邢晉祎，賈坤航，李艷平

(1.臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨沂 276005；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018)

豬STARD3NL基因克隆和表達(dá)譜分析

邢晉祎1*，賈坤航1，李艷平2

(1.臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨沂 276005；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018)

本研究旨在克隆豬STARD3NL(STARD3 N-terminal like protein) 基因，對(duì)其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并研究該基因在豬不同組織中的表達(dá)特性。采用5′和3′-RACE以及RT-PCR方法克隆豬STARD3NL基因，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)，應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)組織表達(dá)特性。結(jié)果表明，豬STARD3NL基因的cDNA序列長(zhǎng)度為1 319 bp(GenBank登錄號(hào)：HQ634946)，編碼235個(gè)氨基酸，該氨基酸序列與其他物種相比一致性較高；進(jìn)化樹(shù)分析表明，豬STARD3NL氨基酸序列與牛和綿羊的關(guān)系較近，與斑馬魚(yú)的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。STARD3NL氨基酸序列包含保守的MENTAL結(jié)構(gòu)域，為疏水蛋白，包含4個(gè)跨膜螺旋區(qū)；二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是α-螺旋，占60%；該蛋白不存在信號(hào)肽，不是分泌蛋白；亞細(xì)胞定位顯示，該蛋白存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的概率為39.1%。qRT-PCR分析表明，STARD3NL基因在所檢測(cè)豬的14種組織均有表達(dá)，在肝中表達(dá)水平最高，在眼肌中的表達(dá)水平最低；萊蕪豬和大長(zhǎng)豬被圓環(huán)病毒感染后，STARD3NL基因在2種豬肺組織中的表達(dá)水平差異不顯著(P>0.05)。研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究STARD3NL基因的結(jié)構(gòu)和功能以及豬抗病育種提供資料。

豬；STARD3NL基因；克??；豬圓環(huán)2型病毒

STARD3NL又稱(chēng)為MENTHO，是一種功能尚不完全明確的整連蛋白。該蛋白的N端包含MENTAL結(jié)構(gòu)域，與STARD3(MLN64)有很高的同源性。與STARD3不同的是，STARD3NL沒(méi)有START結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域是STARD類(lèi)蛋白的特有結(jié)構(gòu)域；與STARD3相同的是，STARD3NL在個(gè)體不同組織中也存在廣泛的表達(dá)，定位在細(xì)胞內(nèi)的晚期核內(nèi)體，可能與那里的STARD3相互作用[1]。有人認(rèn)為STARD3NL與STARD3一起通過(guò)核內(nèi)體途徑調(diào)控膽固醇的胞內(nèi)運(yùn)輸[1-2]。MENTAL結(jié)構(gòu)域含有4個(gè)跨膜螺旋，這種結(jié)構(gòu)域能介導(dǎo)MLN64和STARD3NL同源體和異源體的互作，使該蛋白定位在晚期內(nèi)體膜上[1-2]。

對(duì)STARD3蛋白的功能已有初步了解，但STARD3NL蛋白的功能尚不太清楚。STARD3過(guò)表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)巨型核內(nèi)體的產(chǎn)生，該誘導(dǎo)作用可能由MENTAL結(jié)構(gòu)域行使。STARD3NL的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)巨型核內(nèi)體的積累[3]。編碼GST-MLN64融合蛋白的質(zhì)粒與編碼MENTHO 或 MLN64的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞，STARD3NL 和STARD3與GST-STARD3發(fā)生特異性的免疫共沉淀。這表明STARD3可以在細(xì)胞內(nèi)與STARD3NL形成同源或異源低聚物[2-4]。

目前，豬的STARD3NL基因序列和表達(dá)水平尚未見(jiàn)報(bào)道。萊蕪豬以其抗病強(qiáng)、繁殖率高、耐粗飼、肉質(zhì)細(xì)嫩香醇等特點(diǎn)而著稱(chēng)，為了充分挖掘其優(yōu)良的基因庫(kù)資源，本研究根據(jù)GenBank上登錄的人和小鼠的STARD3NL基因設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，采用RT-PCR技術(shù)，克隆萊蕪豬STARD3NL基因序列，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行生物信息學(xué)分析；采用熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法分析STARD3NL基因mRNA在豬不同組織中的表達(dá)譜和用圓環(huán)病毒(Porcine circovirus type 2，PCV2)攻毒后表達(dá)水平的變化。試驗(yàn)結(jié)果可望為進(jìn)一步研究豬STARD3NL基因的結(jié)構(gòu)和功能，以及利用萊蕪豬抗病性強(qiáng)的特點(diǎn)進(jìn)行抗病育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和樣品采集 選用15頭45日齡PCV2-抗體陰性萊蕪豬和15頭大長(zhǎng)豬(大白豬♂×長(zhǎng)白豬♀)，隨機(jī)分成4組，即萊蕪豬空白對(duì)照組5頭，大長(zhǎng)豬空白對(duì)照組5頭，攻毒萊蕪豬10頭、攻毒大長(zhǎng)豬10頭，分4個(gè)豬圈飼養(yǎng)，觀(guān)察飼養(yǎng)1周后進(jìn)行PCV2人工感染，肌肉注射3 mL毒株：PCV2(SD2株)103.8TCID 50·mL-1，對(duì)照組肌肉注射3 mL生理鹽水。

樣品采集：分別在感染35 d后，選取4頭豬屠宰，攻毒豬和大長(zhǎng)豬對(duì)照組采集肺組織，萊蕪豬對(duì)照組分別采集肝、肺、腎、胃、背膘、脾、脊髓、膀胱、膽囊、大腸、小腸、骨骼肌、眼肌、心組織2 g左右，立即存入液氮保存，然后存放-80 ℃冰箱備用。

1.1.2 主要試劑 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、EcoRⅠ和Hind Ⅲ限制性?xún)?nèi)切酶、T4連接酶、LATaqDNA聚合酶、SYBR?Green I定量PCR試劑盒、RNA酶抑制劑、dNTP Mix、Marker DL2000、pMD18-T vector、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒等，以上試劑均購(gòu)自大連TaKaRa公司；Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；E.coliDH5α購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1組織總RNA的抽提和cDNA第一鏈的合成 采用Trizol法，按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。RNA用滅菌DEPC水充分溶解后，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

cDNA第一鏈的合成：(1)在0.2 mL PCR管中加入： 1.0 μL(約2 μg) RNA、2.0 μL Oligo(dT)18(約0.5 μg)、無(wú)RNase的超純水加到10 μL，輕輕混勻；(2)70 ℃變性5 min，立即置于冰上3 min，使RNA變性；(3)輕輕離心PCR管數(shù)秒，再加入試劑：5 μL M-MLV 5×reaction buffer、5 μL dNTPs(2.5 mmol·L-1)、1 μL RNase 抑制劑、1 μL M-MLV RT(200 U)、3 μL無(wú)RNase的水，混勻，輕輕離心數(shù)秒；(4)42 ℃延伸60 min，85 ℃ 15 min終止反應(yīng)，冰上冷卻2 min，立即進(jìn)行PCR反應(yīng)或保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2STARD3NL基因克隆

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì)和RT-PCR擴(kuò)增：根據(jù)GenBank上人(NM_032016)和小鼠(NM_024270)的STARD3NL基因序列設(shè)計(jì)豬STARD3NL基因簡(jiǎn)并引物Stard-F和Stard-R；根據(jù)測(cè)序得到的序列設(shè)計(jì)4條5′、3′-RACE引物(GS5′ P outer、GS5′P inner、GS3′ P outer、GS3′P inner)和2條熒光定量PCR基因表達(dá)引物(Expr-F、Expr-R)；以豬管家基因GAPDH(GenBank：AF017079)為內(nèi)標(biāo)，設(shè)計(jì)引物GAP-F和GAP-R，由工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 PCR引物序列、退火溫度、擴(kuò)增片段大小及用途

Table 1 Primer sequences，annealing temperature，sizes of PCR product and purpose

引物名稱(chēng)Primername引物序列(5′→3′)Primersequence退火溫度/℃AnnealingtemperaturePCR擴(kuò)增片段大小/bpSizesofPCRproduct用途UsageStard?FStard?RGGAACAACCCGATGAGGATTAAGAATACAGCACGAGACG551063PartialcDNAcloningGS5′PouterGS5′PinnerTGGAATGGACATCACGCAAGGATAAGGATGCATGCGAGCTCTGACT631905′cDNAcloningGS3′PouterGS3′PinnerCACTACTGACATGATTGAACGGCCCTGTGGCTGGTAAGATAATGTC632603′cDNAcloningExpr?FExpr?RCATCTCCTTCATCCTTGCCTATCAGAAAGCCCACCAGGT55142ExpressionGAP?FGAP?RACTCACTCTTCTACCTTTGATGCTTGTTGCTGTAGCCAAATTCA57100Internalcontrol

中間目的片段PCR擴(kuò)增體系：第一鏈cDNA 1.0 μL (約50～100 ng)，10×LA PCR buffer 2.5 μL，dNTP Mix(2.5 mmol·L-1) 2.0 μL，MgCl2(25 mmol·L-1) 2.0 μL，Stard-F(20 μmol·μL-1) 0.5 μL，Stard-R(20 μmol·μL-1) 0.5 μL，LATaqDNA聚合酶0.2 μL(1 U)，ddH2O 加至25 μL，吹打混勻后稍離心片刻。反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min，(94 ℃ 35 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 1.5 min)×35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

5′和3′-RACE片段擴(kuò)增：使用表1中STARD3NL基因特異性引物GS5′ P outer、GS5′P inner、GS3′ P outer和GS3′P inner，按照3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase和5′-Full RACE Kit with TAP(TaKaRa)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行降落PCR擴(kuò)增，最后將第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.2.2 PCR產(chǎn)物的克隆轉(zhuǎn)化與測(cè)序： PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收目的片段，純化產(chǎn)物與pMD18-T vector(寶生物工程公司)于16 ℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞(上海生工)，然后涂布于含有Amp、IPTG和X-gal的平板上培養(yǎng)過(guò)夜，挑取白斑菌落于3 mL LB培養(yǎng)基中(Amp濃度為100 μg·mL-1)，37 ℃搖12 h。提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切鑒定，至少挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆菌液送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。

1.2.3STARD3NL基因的生物信息學(xué)分析 將測(cè)序獲得的序列用DNAMAN軟件預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框(Open read frame，ORF)，推測(cè)氨基酸序列，并比較與其它動(dòng)物STARD3NL的氨基酸序列同源性；在NCBI網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)上分析保守域等；用MEGA 5.1 軟件采用鄰近法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。利用ExPASy(http：//www.expasy.org)等網(wǎng)站相關(guān)程序預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)疏水性、親水性、理化特性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域，跨膜螺旋結(jié)構(gòu)等信息。

1.2.4STARD3NL基因表達(dá)水平分析 分別以引物Expr-F、Expr-R和GAP-F、GAP-R在LightCycler 480熒光定量PCR儀(Roche公司)上進(jìn)行qRT-PCR，以豬管家基因GAPDH為內(nèi)標(biāo)，分析STARD3NL基因mRNA表達(dá)水平。采用SYBR Green I 染料法，參照SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)10 μL、cDNA(稀釋10倍)1 μL、引物各0.4 μL，滅菌超純水加至20 μL。

qRT-PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 30 s；94 ℃ 10 s，55(57) ℃ 10 s，72 ℃ 1 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)后采集熒光生成擴(kuò)增曲線(xiàn)。為了分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的特異性，溫度從65 ℃緩慢升溫到95 ℃，連續(xù)測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度以獲取溶解曲線(xiàn)。試驗(yàn)對(duì)所有樣本進(jìn)行3個(gè)重復(fù)測(cè)定，并在每次試驗(yàn)時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。根據(jù)熒光曲線(xiàn)的Ct值及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以豬GAPDH基因mRNA的表達(dá)量作為內(nèi)參，用2-△△Ct法計(jì)算STARD3NL基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SAS version 8.2 統(tǒng)計(jì)軟件分析STARD3NL基因表達(dá)水平，用單因子方差分析和鄧肯氏多重比較分析平均數(shù)之間的差異顯著性。當(dāng)P<0.05時(shí)，為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1STARD3NL基因cDNA序列和氨基酸序列分析

以萊蕪豬(對(duì)照組)肝cDNA為模板，用Stard-F和Stard-R引物擴(kuò)增出1條特異帶，長(zhǎng)度約為1 100 bp左右(圖1A)，用5′和3′-RACE引物各擴(kuò)增出一條特異帶，長(zhǎng)度分別為250和275 bp左右(圖1B)。用DNAMAN軟件對(duì)序列拼接和分析，結(jié)果表明，所擴(kuò)增的豬STARD3NL基因序列長(zhǎng)度為1 319 bp (GenBank No.：HQ634946)，包括STARD3NL基因開(kāi)放閱讀框(708 bp)、5′UTR(128 bp)和3′UTR(483 bp)序列。該序列與GenBank上登錄的人(BC003074.2)、大鼠(BC086352.1)、小鼠(BC003334.1)、牛(BC120111.1)STARD3NL基因cDNA核苷酸序列有很高的相似性。豬STARD3NAL基因編碼235個(gè)氨基酸，與人、黑猩猩、小鼠、大鼠、牛、綿羊、狗、雞、非洲爪蟾和斑馬魚(yú)STARD3NL氨基酸序列的一致性分別為97.45%、97.45%、94.89%、95.74%、99.57%、99.15%、97.87%、82.63%、68.22%和65.25%。這些結(jié)果表明，STARD3NL蛋白在哺乳動(dòng)物之間具有高度保守性。根據(jù)豬和其他動(dòng)物STARD3NL氨基酸序列，使用MEGA 5.1 軟件采用鄰近法構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，豬與牛和綿羊的STARD3NL分子親緣關(guān)系最近，與斑馬魚(yú)STARD3NL分子親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)(圖2)。

2.2 STARD3NL蛋白保守域分析和理化性質(zhì)預(yù)測(cè)2.2.1 STARD3NL蛋白保守域分析 在NCBI網(wǎng)站上 Blast檢索分析STARD3NL蛋白保守結(jié)構(gòu)域。結(jié)果顯示，萊蕪豬STARD3NL氨基酸序列包含保守的MENTAL結(jié)構(gòu)域，符合蛋白的特點(diǎn)(圖3)。2.2.2 STARD3NL蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 在ExPASy服務(wù)器上使用SOSUI程序進(jìn)行疏水性分析，結(jié)果顯示，萊蕪豬STARD3NL蛋白平均疏水度(Average of hydrophobicity)為0.101 7，該蛋白是疏水蛋白(圖4)。ProtScale程序預(yù)測(cè)到STARD3NL蛋白的理論等電點(diǎn)(pI)為4.64，分子量為26 713.60 u。用TMHMM程序預(yù)測(cè)到STARD3NL蛋白的4個(gè)跨膜螺旋區(qū)(圖5)，4個(gè)跨膜螺旋的位置分別在STARD3NL蛋白序列中的第55～74、94～116、123～142、152～171位氨基酸殘基處。用SOPMA 程序預(yù)測(cè)STARD3NL二級(jí)結(jié)構(gòu)為：α-螺旋占60%，延伸鏈占11.91%，β-轉(zhuǎn)角占4.26%，無(wú)規(guī)卷曲占23.83%。用SignaIP 4.1 Server預(yù)測(cè)信號(hào)肽發(fā)現(xiàn)該蛋白不是分泌蛋白，不存在信號(hào)肽。利用工具PSORTII預(yù)測(cè)STARD3NL蛋白的細(xì)胞器定位，其分布概率：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum)39.1%，質(zhì)膜(Plasma membrane)21.7%，線(xiàn)粒體(Mitochondrial)17.4%，細(xì)胞外(Extracellular)4.3%，囊泡分泌系統(tǒng)(Vesicles of secretory system)4.3%，細(xì)胞核(Nuclear)4.3%，液泡(Vacuolar)4.3%，高爾基體(Golgi)4.3%。

2.3STARD3NL基因mRNA表達(dá)水平分析2.3.1STARD3NL基因在不同組織的表達(dá)譜 以萊蕪豬(對(duì)照組)14種組織的cDNA為模板，分別進(jìn)行STARD3NL和GAPDH基因qRT-PCR分析。結(jié)果表明，STARD3NL基因mRNA在14種組織均有表達(dá)(圖6)。STARD3NL基因mRNA在肝中的表達(dá)水平最高，在眼肌中的表達(dá)水平最低，在肺、腎、胃、背膘、脾、脊髓、膽囊、大腸、小腸組織中呈現(xiàn)中等表達(dá)水平；并且在肝中的表達(dá)水平顯著高于在膀胱、心、骨骼肌和眼肌中的表達(dá)水平(P<0.05)。

M.DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；A.Stard-F和Stard-R引物擴(kuò)增產(chǎn)物(1和2泳道)；B.5′(1泳道)和3′(2泳道)-RACE的第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 M.DL2000 DNA marker；A.Represents products of primer Stard-F and Stard-R(1 and 2 lane)；B .Represents PCR products of second amplification according to 5′(1 lane) and 3′(2 lane) -RACE kit’s instructions圖1 豬STARD3NL基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis patterns of the porcine STARD3NL gene PCR products

0.05代表遺傳距離，每個(gè)節(jié)點(diǎn)的數(shù)字表示1 000次重復(fù)后的靴帶百分比The scale bar is 0.05 representing genetic distance.The number at each node indicates the percentage of bootstrapping after 1 000 replications圖2 鄰近法構(gòu)建的豬STARD3NL氨基酸系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of STARD3NL constructed by neighbor-joining(NJ) method using Mega 5.1

圖3 STARD3NL蛋白包含保守的MENTAL結(jié)構(gòu)域Fig.3 Conserved MENTAL domain of the porcine STARD3NL protein

圖4 豬STARD3NL蛋白的疏水性/親水性預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of hydrophobicity/hydrophilicity of the porcine STARD3NL

圖5 STARD3NL蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Transmembrane prediction of the porcine STARD3NL protein by TMHMM tool

數(shù)據(jù)代表“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”(n=4)。上標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)Data are represented as “means ±SE”(n=4).The lowercase superscripts indicate statistical difference among different tissues(P<0.05)圖6 豬STARD3NL基因mRNA表達(dá)譜Fig.6 The STARD3NL gene mRNA expression patterns in different tissues of porcine

2.3.2 豬圓環(huán)病毒對(duì)STARD3NL基因表達(dá)的影響 分別以對(duì)照組萊蕪豬(LW)、大長(zhǎng)豬(YL)和攻毒組萊蕪豬(VLW)、大長(zhǎng)豬(VYL)肺組織cDNA為模板，進(jìn)行STARD3NL和GAPDH基因qRT-PCR分析。結(jié)果表明，不論是萊蕪豬還是大長(zhǎng)豬被感染圓環(huán)病毒后，STARD3NL基因的表達(dá)水平均高于不感染圓環(huán)病毒的同日齡豬(圖7A、7B)，但差異均不顯著(P>0.05)，說(shuō)明豬在圓環(huán)病毒作用下STARD3NL基因上調(diào)。不同豬種之間比較發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組萊蕪豬肺組織STARD3NL基因的表達(dá)量高于對(duì)照組大長(zhǎng)豬(圖7C)，同樣，感染圓環(huán)病毒后也是萊蕪豬高于大長(zhǎng)豬(圖7D)。盡管如此，差異均沒(méi)達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

數(shù)據(jù)代表“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”(n=4)Data are represented as “means±SE”(n=4)圖7 豬圓環(huán)病毒對(duì)STARD3NL基因mRNA表達(dá)水平的影響Fig.7 The effects of porcine circovirus type 2 on mRNA expression levels of STARD3NL gene

3 討 論

本研究克隆得到了萊蕪豬STARD3NL基因cDNA序列(GenBank登錄號(hào)：HQ634946)，長(zhǎng)度為1 319 bp。此序列包含STARD3NL基因完整開(kāi)放閱讀框、5′UTR 和3′UTR序列。該基因核苷酸序列以及所編碼的氨基酸序列與人、小鼠、大鼠、牛、狗等動(dòng)物核苷酸序列和氨基酸序列具有很高的一致性，并且豬STARD3NL 蛋白序列符合其家族蛋白的典型特征。另外，在萊蕪豬14種組織均檢測(cè)到STARD3NL基因的表達(dá)，與STARD3NL基因在人體內(nèi)組織具有廣泛表達(dá)特性一致[2]。在細(xì)胞水平的研究表明，STARD3NL過(guò)表達(dá)可抑制晚期核內(nèi)小體小管的產(chǎn)生，但不能調(diào)整膽固醇在纖維原細(xì)胞的積累[1，3，5]。研究發(fā)現(xiàn)STARD3NL基因可能與免疫系統(tǒng)有關(guān)[4]，因此，為證明不同豬種被PCV2感染后是否存在STARD3NL基因表達(dá)水平的差異，本研究對(duì)萊蕪豬和大長(zhǎng)豬感染PCV2后肺組織中STARD3NL基因的表達(dá)水平也進(jìn)行了分析，但差異不顯著，推測(cè)STARD3NL基因可能與PCV2無(wú)關(guān)，其原因尚需進(jìn)一步研究?？傊狙芯控S富了豬基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，為進(jìn)一步研究STARD3NL基因的功能和結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。

F.Alpy等研究發(fā)現(xiàn)，STARD3NL蛋白與STARD3蛋白在N端含有共同MENTAL的結(jié)構(gòu)域[1]，并以此給其命名。MENTAL結(jié)構(gòu)域中的4個(gè)跨膜螺旋使它們定位在晚期核內(nèi)體膜上，免疫雙雜交試驗(yàn)也證明了該蛋白在細(xì)胞中的位置[1]。后來(lái)證實(shí)STARD3NL和STARD3可在生理?xiàng)l件下形成同源或異源低聚物[2]，這可能是兩者行駛功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。最近發(fā)現(xiàn)，STARD3或者STARD3NL和VAP(突觸小泡締合性膜蛋白相關(guān)蛋白)在晚期核內(nèi)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間能形成一種新型的分子鏈[5]。

哺乳動(dòng)物START類(lèi)蛋白參與多種生理過(guò)程，如細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)運(yùn)輸，脂質(zhì)的代謝和信號(hào)的調(diào)節(jié)。START類(lèi)蛋白的突變或缺失與遺傳紊亂、自身免疫病和癌癥等病理過(guò)程有聯(lián)系[4]。K.Simons等研究證明，STARD3在膽固醇從低密度脂蛋白(LDL)到晚期核內(nèi)體的運(yùn)輸過(guò)程中起轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能[6]。此外，STARD3還通過(guò)調(diào)控由肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞器的動(dòng)態(tài)變化，來(lái)促使固醇積聚并錨定在膜蛋白上[7]。研究證明StAR及其相關(guān)結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的運(yùn)輸機(jī)制中起重要作用[4，8-12]。由于STARD3在乳腺癌中存在過(guò)表達(dá)[13-16]，所以STARD3的表達(dá)可作為乳腺癌診斷依據(jù)。

目前對(duì)STARD3NL蛋白的確切功能及其作用機(jī)制尚不清楚。有試驗(yàn)表明，STARD3NL的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)巨型的核內(nèi)體的積累，但是這種積累對(duì)動(dòng)物的生理生化以及發(fā)育的影響還不是太清楚[1]。STARD3的START結(jié)構(gòu)域定點(diǎn)突變并未導(dǎo)致固醇代謝的明顯變化[10]，這說(shuō)明START結(jié)構(gòu)域在固醇代謝過(guò)程中并非不可或缺，但從另一角度證明C端缺少START結(jié)構(gòu)域并不影響STARD3NL在固醇代謝過(guò)程中起重要作用。W.F.Li等人認(rèn)為STARD3NL可作為檢測(cè)骨質(zhì)疏松癥的候選基因[17]。盡管如此，豬STARD3NL基因研究剛剛起步，其功能尚需進(jìn)一步研究。

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(編輯 郭云雁)

Molecular Cloning and Expression Patterns Analysis of the Porcine STARD3 N-terminal like Protein(STARD3NL) Gene

XING Jin-yi1*，JIA Kun-hang1，LI Yan-ping2

(1.CollegeofLifeScience，LinyiUniversity，Linyi276005，China；2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China)

The aim of this study was to clone porcineSTARD3NAL(STARD3 N-terminal like protein)，and analyze the structure ofSTARD3NAL，and investigate its expression in porcine different tissues.The porcineSTARD3NALgene was cloned by 5′，3′-RACE and RT-PCR，the protein structure of porcine STARD3NL was analyzed by bioinformatics methods.The expression patterns in different tissues were detected by real-time RT-PCR.The results showed that the porcineSTARD3NLcDNA was 1 319 bp(GenBank accession No.：HQ634946) in length，which coded 235 amino acids and shared highly identity with those of other species.The phylogenetic tree analysis indicated the porcine STARD3NL was closely related to cattle and sheep，but distantly related to the zebrafish.The porcine STARD3NL protein contained conserved MENTAL domain and was hydrophobicity protein and there were 4 transmembrane helices in the STARD3NL protein.The secondary structure of STARD3NL protein showed that the STARD3NL protein fold for 60% into α-helix.This polypeptide contained no signal peptide in its amino acids，and was a nonsecretory protein.The residing probability of STARD3NL in the endoplasmic reticulum was 39.1%.By real-time PCR，mRNA expression of porcineSTARD3NLwere detected in all 14 tissues investigated，andSTARD3NLmRNA expression levels in liver were the highest and inlongissimusdorsiwere the lowest.In addition，no significant difference ofSTARD3NLmRNA expression levels in lung tissues was detected between Laiwu pigs(LW) and YL pigs(Yorshire♂×Landrace♀) in infected circovirus group(P>0.05).These results will provide the data for further research ofSTARD3NLgene structures and function，breeding for disease resistance.

porcine；STARD3NLgene；cloning；porcine circovirus type 2

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.026

2014-09-28

山東省自然科學(xué)基金(ZR2013CL012)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31372333)；臨沂大學(xué)博士啟動(dòng)基金(BS08019)

邢晉祎(1968-)，男，山東曹縣人，博士，副教授，主要從事動(dòng)物分子遺傳學(xué)研究

*通信作者：邢晉祎，E-mail：xingjinyi@lyu.edu.cn

S828；S813.3

A

0366-6964(2015)09-1678-08