梁恩濤，陳 杰，黃小波,2*，文心田,2，曹三杰,2，吳學(xué)婧，朱書權(quán)

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，動物傳染病與基因芯片實驗室，雅安 625014；2．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)人獸共患病研究室與豬病防治研究中心，成都 611130)

三株遞呈豬流行性腹瀉病毒S基因的減毒鼠傷寒沙門菌的生物學(xué)特性研究

梁恩濤1，陳 杰1，黃小波1,2*，文心田1,2，曹三杰1,2，吳學(xué)婧1，朱書權(quán)1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，動物傳染病與基因芯片實驗室，雅安 625014；2．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)人獸共患病研究室與豬病防治研究中心，成都 611130)

為了探究減毒沙門菌遞呈不同長度豬流行性腹瀉病毒(PEDV)S基因的可行性，本研究對3株攜帶不同長度S基因片段的減毒鼠傷寒沙門菌進行了生物學(xué)特性評估。主要進行了對所構(gòu)建的重組減毒沙門菌菌株SL7207(pVAX-S499-650)(長456 bp，編碼 S蛋白N末端499—650位氨基酸)、SL7207(pVAX-S499-789)(長873 bp，編碼S蛋白N末端499—789位氨基酸)和前期構(gòu)建的菌株SL7207(pVAXD-S1-789)(長2 367 bp，編碼S蛋白N末端1—789位氨基酸)的生物學(xué)特性研究，包括生長曲線測定、攜帶質(zhì)粒的體內(nèi)/外穩(wěn)定性、回腸組織內(nèi)的轉(zhuǎn)錄、在小鼠體內(nèi)動態(tài)增殖規(guī)律、小鼠口服的安全性等。結(jié)果表明：SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)、SL7207(pVAXD-S1-789)3種口服菌株均具有較高的穩(wěn)定性；攜帶的目的基因可在腸道組織內(nèi)轉(zhuǎn)錄；菌株在小鼠肝、脾中增殖約5周后逐漸被機體清除；小鼠口服具有良好的安全性。本研究結(jié)果表明減毒鼠傷寒沙門菌SL7207可遞呈不同長度的S基因抗原片段，為后續(xù)開展3種菌株的實際口服免疫效果比較研究奠定了基礎(chǔ)。

豬流行性腹瀉病毒；S基因；減毒鼠傷寒沙門菌；口服；生物學(xué)特性

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的以持續(xù)性腹瀉、脫水和對哺乳仔豬高致病率、高死亡率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病[1]。PEDV感染仔豬的靶器官是小腸，局部腸道黏膜免疫對阻止病毒的入侵具有重要作用?，F(xiàn)有滅活苗不能產(chǎn)生有效的腸道黏膜免疫；弱毒苗雖然能刺激產(chǎn)生一定的黏膜免疫保護力，但存在散毒及毒力返強的潛在風險，因此開發(fā)研制能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平腸道黏膜免疫的新型疫苗是PEDV疫苗研究的新方向[2]。

PEDV為有囊膜的RNA病毒，S蛋白是位于病毒囊膜表面的纖突糖蛋白，由1 383個氨基酸殘基(amino acids，aa)構(gòu)成，在決定細胞親嗜性[3]、致病性[4]、誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性抗體[5]等方面起著關(guān)鍵作用。S蛋白具有29個潛在N-糖基化位點[6]，包含核心抗原區(qū)域(499—638 aa)和2個B淋巴細胞位點(744—755 aa、756—771 aa)[7-9]，具備良好的免疫原性且是誘導(dǎo)產(chǎn)生保護性中和抗體的結(jié)構(gòu)蛋白，因此S基因是PEDV基因工程疫苗的主要抗原靶基因。

以減毒沙門菌為載體的疫苗具有口服免疫方便，能激發(fā)強烈的局部黏膜免疫、體液免疫和細胞免疫，自身具有免疫佐劑效應(yīng)等許多優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于病毒[10]、細菌[11]、寄生蟲[12]等口服疫苗的研究。減毒沙門菌是構(gòu)建口服疫苗較好的菌株載體，但良好的口服免疫效果與攜帶的目的基因表達量有關(guān)系，通常目的蛋白質(zhì)的表達效果與重組菌株在機體內(nèi)的穩(wěn)定性、增殖情況、攜帶基因的長度等有一定關(guān)系[13]。

本研究結(jié)合PEDV的腸道致病性特點、PEDV S蛋白良好的免疫原性并誘導(dǎo)產(chǎn)生保護性中和抗體及減毒沙門菌可誘導(dǎo)產(chǎn)生局部腸道黏膜免疫反應(yīng)機制，以減毒鼠傷寒沙門菌SL7207為載體，在保證抗原免疫原性的前提下，對攜帶3個不同長度的S基因片段(S499-650：長456 bp，編碼PEDV S蛋白N末端499—650位氨基酸，為S蛋白核心抗原區(qū)域；S499-789：長873 bp，編碼PEDV S蛋白N末端499—789位氨基酸，包含S蛋白核心抗原區(qū)域及2個B淋巴細胞位點；S1-789：長2 367 bp，編碼S蛋白1—789位氨基酸，為S蛋白主要抗原編碼區(qū)域)和不同質(zhì)粒DNA長度(分別為3 456、3 873、6 252 bp)的減毒沙門菌SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)、SL7207(pVAXD-S1-789)的生物學(xué)特性進行了比較研究，為篩選穩(wěn)定高效的PEDVS基因口服菌株和開展口服免疫評價奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株、細胞和動物

豬流行性腹瀉病毒SC-L株，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病實驗室分離保存；減毒沙門菌SL7207(pVAXD-S1-789)，由本室前期構(gòu)建[14]；大腸桿菌DH5α、鼠傷寒減毒沙門菌SL7207、COS-7細胞、pVAX1質(zhì)粒均由本實驗室提供； BALB/c小鼠(雌性，6周齡，清潔級)購自成都生物制品研究所。

1.2 主要試劑

兔抗PEDV陽性血清由本室制備保存；FITC標記羊抗兔IgG抗體為北京博奧森公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD19-T simple Vector、T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物工程有限公司；總RNA抽提試劑盒、2×TaqPCR Master-Mix 、DNA相對分子質(zhì)量標準等，購自北京天根生物工程有限公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒Endo-Free Plasmid Mini KitⅠ、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自美國OMEGA公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。

1.3 引物

參照GenBank公布的SL-C株S基因cDNA序列(Accession number：KC886306)，設(shè)計3條引物。序列如下，共用上游引物P1：5′-CGAAGCTT-ACCATGGCCACTTTGCCATCATTC-3′(劃線處為HindⅢ酶位點)；下游引物P2：5′-GGGAATTCTCTGATAGTATACTTGGTACACAC-3′(劃線處為EcoRⅠ酶位點)；下游引物P3：5′-GGGAATTCTCTAATACTCATACTAAAGT-3′(劃線處為EcoRⅠ酶位點)。其中,P1/P2用于擴增S499-650基因；P1/P3用于擴增S499-789基因。引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.4 不同大小的S抗原基因的克隆與鑒定

參照總RNA抽提試劑盒要求，以PEDV細胞培養(yǎng)毒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s。取cDNA 1 μL，用引物P1/P2、P1/P3分別進行PCR擴增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。取10 μL PCR產(chǎn)物于10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物膠回收純化與pMD19-T simple vector連接，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，再涂布于含Amp(100 μg·mL-1)的LB平板，37 ℃培養(yǎng)16 h后，挑取抗Amp陽性菌落擴大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒進行PCR鑒定及HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切鑒定，并送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，將獲取的重組質(zhì)粒命名為pMD19-T-S499-650、pMD19-T-S499-789。

1.5S基因真核表達載體的構(gòu)建

利用HindⅢ/EcoRⅠ對pMD19-T-S499-650、pMD19-T-S499-789、pVAX1分別進行雙酶切，分別電泳回收目的基因片段，利用T4 DNA連接酶 16 ℃連接過夜后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。涂布于含Kan(100 μg·mL-1)的LB平板，37 ℃培養(yǎng)16 h，挑取抗Kan陽性菌落擴大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒進行PCR及HindⅢ/EcoRⅠ酶切鑒定。獲取的重組質(zhì)粒命名為pVAX-S499-650、pVAX-S499-789。

1.6S基因真核表達質(zhì)粒的體外表達與鑒定

當接種于6孔板的COS-7細胞生長至70%～80%匯集時，按LipofectamineTM2000使用說明書將去內(nèi)毒素抽提的質(zhì)粒pVAX1、pVAX-S499-650、pVAX-S499-789分別進行細胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染36 h后，對COS7細胞固定，封閉，于培養(yǎng)孔中分別加入1∶50稀釋的兔抗PEDV陽性血清作一抗，37 ℃孵育2 h；以PBS洗滌3次，加入1 ∶50倍稀釋的FITC標記羊抗兔IgG作二抗；于濕盒中37 ℃孵育2 h，PBS洗滌3次，滴加90%甘油水溶液，于倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.7 攜帶S基因的重組沙門菌株的構(gòu)建

將質(zhì)粒pVAX-S499-650、pVAX-S499-789以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入減毒鼠傷寒沙門菌SL7207感受態(tài)細胞中，電轉(zhuǎn)參數(shù)設(shè)置：電壓2.5 kV、電阻200 Ω、電容25 μF、電擊時間3 s。將電轉(zhuǎn)產(chǎn)物涂布于含Kan抗性的平板，37 ℃培養(yǎng)16 h，挑取抗Kan陽性菌落擴大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒進行PCR及HindⅢ/EcoRⅠ酶切鑒定。將鑒定正確的菌株命名為SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)。

1.8 三株重組沙門菌株的生長曲線測定

將挑單活化的SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)與前期構(gòu)建的SL7207(pVAXD-S1-789)以1∶100的比例接種于含Kan (100 μg·mL-1)的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 100 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，每間隔2 h 取菌液倍比稀釋后涂布于3個含Kan (100 μg·mL-1)的LB 平板，37 ℃培養(yǎng)16 h后菌落計數(shù)，以3個平板上菌落平均數(shù)的對數(shù)繪制生長曲線。

1.9 三株重組沙門菌株的體外穩(wěn)定性試驗

將挑單活化的SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)、SL7207(pVAXD-S1-789)以1∶100的比例接種于普通LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃100 r·min-1振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，分別取100 μL菌液利用滅菌PBS溶液進行適當稀釋，取稀釋菌液100 μL分別涂布3個含Kan和3個不含Kan的LB平板，37 ℃培養(yǎng)16 h后進行菌落計數(shù)。另取50 μL菌液繼續(xù)傳代培養(yǎng)24 h后，重復(fù)此操作，連續(xù)重復(fù)7次。計算非抗性條件下重組沙門菌攜帶質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

1.10 三株重組沙門菌株在小鼠體內(nèi)的穩(wěn)定性及目的基因的轉(zhuǎn)錄檢測

分別以1×108CFU·只-1劑量對小鼠灌胃免疫SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)、SL7207(pVAXD-S1-789)，設(shè)立PBS空白對照組。分別于免疫后第1、3、5、7天，撲殺小鼠，取小鼠肝、脾、回腸，于含0.1%Triton的PBS溶液中研磨靜置10 min后，分別涂布于含Kan和不含Kan的SS平板中，37 ℃培養(yǎng)16 h后，進行菌落計數(shù)，分析重組菌株在小鼠體內(nèi)的穩(wěn)定性。另抽提小鼠的派伊結(jié)(Peyer’s patches，PPS)較為集中的回腸組織的總RNA，進行RT-PCR檢測，觀察目的基因S499-650、S499-789、S1-789在小鼠腸道組織內(nèi)的轉(zhuǎn)錄情況。

1.11 三株重組沙門菌株口服接種小鼠的安全性試驗及體內(nèi)增殖試驗

BALB/c小鼠隨機分成3組，每組各15只，分別以1×109CFU·只-1劑量灌胃免疫SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)、SL7207(pVAXD-S1-789)，設(shè)立PBS空白對照組。首免后2周以相同劑量加強免疫。從首免后開始，連續(xù)觀察免疫小鼠有無異常癥狀(食欲、飲欲和精神狀況等)，連續(xù)觀察5周，同時每周各組隨機處死3只小鼠，剖檢觀察肝、脾、小腸等器官有無病變，并取首免后第三周時的小鼠回腸進行組織病理學(xué)觀察。另取肝、脾各1 g左右，于2 mL含0.1%Triton的PBS溶液中研磨靜置10 min后，取100 μL組織懸液涂抹于含Kan的SS平板中，37 ℃培養(yǎng)16 h后，進行菌落計數(shù)，分析重組菌株在小鼠體內(nèi)的增殖消減情況。

2 結(jié) 果

2.1S基因抗原基因的克隆與鑒定

采用RT-PCR擴增的2個S基因大小分別為500、900 bp左右(圖1)。質(zhì)粒pMD19-T-S499-650、pMD19-T-S499-789的PCR產(chǎn)物與HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切產(chǎn)物片段大小與預(yù)期相符(圖2)。S499-650、S499-789的基因測序顯示，目的基因長度分別為456和873 bp，序列分析顯示與PEDV SC-L株S基因完全相同。

M.DNA Marker III相對分子質(zhì)量標準；1、2.S499-650基因擴增；3、4.S499-789基因擴增M.DNA Marker III；1，2.Amplification of S499-650 gene；3，4.Amplification of S499-789 gene圖1 S499-650 、S499-789基因擴增Fig.1 The amplification of PEDV S499- 650，S499-789

M.DNA Marker III相對分子質(zhì)量標準；1.S499-650基因擴增；2.pMD19-T-S499-650 HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切鑒定；3.S499-789基因擴增；4.pMD19-T- S499-789 HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切鑒定M.DNA Marker III；1.Amplification of S499-650 gene；2.pMD19-T-S499-650 digested by HindⅢ，EcoRⅠ；3.Amplification of S499-789 gene；4.pMD19-T-S499-789 digested by HindⅢ，EcoRⅠ圖2 pMD19-T-S499-650、pMD19-T-S499-789的鑒定Fig.2 The identification of pMD19-T-S499-650，pMD19-T-S499-789

2.2S基因真核表達載體的鑒定

質(zhì)粒pVAX-S499-650、pVAX-S499-789的PCR產(chǎn)物與HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切產(chǎn)物片段大小與預(yù)期相符(圖3)。證明真核表達載體pVAX-S499-650、pVAX- S499-789構(gòu)建成功。

M.DNA Marker III相對分子質(zhì)量標準；1.S499-650基因擴增；2.pVAX-S499-650 HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切鑒定；3.S499-789基因擴增；4.pVAX-S499-789 HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切鑒定M.DNA Marker III；1.Amplification of S499-650 gene；2.pVAX-S499-650 digested by HindⅢ，EcoRⅠ；3.Amplification of S499-789 gene；4.pVAX-S499-789 digested by HindⅢ，EcoRⅠ圖3 pVAX-S499-650、pVAX-S499-789的鑒定Fig.3 The identification of pVAX -S499-650，pVAX -S499-789

2.3 真核表達載體的體外表達與鑒定

轉(zhuǎn)染真核表達質(zhì)粒36 h后的COS-7細胞IFA

鑒定結(jié)果顯示：質(zhì)粒pVAX-S499-650、pVAX-S499-789轉(zhuǎn)染組有特異性綠色熒光，而pVAX1轉(zhuǎn)染組無特異性熒光(圖4)，表明pVAX-S499-650、pVAX-S499-789在COS-7細胞中，可正常表達S499-650、S499-789蛋白，且能與PEDV特異性抗體發(fā)生反應(yīng)。

A.轉(zhuǎn)染pVAX-S499-650的COS-7細胞；B.轉(zhuǎn)染pVAX-S499-789的COS-7細胞；C.轉(zhuǎn)染pVAX1的COS-7細胞A.pVAX-S499-650 transfected COS-7 cell；B.pVAX-S499-789 transfected COS-7 cell；C.pVAX1 transfected COS-7 cell圖4 pVAX-S499-650、pVAX-S499-789表達產(chǎn)物的間接免疫熒光鑒定Fig.4 Indirect immunofluorescence detection of the expression of pVAX-S499-650，pVAX-S499-789

2.4 攜帶S基因的重組沙門菌株的鑒定

將構(gòu)建的重組沙門菌擴大培養(yǎng)后，抽提質(zhì)粒，進行PCR及HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切產(chǎn)物條帶與預(yù)期相符(圖5)。證明真核表達載體pVAX-S499-650、pVAX-S499-789成功電轉(zhuǎn)入鼠傷寒減毒沙門菌SL7207，SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)構(gòu)建成功。

2.5 三株重組減毒沙門菌株的生長曲線

重組沙門菌在接種4 h后迅速進入對數(shù)生長期；在培養(yǎng)第6-16小時時，為細菌生長穩(wěn)定期；于接種16 h后，細菌開始進入衰亡期。攜帶質(zhì)粒DNA片段越長的重組沙門菌株，其生長越緩慢(圖6)。2.6 三株重組沙門菌株的體外穩(wěn)定性試驗

體外培養(yǎng)穩(wěn)定性試驗表明，在不含Kan抗性的培養(yǎng)環(huán)境下，重組沙門菌中的質(zhì)粒隨著細菌的增殖而逐漸丟失，在連續(xù)培養(yǎng)4 d后(傳代約80代)，質(zhì)粒攜帶率降至50%以下；連續(xù)培養(yǎng)7 d時(傳代約140代)，SL7207(pVAXD-S1-789)攜帶率降至1.2%，SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)仍均保持在6%以上；攜帶質(zhì)粒DNA片段越長，重組菌株的穩(wěn)定性越差(圖7)。

M.DNA Marker III相對分子質(zhì)量標準；1.S499-650基因擴增；2.pVAX-S499-650 HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切鑒定；3.SL7207(pVAX-S499-650)沙門菌鑒定；4.S499-789基因擴增；5.pVAX-S499-789 HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切鑒定；6.SL7207(pVAX-S499-789)沙門菌鑒定M.DNA Marker III；1.Amplification of S499-650 gene；2.pVAX-S499-650 digested by HindⅢ，EcoRⅠ；3.Identification of Salmonella SL7207(pVAX-S499-650)；4.Amplification of S499-789 gene；5.pVAX-S499-789 digested by HindⅢ，EcoRⅠ；6.Identification of Salmonella SL7207(pVAX-S499-789)圖5 SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)的鑒定Fig.5 The identification of SL7207(pVAX-S499-650)，SL7207(pVAX-S499-789)

圖6 重組減毒沙門菌株的生長曲線Fig.6 Growth curve of the recombinant Salmonella typhimurium strains

圖7 重組沙門菌的體外穩(wěn)定性分析Fig.7 The stability of recombinant Salmonella typhimurium strains harbouring plasmids in vitro

2.7 三株重組沙門菌株在小鼠體內(nèi)的穩(wěn)定性

體內(nèi)穩(wěn)定性顯示：隨著重組沙門菌株在小鼠體內(nèi)增殖，菌體攜帶的質(zhì)粒也逐漸穩(wěn)定丟失。在免疫后第7天，重組菌株質(zhì)粒攜帶率為50%，但SL7207(pVAXD-S1-789)攜帶率與SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)相差在5%左右；攜帶質(zhì)粒DNA片段越長，重組菌株在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定性越差(圖8)。

圖8 重組沙門菌株的體內(nèi)穩(wěn)定性分析Fig.8 The stability of recombinant Salmonella typhimurium strains harbouring plasmids in vivo

2.8 三株重組沙門菌株在小鼠體內(nèi)的穩(wěn)定性及目的基因的轉(zhuǎn)錄檢測

小鼠灌胃接種不同重組菌株后第1、3、5、7天采集回腸末端，提取細胞總RNA，通過RT-PCR檢測抗原基因在組織內(nèi)的轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果顯示在免疫后第3、5、7天可擴增出預(yù)期片段；對照組PBS免疫小鼠腸道總RNA的RT-PCR 結(jié)果為陰性(圖9)。

M.DNA Marker III相對分子質(zhì)量標準；1～4.接種SL7207(pVAX-S499-650)后第1、3、5、7天；5～8.接種SL7207(pVAX-S499-789)第1、3、5、7天；9～12.接種SL7207(pVAXD-S1-789)后第1、3、5、7天；13～16.接種PBS后第1、3、5、7天M.DNA Marker III；1-4.Day 1，3，5，7 post-immunization with SL7207(pVAX-S499-650)；5-8.Day 1，3，5，7 post-immunization with SL7207(pVAX-S499-789)；9-12.Day 1，3，5，7 post-immunization with SL7207(pVAXD-S1-789)；13-16.Day 1，3,5,7 post-immunization with PBS圖9 RT-PCR檢測S基因在回腸內(nèi)的轉(zhuǎn)錄Fig.9 RT-PCR to detect the transcription of S gene in ileum

2.9 三株重組沙門菌株在小鼠體內(nèi)的增殖試驗

臟器懸液菌落計數(shù)顯示，在首次免疫后第1周，不同菌株免疫組小鼠肝、脾內(nèi)均可分離到重組細菌；首免后第2周，菌落數(shù)有所下降；二次免疫后第1周，菌落數(shù)略微上升后急劇下降，于二免后第3周脾中的菌落數(shù)幾乎都為零，而肝中的菌落數(shù)以SL7207(pVAXD-S1-789)幾乎為零，而SL7207(pVAX-S499-789)、SL7207(pVAX-S499-650)仍然可明顯分離到。這表明重組沙門氏菌完成質(zhì)粒傳遞后，逐漸被機體清除，但攜帶不同長度質(zhì)粒DNA的重組菌株在體內(nèi)穩(wěn)定性存在一定的差異，攜帶質(zhì)粒DNA長度越長的減毒沙門菌株，菌落數(shù)越低，也越早被機體清除(圖10)。

圖10 重組菌株在肝(A)和脾(B)中的增殖Fig.10 Colonization of recombinant Salmonella typhimurium in liver (A) and spleen (B)

2.10 三株重組沙門菌株口服接種小鼠的安全性

連續(xù)5周對各組試驗小鼠進行觀察，灌胃后的1～2 d，由于應(yīng)激反應(yīng)，部分小鼠出現(xiàn)扎堆、精神不振和食欲降低的現(xiàn)象；繼續(xù)觀察，小鼠的食欲、飲欲和精神狀況恢復(fù)正常。解剖小鼠，重組沙門菌菌株免疫組小鼠與PBS對照組小鼠的肝、脾及小腸等器官均未見明顯病理變化?；啬c組織病理切片顯示：回腸組織出現(xiàn)腸壁固有層與肌層分離；小腸絨毛脫落變短；小腸絨毛上皮細胞減少，杯狀細胞增多等病理變化(圖11)。

A.腸壁固有層與肌層分離(100×)；B.小腸絨毛脫落(100×)；C.小腸絨毛上皮細胞減少，杯狀細胞增多(400×)A.Lamina propria is separated with muscle layer in intestinal wall (100×)；B.Shedding of intestinal villi (100×)；C.Epithelium cells decreased and goblet cells increased in intestinal villi (400×)圖11 重組沙門菌免疫小鼠回腸組織的病理變化Fig.11 Pathological change of ileum tissue of mouse immunized with recombinant Salmonella

3 討 論

目的基因的選擇對所構(gòu)建的重組疫苗的免疫原性有決定性作用。本研究所選擇3個不同長度的S基因片段：S499-650編碼S蛋白核心抗原區(qū)域[7]；S499-789編碼S蛋白核心抗原區(qū)域及2個B淋巴細胞位點[8]；S1-789編碼S蛋白主要抗原區(qū)域[9]，均具有良好的免疫原性?？乖虻拈L度也對所構(gòu)建的重組疫苗的免疫原性有重要影響，通?？乖蛟介L，反轉(zhuǎn)錄的mRNA就越長，越易形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，阻止mRNA與核糖體的結(jié)合，導(dǎo)致抗原蛋白質(zhì)表達量不足[15]；此外，質(zhì)粒DNA的長度越長，重組菌株在體內(nèi)外穩(wěn)定性越差，質(zhì)粒DNA的傳遞效率越低，進而影響抗原蛋白質(zhì)的表達量。結(jié)合本研究，攜帶質(zhì)粒DNA長度為6 252 bp的SL7207(pVAXD-S1-789)在體內(nèi)/外穩(wěn)定性均低于攜帶質(zhì)粒DNA長度分別為3 456、3 873 bp的 SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)；由于在體內(nèi)穩(wěn)定性的差異，SL7207(pVAXD-S1-789)在小鼠肝、脾的增殖量也均低于SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)。這些都將會對SL7207(pVAXD-S1-789)在機體內(nèi)的免疫效果產(chǎn)生影響。

沙門菌通過消化道感染機體后，可在侵襲基因沙門菌致病島(Salmonellapathogenicity island Ⅰ，SPI1)的作用下入侵主要位于回腸末端的微皺褶細胞(microfold cell，M細胞)；也可被樹突狀細胞(dendritic cell，DCs)直接捕獲。進入機體后，被CD18+分泌的吞噬細胞吞噬并輸送到達肝、脾等處[16]，因此沙門菌具備良好的侵襲力。減毒鼠傷寒沙門菌SL7207由于缺失了aroA基因，在保持良好的侵襲力的同時毒力大大降低[17]，已被廣泛應(yīng)用于重組口服疫苗的制備。攜帶外源DNA的重組沙門菌侵入機體后，由于菌體發(fā)生溶解而釋放外源DNA，使抗原基因在體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而誘導(dǎo)相應(yīng)的細胞免疫和體液免疫反應(yīng)[13]。選擇派伊結(jié)等免疫組織集中的回腸末端進行目的基因的轉(zhuǎn)錄試驗表明，抗原基因可在腸道內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄，進而表達抗原蛋白質(zhì)，從而誘導(dǎo)強烈的腸道黏膜免疫反應(yīng)；小鼠肝、脾內(nèi)的增殖試驗則顯示了以減毒鼠傷寒沙門菌SL7207為載體的重組減毒沙門菌株具有良好的侵襲力，可在機體內(nèi)增殖，并在機體免疫系統(tǒng)的作用下逐漸被清除；小鼠的安全性試驗及回腸末端的病理變化顯示，口服重組沙門菌后，會對小腸造成一定的組織損傷，但損傷不足以引起腹瀉等臨床癥狀及肉眼可見的病理變化，因此表明三株重組菌株是安全的，同時，杯狀細胞數(shù)量增多，顯示腸道分泌黏液能力和對抗原呈遞作用的加強[18]，這表明在減毒沙門菌的刺激下，腸道局部黏膜反應(yīng)增強。這些研究結(jié)果均顯示了重組菌株作為PEDV口服疫苗的可行性。

本研究對不同長度的S基因的體外表達和體內(nèi)穩(wěn)定性也進行了研究和比較，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pVAX-S499-650、pVAX-S499-789轉(zhuǎn)染COS-7細胞后，從體外證實均可表達出S蛋白而顯示出特異性的熒光，隨后將構(gòu)建的重組減毒沙門菌SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)與SL7207(pVAXD-S1-789)的生物學(xué)特性進行比較，結(jié)果表明攜帶3種不同大小的PEDVS抗原基因能夠在小鼠腸道組織中進行一定時間的轉(zhuǎn)錄，且3株減毒沙門菌菌株均具有較高的質(zhì)粒穩(wěn)定性及良好的口服安全性，可在小鼠體內(nèi)進行增殖，但會逐漸被機體所清除，避免了免疫耐受情況的產(chǎn)生。以上結(jié)果表明：SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)、SL7207(pVAXD-S1-789)可以穩(wěn)定攜帶不同大小的S基因片段，初步具備作為疫苗菌株的條件，但實際的口服免疫效果需要動物免疫評價，本研究后續(xù)擬在豬體開展這三株疫苗的免疫效果評價，并與當前的商品化疫苗進行比較，為科學(xué)評估新型PEDV口服疫苗的可行性提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

構(gòu)建攜帶不同長度豬流行性腹瀉病毒S基因片段重組減毒沙門菌菌株SL7207(pVAX-S499-650)(攜帶片段長456 bp，編碼S蛋白N末端499—650位氨基酸)、SL7207(pVAX-S499-789)(攜帶片段長873 bp，編碼S蛋白N末端499—789位氨基酸)，隨后比較SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)與前期構(gòu)建的菌株SL7207(pVAXD-S1-789)(攜帶片段長2 367 bp，編碼S蛋白N末端1—789位氨基酸)的生物學(xué)特性，3種口服菌株均具有較高的穩(wěn)定性；攜帶的目的基因可在腸道組織內(nèi)轉(zhuǎn)錄；菌株在小鼠肝、脾中增殖約5周后逐漸被機體清除；具有良好的口服安全性?？梢姕p毒鼠傷寒沙門菌SL7207可遞呈不同長度的S基因抗原片段。

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(編輯 白永平)

Study on the Biological Characteristics of Three AttenuatedSalmonellatyphimuriumStrains Harboring Porcine Epidemic Diarrhea VirusSGene

LIANG En-tao1，CHEN Jie1,HUANG Xiao-bo1,2*，WEN Xin-tian1,2， CAO San-jie1,2，WU Xue-jing1，ZHU Shu-quan1

(1.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Ya’an625014，China；2.LaboratoryofZoonosisandPigDiseasePreventionResearchCenter，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

To explore the feasibility of attenuatedSalmonellatyphimuriumas the carrier of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV)Sgene，the biological characteristics of three recombinant attenuatedSalmonellastrains harboring varying length of PEDVSgene were researched.The biological characteristics research of SL7207(pVAX-S499-650) (456 bp，encoding 499-650 amino acid of N-termanal S protein，SL7207(pVAX- S499-789) (873 bp，encoding 499-789 amino acid of N-termanal S protein)，SL7207(pVAXD-S1-789) (2 367 bp，encoding 1-789 amino acid of N-termanal S protein) which harboring PEDVSgenes in varying length plasmid DNA showed：SL7207(pVAX-S499-650)，SL7207(pVAX-S499-789) and SL7207(pVAXD-S1-789) were steadyinvivo/vitro；the target genes could be transcribed in the ileum tissue of mouse；recombinant strains could colonize in liver and spleen of mice and gradually eliminated by host；safety to BALB/c mouse at the dosage of 1×109CFU by oral administration.All of this，demonstrating the attenuatedS.typhimuriumcould be the carrier of PEDVSgene and laying the foundation for evaluating the immunogenicity of recombinant attenuatedSalmonellastrains in piglet.

porcine epidemic diarrhea virus；Sgene；attenuatedSalmonellatyphimurium；oral administration；biological characteristics

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.015

2014-06-07

國家自然科學(xué)基金(31072144；30901084)；國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(20123056)

梁恩濤(1989-)，男，河南平頂山人，碩士生，主要從事豬流行性腹瀉新型口服疫苗的研究，E-mail：pdsliangentao@sina.com；陳 杰(1992-)，男，四川綿竹人，碩士生，主要從事豬流行性腹瀉疫苗的研究，E-mail：chenjie1992@sina.com。二人并列第一作者

*通信作者：黃小波，教授，E-mail：rsghb110@126.com

S858.285.3

A

0366-6964(2015)02-0279-09