1.23模型組Modelgroup71.32±7.59**CAGⅠ(25μg·mL-1)68.12±5.03CAGⅡ(50μg·mL-1)41.43±2.98##CAGⅢ(100μg·mL-1)29.38±5.24##CAGⅣ(200μg·mL-1)13.97±2.33##CAGⅤ(400μg·mL-1)12.35±1.98##

3 討 論

3.1 雞肝細(xì)胞分離及LPS誘發(fā)肝細(xì)胞損傷

肝細(xì)胞分離與原代培養(yǎng)是研究肝細(xì)胞功能的有效方法。本試驗(yàn)在P.O.Seglen[4]兩步法的基礎(chǔ)上改進(jìn)，即在體內(nèi)進(jìn)行第一步灌流，保留門靜脈完整分離肝后，在體外完成膠原酶循環(huán)灌流。本法節(jié)約了膠原酶使用量，細(xì)胞分離徹底且損傷較小，且不需要特殊設(shè)備，既能滿足試驗(yàn)要求，又經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便，適合普通實(shí)驗(yàn)室使用。

在雞原代肝細(xì)胞培養(yǎng)中，隨加入LPS質(zhì)量濃度增大，發(fā)現(xiàn)ALT、AST的釋放度與肝細(xì)胞死亡率不斷增加。ALT主要存在肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，AST主要存在肝細(xì)胞的線粒體內(nèi)，肝細(xì)胞受損時(shí)，二者釋放增加，故檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中其活性升高[5]。結(jié)果證實(shí)不同劑量的LPS均可不同程度的誘發(fā)肝細(xì)胞損傷，當(dāng)用60 μg·mL-1LPS處理時(shí)，細(xì)胞存活率下降50%左右，ALT、AST的釋放度極顯著升高，故將此質(zhì)量濃度作為L(zhǎng)PS誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的最佳劑量。

3.2 LPS致雞肝細(xì)胞損傷中恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林的協(xié)同效應(yīng)

選用LPS最佳致肝細(xì)胞損傷半量(30 μg·mL-1)，分別添加恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林，發(fā)現(xiàn)不同劑量的恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林均可使LPS在該劑量下的致肝細(xì)胞損傷程度加重，以LPS(30 μg·mL-1)聯(lián)合恩諾沙星(80 μg·mL-1)、氟苯尼考(40 μg·mL-1)、阿莫西林(60 μg·mL-1)處理肝細(xì)胞，細(xì)胞存活率下降達(dá)50%左右，ALT、AST釋放極顯著增加。提示添加殺菌性抗菌藥物，促使LPS致肝細(xì)胞損傷劑量下降，殺菌性抗菌藥物使LPS更易誘發(fā)肝損傷。在本研究已證實(shí)，阿莫西林、氟苯尼考、氟喹諾酮類藥物在殺菌的同時(shí)可促進(jìn)大腸桿菌LPS的釋放[6-8]。殺菌性藥物在促進(jìn)LPS釋放同時(shí)又能協(xié)同LPS致肝損傷，可能進(jìn)一步增加了家禽肝炎癥狀的發(fā)生率及危害程度。醫(yī)學(xué)臨床也已報(bào)道，殺菌性藥物(如阿莫西林、頭孢類、氟喹諾酮類、酰胺醇類藥物)也可誘發(fā)藥物性肝損傷[9-11]。LPS與抗菌藥物致肝損傷間相互影響與作用值得進(jìn)一步探究。

A. 對(duì)照組；B. 模型組； C. CAG(25 μg·mL-1)； D. CAG(50 μg·mL-1)；E. CAG(100 μg·mL-1)； F. CAG(200 μg·mL-1)；G. CAG(400 μg·mL-1)A. Control group; B. Model group; C. CAG (25 μg·mL-1); D. CAG (50 μg·mL-1); E. CAG (100 μg·mL-1); F. CAG (200 μg·mL-1); G. CAG (400 μg·mL-1)圖1 CAG對(duì)肝細(xì)胞凋亡率影響 Fig.1 Effects of CAG on apoptosis rate of hepatocytes

已報(bào)道，添加卡介苗或與D-半乳糖胺可致LPS致肝損傷的劑量降低[12-14]，也即“復(fù)合式肝細(xì)胞損傷模型”。本文結(jié)果顯示，不同劑量的抗菌藥物，同樣使LPS致肝細(xì)胞損傷劑量降低。該新型復(fù)合式肝細(xì)胞損傷模型，為進(jìn)一步研究家禽肝損傷病理機(jī)制及獸醫(yī)臨床護(hù)肝藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

3.3 CAG對(duì)LPS聯(lián)合恩諾沙星誘發(fā)肝細(xì)胞損傷的修復(fù)作用

在LPS聯(lián)合恩諾沙星致肝細(xì)胞損傷中，添加不同質(zhì)量濃度的CAG，可顯著抑制細(xì)胞死亡率與細(xì)胞培養(yǎng)上清液ALT、AST活性上升，表明CAG對(duì)肝細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，其作用強(qiáng)度與用量有關(guān)。

CAG主要由甘草酸單胺、甘氨酸和蛋氨酸組成[15]，為醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用廣泛的護(hù)肝藥物。N.P.Visavadiya 等[16]證實(shí)CAG通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體自由基清除能力，對(duì)抗自由基對(duì)肝的損傷。本試驗(yàn)中，模型組肝細(xì)胞中MDA含量顯著增加，SOD活性和GSH含量顯著下降，表明LPS聯(lián)合恩諾沙星可促使肝細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，損害機(jī)體氧化自由基清除系統(tǒng)，加重肝細(xì)胞損傷；CAG可不同程度抑制MDA的生成，提高SOD活性和GSH含量，顯示CAG可抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，保持SOD活性，抑制GSH的耗竭，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。

肝細(xì)胞凋亡是肝細(xì)胞損傷機(jī)制的一個(gè)重要方面。動(dòng)物試驗(yàn)研究表明，LPS致肝損傷過(guò)程中可導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡顯著增加[17]，CAG可抑制CCl4引起的大鼠肝細(xì)胞凋亡的增加[18]。本試驗(yàn)中，模型組肝細(xì)胞中早期凋亡率極顯著升高，表明LPS聯(lián)合恩諾沙星可通過(guò)增加細(xì)胞早期凋亡率加重肝細(xì)胞損傷；CAG可劑量依賴性抑制LPS聯(lián)合恩諾沙星引起的早期凋亡率增加，由此可知CAG對(duì)雞肝細(xì)胞保護(hù)作用與其抗凋亡能力相關(guān)。

4 結(jié) 論

LPS可致肝細(xì)胞損傷，恩諾沙星、氟苯尼考及阿莫西林等抗菌藥物的存在，均使LPS致肝細(xì)胞損傷劑量下降，顯示藥物與LPS間致肝損傷有協(xié)同效應(yīng)。CAG具有提高細(xì)胞存活率，影響細(xì)胞SOD、GSH、MDA活性或含量，抑制凋亡等修復(fù)效應(yīng)。本研究結(jié)果啟示，家禽養(yǎng)殖實(shí)踐中，應(yīng)合理使用殺菌性藥物，規(guī)范其使用方案，以免其和內(nèi)毒素相互協(xié)同誘發(fā)和加重肝損傷，影響疾病愈合及家禽生長(zhǎng)。

[1] 徐能武，袁建成，肖光夏，等.抗生素誘導(dǎo)革蘭陰性桿菌釋放內(nèi)毒素的實(shí)驗(yàn)研究(一) [J].中華燒傷雜志，2001，17(2)：75-79. XU N W，YUAN J C，XIAO G X，et al.An experimental study on the release of endotoxin from gram negative bacteria induced by antibiotics [J].ChineseJournalofBurns，2001，17(2)：75-79.(in Chinese)

[2] 高亞乾.不同類型抗菌藥物在革蘭氏陰性菌感染中誘導(dǎo)內(nèi)毒素釋放的實(shí)驗(yàn)性研究 [D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2011. GAO Y Q.An experimental study on the release of endotoxin from gram negative bacteria induced by different antibiotics [D].Shijiazhuang：Hebei Medical University，2011.(in Chinese)

[3] OU T T，KUO C Y，CHYAU C C，et al.Improvement of lipopolysaccharide-induced hepatic injuries and inflammation with mulberry extracts [J].JSciFoodAgric，2013，93(8)：1880-1886.

[4] SEGLEN P O.Preparation of isolated rat liver cells [J].MethodsCellBiol，1976，13：29-83.

[5] 王庸晉.現(xiàn)代臨床與檢驗(yàn)學(xué) [M].北京，人民軍醫(yī)出版社，2002. WANG Y J.The modern clinical laboratory [M].Beijing：People′s Military Medical Press，2002.(in Chinese)

[6] ROTIMI V O，VERGHESE T L，AL-SWEIH N，et al.Influence of five antianaerobic antibiotics on endotoxin liberation by gram-negative anaerobes [J].JChemother，2000，12(1)：40-47.

[7] MORITA H，HASUNUMA R，KAWAGUCHI K，et al.Limitation of polymyxin B on suppression of endotoxin shock induced bySalmonellainfection in mice [J].BiolPharmBull，2004，27(11)：1840-1843.

[8] 張 強(qiáng)，吳碩東，金俊哲.抗生素誘導(dǎo)內(nèi)毒素釋放意義的實(shí)驗(yàn)性研究 [J].遼寧醫(yī)學(xué)雜志，2004，18(2)：68-70. ZHANG Q，WU S D，JIN J Z.The experimental study of releasing significance on antibiotic inducing endotoxin [J].MedicalJournalofLiaoning，2004，18(2)：68-70.(in Chinese)

[9] GHABRIL M，CHALASANI N，BJ?RNSSON E.Drug-induced liver injury：a clinical update [J].CurrOpinGastroenterol，2010，26(3)：222-226.

[10] YILMAZ B，EKIZ F，COBAN S，et al.Cefixime-induced hepatotoxicity [J].TurkJGastroenterol，2011，22(4)：445.

[11] LEITNER J M，GRANINGER W，THALHAMMER F.Hepatotoxicity of antibacterials：pathomechanisms and clinical data[J].Infection，2010，38(1)：3-11.

[12] 劉亮明，鄧 歡，張吉翔，等.內(nèi)毒素性急性肝損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立 [J].世界華人消化雜志，2006，14(1)：12-18. LIU L M，DENG H，ZHANG J X，et al.Establishment of lipopolysaccharide-induced acute liver injury in rats [J].WorldChineseJournalofDigestology，2006，14(1)：12-18.(in Chinese)

[13] 楊舒淳，楊昌華，馬小凡，等.小鼠腹腔注射卡介苗加脂多糖建立急性免疫性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究 [J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2008，25(4)：1-4. YANG S C，YANG C H，MA X F，et al.An experimental study of acute immune liver injury model established by intraperitoneal injection of BCG and LPS on mouse [J].LaboratoryAnimalScience，2008，25(4)：1-4.(in Chinese)

[14] LIU D，LI C，CHEN Y，et al.Nuclear import of proinflammatory transcription factors is required for massive liver apoptosis induced by bacterial lipopolysaccharide [J].JBiolChem，2004，279(46)：48434-48442.

[15] ASL M N，HOSSEINZADEH H.Review of pharmacological effects ofGlycyrrhizasp.and its bioactive compounds [J].PhytotherRes，2008，22(6)：709-724.

[16] VISAVADIYA N P，NARASIMHACHARYA A V.Hypocholesterolaemic and antioxidant effects ofGlycyrrhizaglabra(Linn) in rats [J].MolNutrFoodRes，2006，50(11)：1080-1086.

[17] LIU L M，ZHANG J X，LUO J，et al.A role of cell apoptosis in lipopolysaccharide(LPS)-induced nonlethal liver injury in D-galactosamine(D-GalN)-sensitized rats [J].DigDisSci，2008，53(5)：1316-1324.

[18] GUO X L，LIANG B，WANG X W，et al.Glycyrrhizic acid attenuates CCl4-induced hepatocyte apoptosis in ratsviaa p53-mediated pathway [J].WorldJGastroenterol，2013，19(24)：3781-3791.

(編輯 白永平)

Effects of Antibiotics on LPS Induced Liver Cell Injury and Hepatoprotective Activity of Compound Ammonium Glycyrrhizin

LIU Teng-fei，TIAN Jing，GENG Zhi-xia，LI Hui-min，YU Zu-gong*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China)

The present study was aimed at the effects of antibiotics on LPS induced liver cell injury and hepatoprotective activity of compound ammonium glycyrrhizin (CAG).Chicken hepatocytes were isolated by semi-situperfusion method.After the cells were cultured for 48 h，LPS was added with different concentrations to screen the optimal dose of liver cell injury.At the half of the optimal dose of LPS，enrofloxacin，florfenicol and amoxicillin were added with different concentration to detect the indexes of liver cell injury.Hepatocytes were treated with different concentrations of CAG for 24 h after the addition of LPS (30 μg·mL-1) + enrofloxacin (80 μg·mL-1).Cell viability and activities of ALT，AST，SOD，GSH，MDA were measured，flow cytometric analysis was conducted to detect the early apoptosis ratio of hepatocytes.The result showed that when LPS less than 50 μg·mL-1，the liver injury was not obvious.While LPS at more than 60 μg·mL-1，the cell viability were significantly lower and the activities of ALT，AST in the culture media were significantly higher than those of controls(P<0.01).LPS (30 μg·mL-1) combined with enrofloxacin (80 μg·mL-1)，florfenicol (40 μg·mL-1)，amoxicillin (60 μg·mL-1) could induce liver cell injury significantly.CAG (25，50，100，200，400 μg·mL-1) could markedly reduce the numbers of early apoptotic cells，inhibit the elevation of ALT，AST，MDA，and significantly increase the reduced level of SOD，GSH and cell viability.These results indicated that LPS could induce liver cell injury.Antibiotics might contribute to the liver cell injury induced by LPS.CAG counteracts liver cell injury at various levels by preventing apoptosis and oxidative stress damage.

LPS；enrofloxacin；florfenicol；amoxicillin；complex chicken liver cells injury；compound ammonium glycyrrhizin

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.019

2014-08-27

劉騰飛(1988-)，男，河南博愛(ài)人，碩士，主要從事新獸藥研發(fā)工作，E-mail：2011107030@njau.edu.cn

*通信作者：余祖功，E-mail：yuzugong@njau.edu.cn

S859.7

A

0366-6964(2015)02-0309-08