張秀平，陳 陸，趙 軍，王川慶，李永濤，劉紅英，彭志鋒，盧彩景，敬文憲，楊 霞

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，禽病研究所，鄭州 450002)

鴨源雞桿菌對HeLa細(xì)胞的黏附和侵襲特性

張秀平，陳 陸，趙 軍，王川慶，李永濤，劉紅英，彭志鋒，盧彩景，敬文憲，楊 霞*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，禽病研究所，鄭州 450002)

為研究鴨源雞桿菌(G.anatis)體外黏附和侵襲細(xì)胞的能力，選擇HeLa 細(xì)胞為感染模型，分別以細(xì)菌黏附和侵襲HeLa 細(xì)胞數(shù)量為指標(biāo)，借助革蘭和姬姆薩染色及電鏡觀察來研究2株不同來源的鴨源雞桿菌對HeLa細(xì)胞的黏附和侵襲特性。結(jié)果顯示：黏附計(jì)數(shù)表明鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG能高水平黏附HeLa 細(xì)胞，菌株感染30、60、90、120、150 min后每細(xì)胞黏附的細(xì)菌數(shù)分別為0.84、4.68、8.52、9.27、8.2個(gè)，而菌株F149T對HeLa細(xì)胞有較低的黏附作用。侵襲試驗(yàn)表明Yu-PDS-RZ-1-SLG有低度侵襲力，侵襲的細(xì)菌數(shù)在150 min時(shí)達(dá)到最大，約8.27·1 000細(xì)胞-1，隨后細(xì)胞破碎，細(xì)胞逐漸脫落，而菌株F149T未檢測到侵襲力。染色及電鏡試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG可黏附于HeLa細(xì)胞表面并侵入細(xì)胞內(nèi)部。菌株經(jīng)胰蛋白酶處理后，細(xì)菌的黏附率顯著降低，表明細(xì)菌的表面蛋白參與黏附。黏附和入侵特性是鴨源雞桿菌定殖在組織表面重要的能力，該細(xì)胞模型的建立為進(jìn)一步研究其致病機(jī)制提供了條件。

鴨源雞桿菌；細(xì)胞黏附；細(xì)胞侵襲；HeLa 細(xì)胞

雞桿菌屬(Gallibacterium)是革蘭陰性巴氏桿菌科中一個(gè)新屬，代表種為鴨源雞桿菌(Gallibacteriumanatis)[1-2]。鴨源雞桿菌是構(gòu)成雞上呼吸道和下生殖道正常菌群的一部分，最近證明也與產(chǎn)蛋雞輸卵管炎、輸卵管囊腫及腹膜炎等有關(guān)，能引起雞產(chǎn)蛋量下降和死亡[3-4]。2008年，王川慶等[5]首次報(bào)道了中國雞場中鴨源雞桿菌的感染情況，從病雞的卵巢、輸卵管、肝等器官均分離出了鴨源雞桿菌。對中國部分地區(qū)雞群進(jìn)行雞桿菌血清流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，抗體陽性率達(dá)45.06%[6]，說明雞桿菌感染已成為中國雞群發(fā)生腹膜炎和輸卵管炎疾病的重要病因。2013年首次報(bào)道鴨源雞桿菌能夠感染人[7]，更引起了全世界的高度重視。但目前對其致病機(jī)制的研究還相對缺乏。

病原菌定殖和入侵宿主的第一步是黏附，不同的病原菌可以表達(dá)不同的黏附因子。一部分病原菌黏附于宿主黏膜上皮細(xì)胞表面并在局部繁殖，在整個(gè)感染過程中一直停留在那里，進(jìn)一步分泌毒素或其他毒力因子，作用于被感染的宿主細(xì)胞使其發(fā)生病變，如霍亂弧菌；而另外一些病原菌在黏附于宿主細(xì)胞表面后還要進(jìn)一步內(nèi)在化，即侵入宿主細(xì)胞內(nèi)部，這種特性被稱作侵襲(invasion)[8]。細(xì)菌黏附和侵襲模型包括動(dòng)物模型、細(xì)胞模型等。細(xì)胞模型是近年來應(yīng)用較多的一類細(xì)菌黏附和侵襲模型，具有重復(fù)性好和周期短的優(yōu)點(diǎn)，如HeLa細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞系)、Int407(人胚胎腸黏膜細(xì)胞系)、Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎異倍體細(xì)胞)、CHO細(xì)胞(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)及原代細(xì)胞模型等；其中 HeLa細(xì)胞是生物學(xué)與醫(yī)學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用的一種傳代細(xì)胞，已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究中非常重要的工具，且在巴氏桿菌科中作為黏附與侵襲模型早有應(yīng)用[9]。

目前，已經(jīng)證實(shí)鴨源雞桿菌能黏附到塑性表面及雞口咽原代上皮細(xì)胞上[10-11]，在感染黏膜組織，定殖上呼吸道過程中有重要作用。但鴨源雞桿菌能否體外黏附和侵襲傳代細(xì)胞尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)嘗試選擇HeLa細(xì)胞為感染模型，分別以慶大霉素保護(hù)試驗(yàn)、革蘭染色和姬姆薩染色及電鏡觀察來研究鴨源雞桿菌對HeLa細(xì)胞的黏附和侵襲能力，以期為進(jìn)一步研究該病原菌的致病機(jī)制，控制病原菌的繁殖，降低其侵襲力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鴨源雞桿菌參考菌株F149T(ATCC43329T)分離自丹麥的健康鴨，由德國勃林格公司惠贈(zèng)；鴨源雞桿菌菌株Yu-PDS-RZ-1-SLG是從平頂山汝州發(fā)病雞的輸卵管上分離的菌株，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室鑒定保存。1.1.2 主要試劑 DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)基購于GIBCO 公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS) 購于武漢三利公司；慶大霉素購自山東華信制藥有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購自NEST Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的培養(yǎng) 取試驗(yàn)菌株接種于綿羊血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)18～20 h，挑單菌落接種于含5%胎牛血清的LB肉湯中，37 ℃ 200 r·min-1培養(yǎng)18～20 h，按1∶100的比例轉(zhuǎn)接于上述新鮮培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至細(xì)菌達(dá)到對數(shù)期，采用平板活菌計(jì)數(shù)法測定細(xì)菌濃度。試驗(yàn)前，培養(yǎng)物用不含雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌3次，并稀釋到所需濃度。1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) HeLa細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。將培養(yǎng)瓶中長滿單層的細(xì)胞，用細(xì)胞消化液(2.5 g·L-1胰酶，0.2 g·L-1EDTA)消化后，用不含抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮，以105個(gè)細(xì)胞·孔-1接種于24 孔板，置37 ℃、5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)，待長滿單層后用于試驗(yàn)。為了確保HeLa細(xì)胞在接種鴨源雞桿菌后，細(xì)胞的活力不受影響，試驗(yàn)采用cell counting kit-8 cck-8 試劑盒以及臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞的活性。

1.2.3 黏附試驗(yàn) 試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[12]提供的方法并稍加改動(dòng)。長成單層的細(xì)胞，用PBS洗3遍，每孔加入500 μL用DMEM/F12重懸稀釋的菌液(細(xì)菌與細(xì)胞感染比分別為10、50、100)，37 ℃、5% CO2分別培養(yǎng)30、60、90、120、150 min，傾去孔中液體，用PBS洗5次。每孔加入500 μL的胰酶-EDTA消化5 min，收集部分細(xì)胞，1 200 × g離心5 min，棄上清，用不含抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮，通過臺(tái)盼藍(lán)染色確定細(xì)胞活力。剩余的細(xì)胞每孔加入500 μL 1% 的Trition X-100溶解混勻，取100 μL連續(xù)10倍倍比稀釋菌液，均勻涂布于綿羊血瓊脂平板，計(jì)算每孔溶解液中細(xì)菌數(shù)量。黏附率表示為在接種鴨源雞桿菌后，每個(gè)HeLa 細(xì)胞表面的平均細(xì)菌，即每孔溶解的細(xì)菌數(shù)/每孔接種的細(xì)胞數(shù)。試驗(yàn)時(shí)每個(gè)處理設(shè)4 個(gè)重復(fù)，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。1.2.4 侵襲試驗(yàn) 采用慶大霉素保護(hù)試驗(yàn)[12-13]，參照黏附試驗(yàn)接種細(xì)菌至細(xì)胞上，24孔板在37 ℃含有5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)后，傾去孔中液體，用PBS洗3次，接著每孔加入1 mL含慶大霉素(100 μg·mL-1)的DMEM/F12，繼續(xù)孵育1 h，以殺死細(xì)胞外細(xì)菌，再用PBS洗5次。為了確保在抗生素使用后能100% 的殺死胞外菌，取100 μL 最后一次的PBS 洗滌液涂布綿羊血瓊脂平板。細(xì)胞活力測定及細(xì)胞溶解的處理方法同黏附試驗(yàn)，最后直接取100 μL 涂布綿羊血平板，計(jì)算裂解液中細(xì)菌數(shù)量。侵襲率表示為在使用慶大霉素后，每個(gè)HeLa 細(xì)胞里的平均細(xì)菌數(shù)，即每孔裂解的細(xì)菌數(shù)/每孔接種的細(xì)胞數(shù)。試驗(yàn)時(shí)每個(gè)處理設(shè)4 個(gè)重復(fù)，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。1.2.5 用胰蛋白酶處理菌體對細(xì)菌黏附力的影響 取達(dá)到對數(shù)期的細(xì)菌于離心管中，4 000 × g離心5 min，棄上清液后用2.5 g·L-1胰蛋白酶處理鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG和F149T菌體，37 ℃下孵育10 min。處理后菌體經(jīng)PBS充分洗滌，懸浮并稀釋成所需濃度。處理后再進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，然后按“1.2.3”中的方法進(jìn)行黏附試驗(yàn)。

1.2.6 革蘭染色和姬姆薩染色觀察細(xì)菌黏附和侵襲 細(xì)胞接種于預(yù)先放有8 mm × 8 mm蓋玻片的細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞在蓋玻片上形成單層后，接種濃度為107cfu·mL-1的鴨源雞桿菌懸液1 mL，置37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。吸去菌液，用無菌的PBS 洗滌3 次，用甲醇∶冰乙酸=3∶1 固定液固定5 min，自然干燥。經(jīng)革蘭染色和姬姆薩染色后水洗，干燥、封片，置于油鏡下觀察黏附和侵襲情況。同時(shí)以DMEM/F12培養(yǎng)基作為對照組。1.2.7 掃描電鏡觀察細(xì)菌黏附細(xì)胞 方法同黏附試驗(yàn)，當(dāng)細(xì)菌在含有玻片的培養(yǎng)基上孵育90 min時(shí)，用常規(guī)方法固定制片后用S-3400 掃描電鏡觀察。1.2.8 透射電鏡觀察細(xì)菌侵襲細(xì)胞 透射電鏡用細(xì)胞不加蓋玻片，細(xì)胞在一次性T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至單層，接種細(xì)菌懸液共同孵育90 min后，PBS洗3次，用2.5% 的戊二醛溶液固定2 h 后，換新鮮固定液固定過夜，用無菌細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，4 000 r·min-1離心10 min，棄去固定液。常規(guī)方法固定，超薄切片，枸櫞酸鉛和醋酸鈾雙重重金屬染色后，置于JEM-1400 透射電鏡下觀察。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5作圖表示，應(yīng)用SPSS11.5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對試驗(yàn)結(jié)果采用方差分析T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 鴨源雞桿菌對HeLa 細(xì)胞活力的影響

為確保接種鴨源雞桿菌后HeLa 細(xì)胞的活力不受影響，在接種鴨源雞桿菌菌株150 min時(shí)采用cell counting kit-8 cck-8 試劑盒以及臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞的活性。與不加細(xì)菌的對照相比，鴨源雞桿菌菌株F149T及Yu-PDS-RZ-1-SLG 在黏附和侵襲試驗(yàn)期間對HeLa細(xì)胞均無毒性影響。所有對照組及試驗(yàn)組細(xì)胞在接種細(xì)菌后150 min時(shí)至少有85%～90% 的活力。

150 min后，菌株F149T接種的細(xì)胞基本維持正常，而菌株 Yu-PDS-RZ-1-SLG 接種的細(xì)胞，細(xì)胞破碎、逐漸脫落，因此試驗(yàn)選擇150 min之前研究細(xì)菌的侵襲和黏附。

2.2 感染復(fù)數(shù)(MOI)的確定

運(yùn)用鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株做黏附預(yù)試驗(yàn)中，分別以MOI為10、50、100 感染HeLa細(xì)胞確定合適的感染復(fù)數(shù)。從圖1可以看出隨著時(shí)間的推移，黏附數(shù)量逐漸增加；30 min時(shí)，3個(gè)不同濃度組之間均差異不顯著(P>0.05)；60、90和120 min時(shí)，MOI為50和100的菌量組之間差異不顯著(P>0.05)，但二者與MOI為10的濃度組相比均差異顯著(P<0.05)，且120 min時(shí)，MOI為100黏附數(shù)量達(dá)到最高，因此在后續(xù)的研究中以MOI為100為感染復(fù)數(shù)進(jìn)行細(xì)菌的黏附和侵襲試驗(yàn)研究。

2.3 鴨源雞桿菌對HeLa細(xì)胞的黏附結(jié)果

2株鴨源雞桿菌均能黏附HeLa細(xì)胞。如圖2所示，在MOI為100時(shí)2株鴨源雞桿菌黏附HeLa細(xì)胞均具有時(shí)間依賴性。隨著時(shí)間的延長，每個(gè)細(xì)胞上的黏附細(xì)菌數(shù)量逐漸增加，至120 min時(shí)達(dá)到最大的細(xì)菌黏附數(shù)量，且鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株對HeLa 細(xì)胞的黏附數(shù)量在60至150 min均顯著高于鴨源雞桿菌F149T株。120 min黏附數(shù)量最大時(shí)鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株每個(gè)細(xì)胞黏附數(shù)為9.27，F(xiàn)149T株僅為0.99，前者的黏附數(shù)量將近是后者的10倍，并且鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株黏附數(shù)在90、120、150 min時(shí)與30 min時(shí)相比，差異顯著(P<0.05)。

*表示在60、90和120 min時(shí)，MOI為50和100的濃度組與MOI為10的濃度組相比均差異顯著(P<0.05)*Significant differences(P<0.05) compared to the incubation at MOI of 10圖1 不同MOI濃度鴨源雞桿菌(10、50、100)在不同時(shí)間點(diǎn)黏附HeLa 上皮細(xì)胞趨勢Fig.1 The general adhesion trend of G.anatis strain to HeLa cells from 30 to 150 min at different MOI(10，50，100)

2.4 鴨源雞桿菌對HeLa細(xì)胞的黏附染色試驗(yàn)

革蘭染色結(jié)果表明：鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG對HeLa細(xì)胞具有黏附力。光學(xué)顯微鏡油鏡(×1 000)下可見到HeLa細(xì)胞周圍有菌體黏附于細(xì)胞表面。感染后30 min時(shí)，黏附的細(xì)菌數(shù)量較少，多數(shù)細(xì)菌游離在細(xì)胞之外。隨著時(shí)間的延長，黏附在細(xì)胞周圍的數(shù)量逐漸增加，感染后120 min時(shí)，單個(gè)細(xì)胞周圍有較多的細(xì)菌(圖3a～d)，染色結(jié)果與黏附數(shù)量基本一致。

*表示和30 min 相比差異顯著(P<0.05)；**表示和菌株Yu-PDS-RZ-1-SLG 相比差異顯著(P<0.05)*Significant differences(P<0.05) compared to 30 min of incubation；**Significant differences(P<0.05) compared to Yu-PDS-RZ-1-SLG strain圖2 鴨源雞桿菌F149T和Yu-PDS-RZ-1-SLG對HeLa 細(xì)胞的黏附Fig.2 Kinetics of adherence of G.anatis F149T and Yu-PDS-RZ-1-SLG strains to HeLa cells

2.5 掃描電鏡觀察鴨源雞桿菌對HeLa細(xì)胞的黏附

掃描電鏡顯示鴨源雞桿菌菌株Yu-PDS-RZ-1-SLG感染的HeLa細(xì)胞表面有短桿菌黏附(圖4a)，進(jìn)一步確定了鴨源雞桿菌對HeLa細(xì)胞的黏附。而F149T感染的HeLa細(xì)胞表面未見有明顯的黏附細(xì)菌，單個(gè)細(xì)菌游離在細(xì)胞之外(圖4b)。

2.6 用胰蛋白酶處理鴨源雞桿菌后對HeLa細(xì)胞的黏附

胰蛋白酶處理F149T和Yu-PDS-RZ-1-SLG菌體后，細(xì)菌的增殖未受到明顯影響，而細(xì)菌對細(xì)胞的黏附數(shù)量明顯下降，黏附均受到較大程度的抑制(P<0.01)，尤其是Yu-PDS-RZ-1-SLG株下降更顯著(圖5)，說明表面蛋白參與了細(xì)菌的黏附。

2.7 鴨源雞桿菌對HeLa細(xì)胞的侵襲

慶大霉素保護(hù)試驗(yàn)顯示，鴨源雞桿菌F149T株對HeLa無侵襲力，Yu-PDS-RZ-1-SLG株對HeLa細(xì)胞有侵襲力，且接種30 min后，每1 000個(gè)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量為2.73，90 min時(shí)達(dá)5.87，差異顯著；在120、150 min時(shí)差異不顯著(P>0.05)，但150 min時(shí)侵襲數(shù)量達(dá)到最大值，即每1 000個(gè)細(xì)胞內(nèi)侵入細(xì)菌數(shù)約為8.27。侵襲數(shù)在120、150 min時(shí)與30、60 min相比，差異顯著(P<0.05)(圖6)。隨后，鴨源雞桿菌 Yu-PDS-RZ-1-SLG株接種的細(xì)胞出現(xiàn)變圓、腫脹、脫落，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多的病變現(xiàn)象。

2.8 鴨源雞桿菌對HeLa細(xì)胞的侵襲染色試驗(yàn)

姬姆薩染色結(jié)果表明：鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株對HeLa細(xì)胞具有侵襲力。光學(xué)顯微鏡油鏡(1 000×)下可見到HeLa細(xì)胞周圍有染色深淺不一的菌體，黏附于細(xì)胞表面或者侵入到細(xì)胞的內(nèi)部。隨著時(shí)間的延長，黏附和侵入的細(xì)菌數(shù)量逐漸增加，感染后120 min時(shí)，單個(gè)細(xì)胞表面和內(nèi)部均有較多的細(xì)菌(圖3e～h)，染色結(jié)果與侵襲結(jié)果基本一致。

2.9 透射電鏡觀察鴨源雞桿菌對HeLa細(xì)胞的侵襲結(jié)果

透射電鏡顯示鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株感染的HeLa細(xì)胞上有細(xì)菌緊密結(jié)合于細(xì)胞膜或細(xì)胞表面微絨毛上，細(xì)胞內(nèi)有侵襲現(xiàn)象(圖7a)。而F149T感染的HeLa細(xì)胞未見有侵襲的細(xì)菌，單個(gè)細(xì)菌游離在細(xì)胞間(圖7b)。

a～d.鴨源雞桿菌株Yu-PDS-RZ-1-SLG感染HeLa細(xì)胞后30、60、90、120 min時(shí)革蘭染色(標(biāo)尺=20 μm);e～h.鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG感染HeLa細(xì)胞后30、60、90、120 min時(shí)姬姆薩染色(標(biāo)尺=20 μm)a-d.Gram staining of G.anatis Yu-PDS-RZ-1-SLG strain at 30，60，90，120 min after infection respectively(Bars = 20 μm);e-h.Giemsa staining of G.anatis Yu-PDS-RZ-1-SLG strain at 30，60，90，120 min after infection respectively(Bars=20 μm) 圖3 鴨源雞桿菌感染HeLa細(xì)胞的染色圖片F(xiàn)ig.3 Staining of G.anatis after infection to HeLa cells

3 討 論

細(xì)菌的致病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，其毒力取決于侵襲力和毒素兩方面，而侵襲力又由細(xì)菌的黏附和侵襲、繁殖與擴(kuò)散以及對宿主防御機(jī)能的抵抗等諸因素構(gòu)成。黏附是病原菌引起感染發(fā)生的第一步，因此，成功地黏附在黏膜表面，才有可能在宿主體內(nèi)定殖，進(jìn)而引發(fā)感染，表現(xiàn)一系列的病理變化并出現(xiàn)臨床癥狀。盡管鴨源雞桿菌能黏附上皮細(xì)胞[11]，具有凝聚紅細(xì)胞的能力[14]，但是鴨源雞桿菌能否黏附和侵襲HeLa細(xì)胞尚未見報(bào)道。HeLa細(xì)胞來源于人的子宮上皮癌細(xì)胞株，是研究病原菌感染的理想細(xì)胞系，廣泛應(yīng)用于大腸桿菌、沙門菌、志賀菌和巴氏桿菌等的侵襲試驗(yàn)中[9,15-16]。因此，本研究也嘗試采用HeLa細(xì)胞作為上皮細(xì)胞侵襲模型研究鴨源雞桿菌感染細(xì)胞的特性。

a、b.鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG和F149T在MOI=100時(shí)，對HeLa 細(xì)胞感染90 min時(shí)掃描電鏡結(jié)果a，b.Scanning electron micrograph of G.anatis Yu-PDS-RZ-1-SLG and F149T strains at 90 min after infection at MOI of 100 respectively圖4 鴨源雞桿菌感染HeLa細(xì)胞的掃描電鏡Fig.4 Scanning electron microscopy of G.anatis after infection to HeLa cells

*表示和處理組相比差異極顯著(P<0.01)*Significant differences (P<0.01) compared with experimental group圖5 鴨源雞桿菌F149T和Yu-PDS-RZ-1-SLG在胰蛋白酶處理后對HeLa細(xì)胞的黏附Fig.5 Adherence of G.anatis F149T and Yu-PDS-RZ-1-SLG strains to HeLa cells after treatment with trypsase

*表示和接種30、60 min 相比差異顯著(P<0.05)*Significant differences(P<0.05) compared with 30 and 60 min of incubation圖6 鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG對HeLa細(xì)胞的侵襲Fig.6 Kinetics of invasion of G.anatis Yu-PDS-RZ-1-SLG strain to HeLa cells

本試驗(yàn)證實(shí)，分離的鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株能夠黏附HeLa細(xì)胞，且隨著感染時(shí)間的增加，HeLa細(xì)胞表面黏附的細(xì)菌數(shù)也逐漸增加。在120 min時(shí)，黏附數(shù)目最高，表明細(xì)胞表面的受體已經(jīng)飽和，只有有限數(shù)量的細(xì)菌能夠黏附到HeLa上皮細(xì)胞。M.L.S.Lucio等[11]在研究鴨源雞桿菌對雞口咽上皮細(xì)胞的黏附中，發(fā)現(xiàn)F149T能黏附雞口咽上皮細(xì)胞，而且鑒定了兩個(gè)假定的菌毛蛋白可能參與黏附。本試驗(yàn)中F149T對HeLa細(xì)胞的黏附能力相對較弱，推測可能是F149T菌株表面缺乏相應(yīng)的參與黏附HeLa細(xì)胞的因子，部分細(xì)菌非特異性黏附在細(xì)胞的表面。

慶大霉毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株對HeLa細(xì)胞有侵襲力，且其隨感染時(shí)間的增加而增加；另外，在感染該菌150 min后，HeLa細(xì)胞的結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化，變圓，腫大，脫落。而菌株F149T對HeLa細(xì)胞無明顯侵襲力，且其感染的HeLa細(xì)胞和對照組相比沒有可見的改變。文獻(xiàn)[17]顯示細(xì)菌的致病因素(黏附素)能夠使一些細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生病變，使細(xì)胞膜突起，或者形成褶皺。曾巧英等[18]在研究中發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌2 型在黏附扁桃腺上皮細(xì)胞5 h后，細(xì)胞表面微絨毛脫落，細(xì)胞膜吐泡，有明顯的凋亡跡象。B.M.Kris-tensen等[19]研究發(fā)現(xiàn)鴨源雞桿菌對巨噬細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，可能在發(fā)病機(jī)制上扮演著重要的角色。由于本試驗(yàn)中所用鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株有很強(qiáng)的致病性和溶血活性，而菌株F149T無明顯的致病力(另文報(bào)道)，是否因?yàn)?株菌不同的致病性對HeLa細(xì)胞的影響不同還有待于進(jìn)一步研究。

a、b.鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG和F149T在MOI=100時(shí)，對HeLa細(xì)胞感染90 min的透射電鏡(標(biāo)尺=1 μm)a，b.Transmission electron micrograph of G.anatis Yu-PDS-RZ-1-SLG and F149T strains at 90 min after infection at MOI of 100 respectively (Scale bars=1 μm)圖7 鴨源雞桿菌感染HeLa細(xì)胞的透射電鏡Fig.7 Transmission electron microscopy of G.anatis after infection to HeLa cells

細(xì)菌的黏附通常需要一些結(jié)構(gòu)物質(zhì)的參與，諸如菌毛、鞭毛、凝集素、細(xì)菌蛋白和外膜囊泡等在最初的黏附過程中都起著關(guān)鍵的作用[11,20-21]。為了進(jìn)一步闡明Yu-PDS-RZ-1-SLG菌株黏附HeLa細(xì)胞與哪種黏附分子密切相關(guān)。試驗(yàn)中將菌株用胰蛋白酶處理后，發(fā)現(xiàn)能顯著抑制細(xì)菌的黏附，但是用胰蛋白酶處理的細(xì)菌的活力卻不受影響，表明細(xì)菌的某種表面蛋白參與黏附過程。鴨源雞桿菌表面假定的菌毛能夠促進(jìn)細(xì)菌黏附在雞組織表面，而且可能是多種蛋白質(zhì)參與細(xì)菌的黏附，增加了對易感宿主感染的可能性[11]。而在鴨源雞桿菌12656-12中已經(jīng)證實(shí)有4個(gè)假定的菌毛蛋白[22]，所以，Yu-PDS-RZ-1-SLG菌株黏附HeLa細(xì)胞過程是一種蛋白質(zhì)參與還是多種蛋白質(zhì)的協(xié)同作用還需要進(jìn)一步證實(shí)。因此，后續(xù)的工作主要是建立鴨源雞桿菌菌毛蛋白突變株，鑒定參與這些過程的分子，進(jìn)一步了解黏附機(jī)制。

致病菌與細(xì)胞的相互作用機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)。本研究證明分離自患輸卵管炎蛋雞的鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株對HeLa細(xì)胞具有黏附力和侵襲力，而分離自健康蛋雞的F149T株與前者的黏附和侵襲特性有明顯差異；黏附與侵襲具有時(shí)間及劑量依賴性，僅有限的細(xì)菌能黏附到細(xì)胞的表面，并表達(dá)與細(xì)胞表面相結(jié)合的蛋白質(zhì)，進(jìn)而黏附和侵入細(xì)胞，這些黏附相關(guān)蛋白質(zhì)可能在其致病過程中起到重要的作用，但其在菌體表面以何種形式存在，還有待進(jìn)一步研究。雖然體外細(xì)胞模型不能完全反映體內(nèi)的真實(shí)情況，并且HeLa細(xì)胞的表面受體與宿主雞輸卵管上皮細(xì)胞不一致，但很多試驗(yàn)表明，細(xì)菌對體外細(xì)胞的黏附力和侵襲力與其致病性呈平行關(guān)系。

4 結(jié) 論

以上研究表明，鴨源雞桿菌能黏附和侵入HeLa上皮細(xì)胞，此模型的建立為該病菌后期致病機(jī)制的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

[1] CHRISTENSEN H，BISGAARD M，BOJESEN A M，et al.Genetic relationships among avian isolates classified asPasteurellahaemolytica，ActinobacillussalpingitidisorPasteurellaanatiswith proposal ofGallibacteriumanatisgen.nov.，comb.nov.and description of additional genomospecies withinGallibacteriumgen.nov [J].IntJSystEvolMicrobiol，2003，53(1)：275-287.

[2] BOJESEN A M，SHIVAPRASAD H L.Genetic diversity ofGallibacteriumisolates from California turkeys [J].AvianPathol，2007，36(3)：227-230.

[3] BOJESEN A M，NIELSEN S S，BISGAARD M.Prevalence and transmission of haemolyticGallibacteriumspecies in chicken production systems with different biosecurity levels [J].AvianPathol，2003，32(5)：503-510.

[4] NEUBAUER C，DE SOUZA-PILZ M，BOJESEN A M，et al.Tissue distribution of haemolyticGallibacteriumanatisisolates in laying birds with reproductive disorders [J].AvianPathol，2009，38(1)：1-7.

[5] 王川慶，陳 陸，楊 霞，等.蛋雞群卡氏桿菌感染情況的初步研究 [J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008(3)：97-100，103. WANG C Q，CHEN L，YANG X，et al.A premilinary study ofGallibacteriumanantisinfection in laying hens[J].JournalofHenanAgriculturalSciences，2008(3)：97-100，103.(in Chinese)

[6] 王 珊，陳 陸，付仁一，等.我國部分地區(qū)蛋雞群鴨源雞桿菌血清流行病學(xué)調(diào)查 [J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，33(2)：114-117. WANG S，CHEN L，F(xiàn)U R Y，et al.Seroepidemiological survey ofGallibacteriumanantisinfection in layer chicken flocks in some provinces[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine，2011，33(2)：114-117.(in Chinese)

[7] AUBIN G G，HALOUN A，TREILHAUD M，et al.Gallibacteriumanatisbacteremia in a human [J].JClinMicrobiol，2013，51(11)：3897-3899.

[8] 黃留玉，史兆興，袁 靜，等.痢疾桿菌侵襲HeLa細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究 [J].微生物學(xué)報(bào)，2007，47(5)：810-816. HUANG L Y，SHI Z X，YUAN J，et al.Expression profile analysis of host HeLa cells invasived byShigellaflexneri2a[J].ActaMicrobiologicaSinica，2007，47(5)：810-816.(in Chinese)

[9] 恩特馬克·布拉提白，晁群芳，吾魯木汗·那扎爾別克，等.豬多殺性巴氏桿菌對HeLa細(xì)胞附著能力的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，41(4)：7. BORRATYBAY E，CHAO Q F，NAZARBEK U，et al.Study on adhesion of swinePasteurellamultocidastrains to HeLa cells [J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine，2005，41(4)：7.(in Chinese)[10] VACA S，MONROY E，ROJAS L，et al.Adherence ofGallibacteriumanatisto inert surfaces [J].JAnimVetAdv，2011，10(13)：1688-1693.

[11] LUCIO M L S，VACA S，VAZQUEZ C，et al.Adhesion ofGallibacteriumanatisto chicken oropharyngeal epithelial cells and the identification of putative fimbriae [J].AdvancesMicrobiol，2012，2(4)：505-510.[12] OTHMAN S，PARTON R，COOTE J.Interaction between mammalian cells andPasteurellamultocidaB：2.Adherence，invasion and intracellular survival [J].MicroPathog，2012，52(6):353-358.

[13] FRANDOLOSO R，MARTNEZ S，GUTIéRREZ-MARTN C B，et al.Haemophilusparasuisserovar 5 Nagasaki strain adheres and invades PK-15 cells [J].VetMicrobiol,2012，154(3-4)：347-352.

[14] ZEPEDA A，RAMREZ S，VEGA V，et al.Hemagglutinating activity ofGallibacteriumstrains [J].AvianDis，2009，53(1)：115-118.

[15] GOUNON P，JOUVE M，LE BOUGUéNEC C.Immunocytochemistry of the AfaE adhesin and AfaD invasin produced by pathogenicEscherichiacolistrains during interaction of the bacteria with HeLa cells by high-resolution scanning electron microscopy [J].MicrobesInfect，2000，2(4)：359-365.

[16] 李雪萍，錢雪琴,錢利生.志賀菌對HeLa細(xì)胞侵襲力的研究 [J].中國生物工程雜志，2005，25(6)：71-75. LI X P，QIAN X Q，QIAN L S.Study on invasiveness ofShigellato HeLa cells[J].ChinaBiotechnology，2005，25(6)：71-75.(in Chinese)

[17] 胡彩虹，夏枚生，熊 莉，等.嗜水氣單胞菌體外粘附Caco-2細(xì)胞對細(xì)胞膜生物學(xué)特性的影響 [J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，26(3)：281-283，287. HU C H，XIA M S，XIONG L，et al.Effects of aeromonas hydrophila adhesion on membrane characteristics of Caco-2 cellsinvitro[J].ChineseJournalofVeterinaryScience，2006，26(3)：281-283，287.(in Chinese)

[18] 曾巧英，陸承平.豬鏈球菌2型對扁桃腺上皮細(xì)胞的黏附和侵襲作用 [J].微生物學(xué)報(bào)，2004，44(4)：523-525. ZENG Q Y，LU C P.Adhesion and invasion of streptococcus suis type 2 to tonsil epithelial cells from neonatal rabbit[J].ActaMicrobiologicaSinica，2004，44(4)：523-525.(in Chinese)

[19] KRISTENSEN B M，F(xiàn)REES D，BOJESEN A M.GtxA fromGallibacteriumanatis，a cytolytic RTX-toxin with a novel domain organization [J].VetRes，2010，41(3)：25.

[20] DE OLIVEIRA-GARCIA D，DALL’AGNOL M，ROSALES M，et al.Fimbriae and adherence ofStenotrophomonasmaltophiliato epithelial cells and to abiotic surfaces [J].CellMicrobiol，2003，5(9)：625-636.

[21] BAGER R J，PERSSON G，NESTA B，et al.Outer membrane vesicles reflect environmental cues inGallibacteriumanatis[J].VetMicrobiol，2013，167(3-4)：565-572.

[22] JOHNSON T J，DANZEISEN J L，TRAMPEL D，et al.Genome analysis and phylogenetic relatedness ofGallibacteriumanatisstrains from poultry [J].PLoSOne，2013，8(1)：e54844.

(編輯 白永平)

Adhesion and Invasion Characteristics ofGallibacteriumanatisto HeLa Cells

ZHANG Xiu-ping，CHEN Lu，ZHAO Jun，WANG Chuan-qing，LI Yong-tao， LIU Hong-ying，PENG Zhi-feng，LU Cai-jing，JING Wen-xian，YANG Xia*

(InstituteofPoultryDiseases，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)

In order to determine the cell adhesion and invasion characteristics ofGallibacteriumanatis(G.anatis)，aninvitroHeLa cell model was established.The adhesion and invasion characteristics of 2 strains were evaluated by means of adhesion and invasion experiment，Gram and Giemsa staining，Scanning electron microscopy and Transmission electron microscopy.Adhesion counting assay demonstrated that the high adhesive ofG.anatisYu-PDS-RZ-1-SLG strain and adhering bacteria numbers were 0.84·cell-1，4.68·cell-1，8.52·cell-1，9.27·cell-1and 8.2 ·cell-1at 30，60，90，120，150 min after infection，respectively.G.anatisF149Tstrain revealed a weak adhesive level.Invasion assay showed weak invasive ofG.anatisYu-PDS-RZ-1-SLG strain and no invasion ofG.anatisF149Tstrain，and invading bacteria numbers ofG.anatisYu-PDS-RZ-1-SLG strain reached the maximum at 150 min，about 8.27 per 1 000 cells，but cell disruption，cell activity weakened subsequently.Staining results and electron microscopy experiments further confirmed thatG.anatisYu-PDS-RZ-1-SLG strain adhere to surface and invade Hela cells.Adherence was prevented by treating bacterial cells with trypsin，suggesting the participation of proteins in this process.The adhesive and invasive capacity could be an important ability for colonization of tissue surfaces ofG.anatis.The establishment of cell model provided the basis for further research on pathogenic mechanism ofG.anatis.

G.anatis;adhesion;invasion;HeLa cells

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.017

2014-06-09

國家自然科學(xué)基金(31302090)；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃(14IRTSTHN015)

張秀平(1986-)，女，河南商丘人，碩士生，主要從事分子病原學(xué)研究，E-mail：zhangxiuping722@163.com

*通信作者：楊 霞(1973-)，女，河南扶溝人，副教授，博士，主要從事分子病原學(xué)研究，E-mail：yangxia66@163.com

S852.612

A

0366-6964(2015)02-0295-08