尹正軍，岳 華，湯 承

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

綿羊肺炎支原體延伸因子Tu基因的分子特性分析

尹正軍，岳 華，湯 承*

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

對綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae)參考菌株Y98株和11個臨床分離株的tuf基因進行克隆、測序，生物信息學(xué)分析及構(gòu)建進化樹，分析綿羊肺炎支原體tuf基因的分子結(jié)構(gòu)特性。結(jié)果表明：Y98株和11株分離株tuf基因編碼區(qū)全長1 209 bp，編碼402個氨基酸，氨基酸相似性為93.3%～100%，有較高的抗原指數(shù)和抗原表位，不含信號肽，平均GC含量為39.80%。Y98株與10個分離株延伸因子Tu存在1個跨膜區(qū),含有6種不同的功能位點。而一分離株該蛋白質(zhì)存在2個跨膜區(qū)，在271—274位點多出1個N-糖基化位點。12個菌株的tuf基因有117個單核苷酸突變位點，其中無義突變?yōu)?1個，有義突變?yōu)?6個，造成53個推導(dǎo)的氨基酸變化，主要發(fā)生在325—354位點靠近羧基端，有可能導(dǎo)致該蛋白質(zhì)功能的改變?；谠摶虻倪z傳進化與全基因組建立的進化關(guān)系一致，比16S rRNA基因更適合作為綿羊肺炎支原體進化關(guān)系的分子靶標。該基因種內(nèi)保守同時也存在遺傳多樣性，作為分子分型的潛力值得進一步研究。

綿羊肺炎支原體；tuf基因；克??；分子特性；遺傳進化

綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae，Mo)是引起綿羊和山羊慢性非進行性肺炎的病原之一。Mo感染后使更多的呼吸道病原得以入侵，從而造成全球范圍內(nèi)養(yǎng)羊業(yè)的經(jīng)濟損失[1]。由于Mo無論在核酸還是蛋白質(zhì)水平上都存在明顯的異質(zhì)性，給此病的診斷和防治帶來了困難[2]。Mo基因組的釋放為研究Mo基因功能提供了方便[3]，但是目前對Mo毒力及免疫相關(guān)基因的了解不多，對重要結(jié)構(gòu)基因的遺傳多樣性也知之甚少。

細菌的蛋白質(zhì)合成可以分為三個步驟：起始、延伸、終止。延伸因子Tu(elongation factor Tu，EF-Tu)是由tuf基因編碼的蛋白質(zhì)，主要作用是負責(zé)肽鏈延伸，這是蛋白質(zhì)合成過程中最主要的步驟。它是最豐富的細菌蛋白質(zhì)[4-5]，在肺炎支原體中也大量的存在，也是構(gòu)成菌體膜蛋白成分之一[6]。它是一個GTP結(jié)合蛋白，不僅使tRNA移動到核糖體，而且監(jiān)管和確保蛋白質(zhì)完全翻譯，Tu包括三種不同的結(jié)構(gòu)域，每個域都有助于tRNA結(jié)合的位點[7]。此蛋白質(zhì)還在蛋白質(zhì)二硫化物的活性、類似伴侶性能及可能構(gòu)成質(zhì)膜成分等方面占有重要地位[8-10]。tuf基因功能保守，在真核生物、原核生物及古細菌中廣泛存在。由于它的遺傳穩(wěn)定性和廣泛分布性完全滿足作為遺傳進化分子靶標，已廣泛用于真菌、細菌和支原體的生物分類鑒定和系統(tǒng)進化分析[11-13]。但目前還未見關(guān)于綿羊肺炎支原體tuf基因結(jié)構(gòu)特征和遺傳多樣性的報道。本試驗旨在克隆綿羊肺炎支原體tuf基因，分析其分子特征及遺傳多樣性，為進一步研究該基因的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

綿羊肺炎支原體參考株Y98株和11株臨床分離株，編號為J15、J18、J24、J28、J43的來自J地，L3、L6、L9來自L地，Z32、Z33、Z34來自Z地，由西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實驗室保存。

1.2 主要試劑

改良的Tht培養(yǎng)基；膠回收試劑盒購自AXYGEN公司；DL2000 Marker購自TIANGEN公司；TaqDNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、pMD19-T載體、感受態(tài)DH5α購自TaKaRa公司；馬血清購自鄭州佰安生物工程有限公司；酵母浸出粉購自英國OXOID公司；PPLO肉湯購自法國BD公司；瓊脂糖購自O(shè)XOID英國公司；蛋白酶K購自美國Sigma公司。

1.3 主要設(shè)備

CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermostat，美國)、梯度PCR儀Px2(Thermo Hybaid 公司，美國)、凝膠成像系統(tǒng)Doc 2000(Bio-Rad公司，美國)、核酸電泳儀Powerpac universal TM(Bio-Rad公司，美國)、恒溫水浴器(國華電器，中國江蘇)、高速冷凍離心機(Eppendorf 公司，德國)、移液器(Eppendorf公司，德國)、純水儀Milli-Q(Millipore公司，法國)等。

1.4 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank公布的綿羊肺炎支原體SC01株tuf基因序列用Primer 5設(shè)計特異性引物，tuf-F：5′-ATGGCAGTTGTTAAAACTGGTGC-3′，tuf-R：5′-TTATTTAATAATTTCAGTTACTG-3′，擴增片段大小為1 209 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 目的基因的擴增

對各支原體培養(yǎng)物均采用酚-氯仿萃取法來提取總DNA。DNA提取后，用核酸蛋白檢測儀檢測核酸，A260 nm/A280 nm比值均在1.8～2.0，置于-20 ℃保存。反應(yīng)體系：10×Buffer 2.5 μL，dNTPs (各2.5 mmol·L-1)2 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)1.5 μL，tuf-F(10 μmol·L-1)1 μL，tuf-R(10 μmol·L-1) 1 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1) 0.125 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 補足至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，46 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共32個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，16 ℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物于10 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 目的基因的克隆和測序

按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件擴增125 μL PCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳后，采用膠回收試劑盒對目的片段進行純化回收，回收后再經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測正確后，將回收的DNA片段放置于-20 ℃保存，并按照pMD19-T載體推薦的連接體系進行連接，置于16 ℃過夜，然后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5α中，涂于瓊脂平板過夜培養(yǎng)，挑取陽性菌落，擴培，進行菌液PCR鑒定及測序。

1.7 分子特性分析

利用Lasergene 軟件分析綿羊肺炎支原體的tuf基因核酸序列和氨基酸序列的同源性；利用ProtParam軟件分析蛋白質(zhì)的理化參數(shù)(http://www.expasy.ch/tools/ protparam.html)；利用SignalP軟件預(yù)測信號肽(http://www.cbs.dtu.dk/servic es/SignalP/)；利用Tmpred軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)(http://www.ch.embnet.org/so ftware/TMPRED_form.html)；利用ProtScale軟件分析蛋白質(zhì)的疏水性(www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)；利用HNN軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)(http://npsa-pbil.ibcp)；利用DNAStar軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的抗原表位；利用PROSCAN軟件分析蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域(http://npsa-pbil.ibcp.fr/)；利用MEGA 4.1軟件采用Neighbor-joining法、自舉數(shù)據(jù)集為1 000次，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié) 果

2.1 擴增、測序結(jié)果與序列分析

綿羊肺炎支原體臨床分離株tuf基因的PCR擴增片段在1 200 bp左右出現(xiàn)一條特異性條帶，該片段與預(yù)期目的片段大小相符(圖1)。

M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標準；1.Y98 株擴增片段；2～12.臨床分離株擴增片段M.DL2000 DNA marker；1.Y98 PCR product；2-12.PCR products of 14 clinical isolates圖1 tuf 基因擴增片段Fig.1 Amplification of tuf by PCR

對11株臨床分離株和參考株Y98株tuf基因的編碼區(qū)進行克隆測序。結(jié)果表明，Y98株tuf基因編碼區(qū)長為1 209 bp，編碼402個氨基酸，含有1個TGA密碼子，在支原體中翻譯為色氨酸。11株臨床分離株tuf基因編碼區(qū)長為1 209 bp，編碼402個氨基酸，其中有2株分離株含有2個TGA密碼子，其他分離株只含1個TGA密碼子。

對11株臨床分離株和參考株Y98進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，12株綿羊肺炎支原體tuf基因的GC平均含量為39.80%，核酸相似性為93.3%～100%，氨基酸相似性為93.3%～100%。此基因兩端保守，但也存在變異位點，其中1—600 bp范圍內(nèi)突變率為2.5%，601—960 bp范圍內(nèi)突變率為6.94%，發(fā)生變異的位點主要在961—1 209 bp范圍內(nèi)突變率為30.9%。這12個菌株，有117個單核苷酸突變位點，其中無義突變?yōu)?1個，有義突變?yōu)?6個，推導(dǎo)53個氨基酸發(fā)生變化，氨基酸序列變化主要在靠近羧基端的325—354位點。

2.2 分離株綿羊肺炎支原體及其他支原體tuf基因序列和氨基酸序列比對與同源性分析

將綿羊肺炎支原體tuf基因序列與其他13種支原體的tuf基因序列及其編碼的氨基酸序列進行同源性比對，可知該基因序列與其他13種支原體的tuf基因核酸序列相似性為58.8%～84.3%，與M.hyopneumoniae的相似性為84.3%。氨基酸序列相似性為62.0%～98.1%,與M.hyopneumoniae的相似性為98.1%。在138—309 bp和1 047—1 196 bp這兩個區(qū)域內(nèi)與其他支原體種間差異較大，但種內(nèi)保守，為分子診斷提供了參考。

2.3 綿羊肺炎支原體延伸因子Tu蛋白質(zhì)特性分析2.3.1 蛋白質(zhì)基本特征分析 ProtParam軟件在線分析表明，Y98株該蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量為43 994.3 u，等電點為5.70，分子式為C1949H3140N532O597S13，半衰期為30 h，脂肪指數(shù)為88.03，不穩(wěn)定系數(shù)為32.86，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)總平均親水性為-0.264，為親水蛋白質(zhì)。Y98株該蛋白質(zhì)存在1個跨膜區(qū)，由98—115位之間的氨基酸組成。其中1株分離株含有2個跨膜區(qū)，其余分離株均為1個。2.3.2 信號肽預(yù)測分析 利用SignalP 4.1軟件分析結(jié)果顯示，Y98株和11株分離株均不含信號肽。2.3.3 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用HNN軟件預(yù)測Y98株蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，α螺旋占28.86%，延伸鏈占25.37%，無規(guī)卷曲占45.77%，推斷該蛋白質(zhì)為混合型蛋白質(zhì)；11株分離株也為混合型蛋白質(zhì)。

2.3.4 蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測 利用軟件分析Y98株該蛋白質(zhì)有6種功能位點，分別為： C-蛋白激酶磷酸化位點(43—45位、78—80位、181—183位、229—231位、236—238位、384—386位)；酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(166—169位、205—208位、265—268位、384—387位、396—399位)；酪氨酸激酶磷酸化位點(45—53位)；N-豆蔻?；稽c(46—51位、66—71位、180—185位、184—189位、232—237位、298—303位、380—385位)；ATP/GTP結(jié)合位點motif A(25—32位)；GTP結(jié)合延伸因子信號(57—72位)。其中1株分離株在271—274位點多了一種N-糖基化功能位點，其余分離株與Y98株一樣含有6種功能位點。

2.3.5 綿羊肺炎支原體tuf基因抗原表位分析 分析12個菌株氨基酸序列的抗原指數(shù)、親水性、表面可能性。表明在氨基酸序列位點7—19、59—65、75—83、117—214、257—264、320—341區(qū)域，親水性、抗原指數(shù)、表面可能性均較高，因此，這些區(qū)域都可能是B細胞表位(抗體表位)優(yōu)勢區(qū)域。如位點43—58、144—198、233—252、344—370、372—402區(qū)域表面可能性低，位于結(jié)構(gòu)蛋白內(nèi)部，但抗原指數(shù)卻較高，因此這些可能是潛在的候選抗原位點，也可能成為免疫優(yōu)勢輔助性T淋巴細胞抗原位點。

2.4 基于tuf基因的遺傳進化分析

基于tuf基因?qū)?4種支原體經(jīng)行種間遺傳進化關(guān)系分析，結(jié)果表明，綿羊肺炎支原體與豬肺炎支原體的遺傳關(guān)系最近，與結(jié)膜炎支原體遺傳關(guān)系次之，與其他常見能感染羊的支原體遺傳關(guān)系較遠(圖2)與基于支原體全基因組(圖3)的遺傳關(guān)系一致。而基于16S rRNA的遺傳關(guān)系(圖4)則顯示綿羊肺炎支原體與結(jié)膜炎支原體遺傳關(guān)系最近，與其他支原體遺傳關(guān)系較遠。

圖2 支原體tuf基因鄰近法進化樹Fig.2 Neighbor-joining consensus tree for Mycoplasma tuf

圖3 支原體全基因組鄰近法進化樹Fig.3 Neighbor-joining consensus tree for whole genome of Mycoplasma

圖4 支原體16S rRNA基因鄰近法進化樹Fig.4 Neighbor-joining consensus tree for Mycoplasma 16S rRNA

基于tuf基因?qū)?2株綿羊肺炎支原體進行種內(nèi)遺傳進化關(guān)系(圖5)，結(jié)果表明，11株分離株和Y98株單獨各聚一支，11株臨床分離株又分為2個亞支。有趣的是，來自Z地的3株分離株聚在一個亞支，來自J地的4株分離株聚在一個亞支，來自L地的分離株則不規(guī)則地分布在這2個亞支中。

圖5 綿羊肺炎支原體tuf基因鄰近法進化樹Fig.5 Neighbor-joining consensus tree for M.ovipneumonia tuf

3 討 論

本研究主要對12個綿羊肺炎支原體菌株的tuf基因進行克隆和序列分析，發(fā)現(xiàn)有117個單核苷酸突變位點，其中無義突變?yōu)?1個，有義突變?yōu)?6個，可引起53個推導(dǎo)氨基酸發(fā)生變化，氨基酸序列突變主要發(fā)生在近羧基端325—354位點。其中1株分離株在271—274位點(NKSL)多出1個N-糖基化功能位點，在327—348位點多出1個跨膜結(jié)構(gòu)域。有報道指出蛋白質(zhì)的N-糖基化修飾是生物體調(diào)控蛋白質(zhì)在組織和細胞中的定位、功能、活性、壽命和多樣性的一種普遍翻譯后方式，具有重要的意義[14]。但這1株和其他菌株在功能上究竟有無區(qū)別，還需進一步研究證實。

研究表明，tuf基因編碼的蛋白質(zhì)存在于細菌的表面，在肺炎支原體中亦如此[6,15]。支原體主要就是通過其特有的尖端結(jié)構(gòu)與宿主呼吸道上皮細胞支架外的纖連蛋白結(jié)合進而黏附，是造成感染宿主的首要步驟。S.F.Dallo等[16]證實肺炎支原體延伸因子Tu和丙酮酸脫氫酶的E1β亞基復(fù)合物是作為纖連蛋白的結(jié)合蛋白。S.Balasubramanian等[17]發(fā)現(xiàn)肺炎支原體延伸因子Tu表面暴露的羧基區(qū)域是主要與纖連蛋白結(jié)合的區(qū)域，意味著延伸因子Tu羧基區(qū)域在宿主感染過程中起重要的作用。鑒于原核生物tuf基因的功能保守性，作者推測綿羊肺炎支原體tuf基因也可能在黏附過程中發(fā)揮作用，有待于進一步試驗證實。

由于tuf基因在進化過程中相對保守，因此可作為遺傳進化的靶標來分析不同支原體間的遺傳進化關(guān)系。為此作者分別基于tuf、16S rRNA及全基因組基因?qū)Σ糠种гw的遺傳進化關(guān)系進行了比較，結(jié)果表明，基于tuf基因繪制的進化樹(圖2)顯示綿羊肺炎支原體和豬肺炎支原體親緣關(guān)系最近，結(jié)膜炎支原體次之，與其他常見感染羊的支原體親緣關(guān)系較遠；其次，基于16S rRNA基因(圖4) 繪制的進化樹則顯示綿羊肺炎支原體與結(jié)膜炎支原體親緣關(guān)系較近，而與豬肺炎支原體親緣關(guān)系有很大距離。這與基于tuf基因建立的進化關(guān)系相比有很大的不同。最后為了進一步確認遺傳進化關(guān)系，進行了基于支原體全基因組的遺傳進化分析(圖3)以確定綿羊肺炎支原體與其他支原體的親緣關(guān)系。在全基因組水平上，綿羊肺炎支原體與豬肺炎支原體親緣關(guān)系最近，這與基于tuf基因顯示的遺傳進化關(guān)系一致。因此推斷在綿羊肺炎支原體與其他支原體遺傳進化關(guān)系中tuf基因比16S rRNA基因更適合作為分子靶標。

由于支原體基因組的GC含量一般都較低，且不同菌株之間存在很大的異質(zhì)性而限制了分子檢測方法的建立[2]。綿羊肺炎支原體tuf基因的平均GC含量達到了39.8%，相對于綿羊肺炎支原體全基因組28.85%的GC含量已經(jīng)高了許多，相對較高的GC含量更有利于設(shè)計PCR檢測引物。R.S?derlund等[18]利用該基因建立了檢測貓支原體的熒光定量方法。作者的分析表明，綿羊肺炎支原體tuf基因在138—309 bp和1 047—1 196 bp區(qū)域內(nèi)與其他感染羊的支原體差異較大，但種內(nèi)保守，有作為設(shè)計檢測綿羊肺炎支原體的分子靶點的潛力。綿羊肺炎支原體tuf基因雖然保守，但不同菌株在核苷酸序列和氨基酸序列都存在遺傳多樣性。由圖5可見，參考株和11株分離株親緣關(guān)系較遠，而11株分離株又分成兩大枝4個亞支，來自Z地的分離株都聚在一個亞支上，來自J地的5個分離株有4個也聚在一個亞支上，而來自L地的則分布在不同的亞支上。O.Makarova等[19]基于支原體tuf基因建立了鑒定支原體的DNA條碼技術(shù)的方法；J.H.Shin等[20]以tuf基因為靶標建立了PCR限制性片段長度多態(tài)性分析方法用于非結(jié)核性分支桿菌的分子分型。以上報道證明在一些原核生物中tuf基因可用于分子分型。因此，進一步增加不同來源的菌株數(shù)量，評價tuf基因作為綿羊肺炎支原體分子分型的潛力，是一項值得研究的工作。

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(編輯 白永平)

Molecular Characterization of the Elongation FactorTuGene inMycoplasmaovipneumoniae

YIN Zheng-jun，YUE Hua，TANG Cheng*

(CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China)

This study aimed at analyzing the molecular characterization of thetufgene inMycoplasmaovipneumoniae.Thetufgenes of the reference Y98 strain and 11 clinical isolates were cloned and sequenced，and then were used for bioinformatics analysis.A phylogenetic tree was constructed base on thetufgenes.The results showed that the open-reading frames (ORFs) oftufgenes in all the strains were 1 209 bp，which encoded 402 amino acids with 93.3%-100% amino acid identity and possessed higher antigenic index and higher lymphocyte epitopes.The average GC content of the protein coded bytufgene was 39.80%.The Tuf proteins of reference Y98 strain and 10 clinical isolates contained one strong transmembrane region and were absence of signal peptide，and contained six different functional sites.While another isolate contained two transmembrane regions，with a additional N-glycosylation site in the site of 271-274.The genes from 12 strains were identified 117 single nucleotide polymorphisms (SNPs)，consisting of 41 synonymous polymorphisms and 76 non-synonymous polymorphisms leading to 53 amino acid changes，mainly in 325-354 region near the carboxyl region，which maybe leading to change the function of this protein.The phylogenetic relationship ofM.ovipneumoniaebased on whole genome and that based on thetufgene were consistent.So，thetufgene is a better target than 16S rRNA gene for the phylogenetic analysis forM.ovipneumoniae.Despite of its conservation，thetufgene still showed genetic diversity within the strains，making it potential for molecular typing.

Mycoplasmaovipneumoniae；elongation factorTugene；cloning；molecular characterization；phylogenetic

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.016

2014-05-22

“十二五”高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2012AA101304)

尹正軍(1989-)，男，江蘇丹陽人，碩士，主要從事臨床病原微生物快速檢測技術(shù)的研究，E-mail：yinzhengjun1989@163.com

*通信作者：湯 承，E-mail：tangcheng101@163.com

S852.62

A

0366-6964(2015)02-0288-07