孫洪新 ，張英杰 ，劉月琴，陳曉勇，敦偉濤

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071000； 2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，保定 071000)

綿羊CYP19基因卵巢啟動(dòng)子的克隆及其表達(dá)活性研究

孫洪新1，2，張英杰1*，劉月琴1，陳曉勇2，敦偉濤2

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071000； 2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，保定 071000)

本研究旨在克隆綿羊CYP19基因卵巢啟動(dòng)子序列片段，構(gòu)建真核表達(dá)載體，并在細(xì)胞水平檢測(cè)其組織特異性表達(dá)情況。參考已知序列設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增綿羊CYP19基因卵巢啟動(dòng)子1.1和0.5 kb兩個(gè)片段，并與已公布的序列進(jìn)行同源性比較；將測(cè)序正確的兩個(gè)片段分別定向克隆到去除CMV的pEGFP-N2載體骨架中，構(gòu)建真核表達(dá)載體pCYP19-1.1-EGFP-N2和 pCYP19-0.5-EGFP-N2，重組質(zhì)粒在脂質(zhì)體LipofectamineTMLTX+PLUS介導(dǎo)下，分別轉(zhuǎn)染綿羊的顆粒細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)染后24、48 和72 h觀察EGFP表達(dá)情況。結(jié)果表明，擴(kuò)增獲得片段與已公布序列高度同源；應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件對(duì)所得序列分析表明，該擴(kuò)增片段含有類似于TATA-box核心啟動(dòng)順式元件，并含有多個(gè)潛在轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。轉(zhuǎn)染24 h后，發(fā)現(xiàn)pCYP19-1.1-EGFP-N2在顆粒細(xì)胞可觀測(cè)到綠色熒光表達(dá)，48 h熒光細(xì)胞數(shù)量有所增加；轉(zhuǎn)染72 h時(shí)熒光細(xì)胞數(shù)最多；在胎兒成纖維細(xì)胞也有少量EGFP基因表達(dá)。pCYP19-0.5-EGFP-N2在顆粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中均未檢測(cè)到熒光。結(jié)果表明，擴(kuò)增所得的綿羊CYP19基因卵巢啟動(dòng)子1.1 kb片段可引導(dǎo)外源基因在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)，可用于與繁殖相關(guān)的基因功能及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究，但并非卵巢特異性啟動(dòng)子。

綿羊；CYP19；卵巢啟動(dòng)子；表達(dá)

CYP19基因?qū)儆赑450(Aromatase cytochrome P450 gene)超家族基因，是編碼芳香化酶P450 arom的基因。芳香化酶P450arom能夠催化睪酮和雄烯二酮不可逆的轉(zhuǎn)化為雌激素，是雌激素生物合成中的關(guān)鍵酶和限速酶。該過程在魚類、兩棲類、爬行類、鳥類以及哺乳動(dòng)物的性腺分化和性器官發(fā)育中是必不可少的，同時(shí)對(duì)腦的發(fā)育及功能也具有重要影響[1-3]。

CYP19基因有多個(gè)啟動(dòng)子，由它們介導(dǎo)CYP19基因在不同組織中的表達(dá)。不同物種CYP19基因啟動(dòng)子的數(shù)量和結(jié)構(gòu)有所區(qū)別，命名也不相同。人的CYP19基因位于染色體15q21.1區(qū)帶[4]，由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成[5]。迄今，已發(fā)現(xiàn)了人CYP19基因的10個(gè)組織特異性啟動(dòng)子(P1.1、P1.2、P1.3、P1.4、P1.5、P1.6、P1.7、PII、P2a和P1.f)[4-5]，均位于外顯子2 5′端上游約93 kb 長的外顯子1區(qū)域[6-7]。綿、山羊和牛CYP19基因分別位于染色體7q24-q31、10q26和q2.6區(qū)帶，在牛羊也發(fā)現(xiàn)了多個(gè)組織特異性啟動(dòng)子，其中牛上有7個(gè)P1.1、P1.2a、P1.3、P1.4、P1.5、P2、P1.2a/b[8-11]；羊CYP19基因啟動(dòng)子P1.1、P1.4 、P1.5和P2[11]。在鼠類中僅發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)啟動(dòng)子。

CYP19基因的表達(dá)模式是選擇性地利用不同啟動(dòng)子和相應(yīng)的外顯子[12]，CYP19基因在不同物種和特定組織中的表達(dá)是通過選擇性的使用不同啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)的。不同啟動(dòng)子選擇性地把自身外顯子1 5′端非翻譯區(qū)域(5′UTR) 剪接到位于外顯子1翻譯起始位點(diǎn)(ATG) 上游處的剪切位點(diǎn)(AG/GACT)上，調(diào)控 P450arom mRNA水平。但是CYP19 基因編碼區(qū)是恒定的，無論剪切模式如何，不同組織CYP19基因所編碼的芳香化酶蛋白總是相同的[13]。不同啟動(dòng)子的上游基因可以攜帶不同的調(diào)節(jié)基因，結(jié)合于該區(qū)域的核蛋白受組織類型和內(nèi)分泌環(huán)境的影響，物種的差異使基因在表達(dá)的各個(gè)環(huán)節(jié)中可能產(chǎn)生或多或少的差異，特定組織中CYP19基因的表達(dá)產(chǎn)物芳香化酶P450的含量、活性及其最終發(fā)揮的組織特異性功能各有不同。人胎盤中CYP19 基因主要采用 P1.1 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄[14]，其次是PI.2 和 P2a；在卵巢中PⅡ(反芻動(dòng)物稱P2)是主要的啟動(dòng)子；睪丸和前列腺中也主要是PⅡ特異的轉(zhuǎn)錄物，故PⅡ常被稱為生殖腺特異的啟動(dòng)子[15]。人和嚙齒類黃體期主要的啟動(dòng)子是PII[14，16]，而反芻動(dòng)物主要為P1.1[17]。牛羊在妊娠過程中使用不同的啟動(dòng)子引導(dǎo)CYP19基因的表達(dá)，牛胎盤和黃體中主要是P1.1，綿羊胎盤中主要是P1.5；黃體中是P1.1和P1.5。在水牛卵泡發(fā)育成熟和黃體化過程中存在啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)換現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為P2下調(diào)，P1.1上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，該過程中CYP19基因組織特異性表達(dá)的變化和P2的組織特異性甲基化作用以及P1.1組蛋白修飾造成的染色質(zhì)重組相一致[18]。推測(cè)，卵泡發(fā)育形成和黃體化過程中，啟動(dòng)子活性變化和P2的組織特異性甲基化作用以及P1.1組蛋白修飾造成的染色質(zhì)重組有關(guān)。但有關(guān)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)CYP19基因組織特異性表達(dá)的具體轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚。

J.Zhou等[19]研究表明，乳腺癌細(xì)胞能通過促進(jìn) C/EBPb 與 PⅡ調(diào)控區(qū)域相結(jié)合上調(diào)CYP19基因在脂肪成纖維細(xì)胞中表達(dá)，-517～278 bp為 PⅡ基本活性區(qū)域，在-317～304 bp為CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合區(qū)域，與乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，能使-517 bp 啟動(dòng)子活性上調(diào) 5.7 倍，而當(dāng)通過定點(diǎn)突變CCAAT結(jié)合區(qū)域后，這一上調(diào)作用消失。M.Pannetier等[20]克隆了山羊卵巢特異性啟動(dòng)子中不同長度的5個(gè)片段，pAro1(1 104 bp)、pAro2(507 bp)、pAro3(180 bp)、pAro4(110 bp)和pAro5(40 bp)，并構(gòu)建了熒光素酶報(bào)告基因載體(pCYP19-Luc)，進(jìn)行了綿羊顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。于今非等[21]克隆了水牛、黃牛CYP19啟動(dòng)子0.9和1.6 kb各兩個(gè)片段，并構(gòu)建了真核表達(dá)載體在細(xì)胞水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示黃牛、水牛的CYP19啟動(dòng)子(0.9 kb)可啟動(dòng)EGFP在卵巢顆粒細(xì)胞中特異表達(dá)，但效率非常低。而有關(guān)綿羊CYP19基因啟動(dòng)子P2完整序列及其在顆粒細(xì)胞中的特異轉(zhuǎn)錄活性研究未見報(bào)道。本研究旨在參考已知的CYP19基因啟動(dòng)子P2序列，克隆綿羊CYP19 基因卵巢啟動(dòng)子序列的不同區(qū)域片段，利用分子生物學(xué)軟件進(jìn)行功能分析預(yù)測(cè)，并分別構(gòu)建真核表達(dá)載體，在細(xì)胞水平上對(duì)其活性進(jìn)行檢測(cè)和比較，為與繁殖相關(guān)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

pEGFP-N2質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存，pMD-19T(Simple)載體、限制性核酸內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工，基因組提取試劑盒和大腸桿菌DH5a購自全式金公司。小尾寒羊卵巢和胎兒取自唐縣屠宰場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 卵巢采集及DNA提取 小尾寒羊屠宰后立即取出雙側(cè)卵巢組織，放入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。卵巢組織DNA提取按組織DNA試劑盒操作步驟進(jìn)行。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)已公布的綿山羊基因組序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并在引物序列的正反兩端，分別添加AseI和NheI酶切位點(diǎn)，用于綿羊CYP19基因卵巢啟動(dòng)子-683～-1 199 bp和-31～-1 130 bp擴(kuò)增，預(yù)期片段大小為517和1 100 bp兩個(gè)片段，分別記為CYP19 P 0.5和CYP19 P 1.1。引物由上海生物工程公司合成，具體引物序列見表1。

表1 PCR引物

Table 1 Primers of PCR

引物Primer引物序列(5′?3′)Primerssequence產(chǎn)物長度/bpLengthofproductsCYP19P0．5kbATTAATACAATGGGAGGCTCTGAGAATGGCTAGCGAAAAATTAGAAAATCCCCAAA517CYP19P1．1kbATTAATCTGAGCCGCTTTCACTTTGCGCTAGCGAGATTGGCGCTTTGTTTTA1100

1.2.3 綿羊CYP19基因卵巢啟動(dòng)子片段的擴(kuò)增和克隆 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：其中引物1.0 μL；Mix 10 μL；DNA 1.0 μL；ddH2O 13 μL。CYP19 P 0.5 kb擴(kuò)增程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s ，72 ℃ 1.5 min，30 循環(huán)；72 ℃5 min。CYP19 P 1.1擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃1.5 min，35 循環(huán)；72 ℃10 min。

用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)下，割取目的條帶，并用小量膠回收試劑盒回收，與PMD19TM(Simple)載體進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。涂平板37 ℃過夜，挑取白色單菌落，在添加氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)8～12 h，進(jìn)行菌液PCR。對(duì)PCR為陽性的菌液進(jìn)行質(zhì)粒小提，送北京華大生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 克隆片段序列的生物信息學(xué)分析 利用BioEdit 7.0對(duì)克隆獲得的片段序列的峰圖進(jìn)行比對(duì)，用ContingExpress進(jìn)行序列拼接，利用 BLAST比較克隆序列與已知序列的同源性。采用TATA signal prediction(http：//zeus2.itb.cnr.it/webgene/wwhc-tata.html)以及轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)(http：//mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)、MatInspector(www.genomatix.de)、 TRANSFAC(http：//www.gene-regulation.com/pub/programs.html)、CpG島預(yù)測(cè)軟件(http：//www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx和http：//zeus2.itb.cnr.it/cgibin/wwwcpg.pl)軟件對(duì)克隆序列潛在的調(diào)控元件及其CpG島等進(jìn)行分析，對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。

1.2.5 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將測(cè)序正確的含CYP19 1.1 kb和CYP19 0.5 kb片段的質(zhì)粒與pEGFP-N2質(zhì)粒載體分別應(yīng)用AseI和NheI進(jìn)行雙酶切，電泳獲得的片段與去除CMV的pEGFP-N2載體片段應(yīng)用DNA凝膠試劑盒回收。用T4DNA連接酶16 ℃過夜連接回收產(chǎn)物，之后轉(zhuǎn)化DH-5α感受態(tài)大腸桿菌，在卡那霉素抗性平板上挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒，應(yīng)用AseI和NheI進(jìn)行酶切鑒定并測(cè)序。對(duì)酶切和測(cè)序結(jié)果均正確的樣品，用去除內(nèi)毒素的試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒中提，測(cè)定濃度后備用。構(gòu)建的載體分別命名為pCYP19-0.5-EGFP-N2和pCYP19-1.1-EGFP-N2。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.6.1 胎兒成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)和純化：取懷孕50日齡小尾寒羊胎兒，參照文獻(xiàn)[22]方法，進(jìn)行細(xì)胞采集和培養(yǎng)。原代細(xì)胞采用DMEM/F12添加15%胎牛血清進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞長成致密單層后，用0.25%胰酶消化，待大部分細(xì)胞變圓時(shí)，加培養(yǎng)液終止消化，并反復(fù)吹打，只收集脫壁細(xì)胞。成纖維細(xì)胞消化脫壁比上皮細(xì)胞快，待細(xì)胞剛變圓即終止消化，可得到純化的成纖維細(xì)胞。細(xì)胞生長至70%～80%匯合狀態(tài)時(shí)即可冷凍保存，以備基因轉(zhuǎn)染使用。

1.2.6.2 卵巢顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)：從屠宰場(chǎng)采集卵巢迅速放入37 ℃含雙抗的生理鹽水(100 IU·mL-1青霉素和0.1 mg·mL-1鏈霉素)的保溫瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室。將卵巢過75%乙醇，用預(yù)熱好的37 ℃生理鹽水洗滌卵巢3次。用消毒過的眼科剪將卵巢附帶的脂肪和結(jié)締組織剔除干凈，再用預(yù)熱好的37 ℃生理鹽水洗滌卵巢2次。用注射器連12號(hào)針頭吸37 ℃預(yù)熱的DMEM/F12 2 mL左右，吸取直徑為3～6 mm卵泡中的卵泡液，撿出結(jié)構(gòu)致密的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，PBS 清洗干凈后，用0.1%透明質(zhì)酸酶作用，用移液槍輕輕吹打，挑出裸卵，將收集到的卵丘細(xì)胞1 000 r·min-1離心5 min，用適量含10%FBS的DMEM/F12(Hyclone)稀釋，制成顆粒細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105mL-1，接種于25 mL培養(yǎng)瓶(Corning)中，在37 ℃ 5%CO2飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，用于后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

1.2.7 脂質(zhì)體介導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染綿羊細(xì)胞研究 細(xì)胞轉(zhuǎn)染使用 LipofectamineTMLTX + PLUS Reagent試劑盒進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前將G1代的小尾寒羊顆粒細(xì)胞和G3代的小尾寒羊胎兒成纖維細(xì)胞分別接種到6孔板中，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞長到 80%～90% 匯合度時(shí)，將重組質(zhì)粒pCYP19-1.1-EGFP-N2和pCYP19-0.5-EGFP-N2在脂質(zhì)體介導(dǎo)下，分別轉(zhuǎn)染兩種細(xì)胞。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。6孔板中每孔質(zhì)粒DNA 使用量為2.5 μg，脂質(zhì)體用量為12 μL，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在125 μL細(xì)胞培養(yǎng)液中稀釋2.5 μg核酸，加入3 μL PLUS，輕輕混勻后備用，在125 μL細(xì)胞培養(yǎng)液中稀釋12 μL脂質(zhì)體。將上述2種稀釋液輕輕混合后在室溫下孵育5 min形成250 μL復(fù)合體。將復(fù)合體加入6孔板中，輕輕搖動(dòng)混合。在37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)6 h后，更換10% FBS的DMEMF12培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染24 h后，開始利用倒置熒光顯微鏡觀察EGFP表達(dá)情況，待轉(zhuǎn)染72 h后，收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞樣品，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

2 結(jié) 果

2.1 CYP19 卵巢啟動(dòng)子片段的擴(kuò)增

以小尾寒羊卵巢DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1.5%的瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物為約500和1 100 bp的片段(圖1)，條帶單一、清晰明亮，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1、2．PCR產(chǎn)物；M.DL2000 DNA marker1，2 .PCR products；M.DL2000 DNA marker圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR products

2.2 CYP19 卵巢啟動(dòng)子片段克隆及測(cè)序

將電泳得到的兩個(gè)片段分別進(jìn)行切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化，克隆入PMD19TM(Simple)，提取陽性質(zhì)粒，送上海生工測(cè)序。利用ContingExpress、BioEdit和Chromas軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析和拼接，結(jié)果獲得了1 100 bp(1.1 kb)和517 bp(0.5 kb)的序列。經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)克隆得到的兩個(gè)序列與已有序列高度同源。其中1.1 kb序列片段與DQ122857序列的同源性達(dá)98.92%。517 bp片段與已公布的綿羊序列AJ012144.1完全一致，相似度達(dá)到100%，與已知山羊序列的同源性為99.34%。克隆小尾寒羊CYP19卵巢啟動(dòng)子片段(1.1 kb)與部分已知序列的同源性比對(duì)結(jié)果見圖2。

圖2 克隆小尾寒羊CYP19卵巢啟動(dòng)子片段與部分已知序列的同源性比對(duì)Fig.2 The homology of cloning CYP19 ovarian promoter fragment of small-tailed han sheep with some known sequence

2.3 擴(kuò)增序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析

CpGIsland Searcher和CpG Island Prediction工具預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)克隆得到的兩個(gè)片段區(qū)域無符合條件的CpG島。進(jìn)一步應(yīng)用TFSEARCH(http：//mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)、TRANSFAC(http：//www.gene-regulation.com/pub/programs.html)和MatInspector(www.genomatix.de) 軟件對(duì)1 100和517 bp片段序列進(jìn)行分析表明，具有類似于TATA-box、Oct-1等啟動(dòng)子的特征元件和多個(gè)C/EBPbeta、NF5、CRE、FOXL2、GATA-1、SRY、 AP1、MZF1等調(diào)控元件結(jié)合位點(diǎn)。部分轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)見圖3。

圖3 克隆1.1 kb序列及部分潛在轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件Fig.3 Nucleotide sequence of the 1.1 kb and partial transcriptional regulation sequences

2.4 重組載體的構(gòu)建及鑒定

將酶切后的目的片段與去除CMV的pEGFP-N2線性化片段進(jìn)行連接構(gòu)建表達(dá)載體。過夜連接后轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，隨機(jī)挑取10個(gè)克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)陽性克隆菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，用AseI和NheI進(jìn)行酶切和測(cè)序，電泳酶切產(chǎn)物結(jié)果產(chǎn)生1.1 kb與4.1 kb和517 bp片段(圖4)，測(cè)序結(jié)果正確，表明CYP19 P0.5、CYP19 P1.1已成功克隆入去掉CMV的pEGFP-N2質(zhì)粒，pCYP19-0.5-EGFP-N2和 pCYP19-1.1-EGFP-N2載體構(gòu)建成功，重組質(zhì)粒圖譜見圖5。

1、2.雙酶切產(chǎn)物；M.DL5000 DNA marker；3.質(zhì)粒對(duì)照1,2.Double enzyme products；M.DL5000 DNA marker;3.Plasmid control圖4 pCYP19-0.5-EGFP-N2和pCYP19-1.1-EGFP-N2的雙酶切鑒定Fig.4 Identification of pCYP19-0.5-EGFP-N2 and pCYP19-1.1-EGFP-N2

圖5 重組質(zhì)粒圖譜Fig.5 Vector map of recombinant plasmid

2.5 重組質(zhì)粒在綿羊細(xì)胞中的表達(dá)

pCYP19-0.5-EGFP-N2和pCYP19-1.1-EGFP-N2分別經(jīng)脂質(zhì)體LipofectamineTMLTX+PLUS包埋后，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染綿羊卵巢顆粒細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光，表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，報(bào)告基因開始表達(dá)，48 h后細(xì)胞熒光亮度有所增加，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間延長，陽性細(xì)胞數(shù)增多，72 h后最多。在綿羊胎兒成纖維細(xì)胞中也觀察到了類似有少量綠色熒光表達(dá)(圖6和7)，表明克隆CYP19 1.1 kb(-31～-1 130 bp)序列具有生物學(xué)活性。而pCYP19-0.5-EGFP-N2經(jīng)LipofectamineTMLTX+PLUS介導(dǎo)轉(zhuǎn)染小尾寒羊顆粒細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞后，均未觀察到熒光，表明克隆0.5 kb(-683～-1 199 bp)無轉(zhuǎn)錄活性，啟動(dòng)子關(guān)鍵活性部位未包含在該區(qū)域中。

收集轉(zhuǎn)染72 h后的顆粒細(xì)胞，以空白作對(duì)照，用流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。pCYP19-1.1-EGFP-N2轉(zhuǎn)顆粒細(xì)胞的平均轉(zhuǎn)染效率為41.66%，轉(zhuǎn)小尾寒羊胎兒成纖維細(xì)胞的平均轉(zhuǎn)染效率為20.16%。流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果見圖8。

3 討 論

本試驗(yàn)成功克隆了綿羊CYP19基因卵巢啟動(dòng)子的1.1和0.5 kb兩個(gè)片段，對(duì)所得序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了類似于TATA-box的啟動(dòng)子的特征元件和多個(gè)C/EBP、SRY、MZF-1、AP-1、GATA-1等若干對(duì)表達(dá)調(diào)控具有重要作用的序列元件。進(jìn)一步將該序列與pEGFP-N2基因載體融合，替換掉該載體中的CMV啟動(dòng)子序列，成功構(gòu)建了pCYP19-0.5-EGFP-N2和 pCYP19-1.1-EGFP-N2。利用脂質(zhì)體LipofectamineTMLTX+PLUS介導(dǎo)，分別轉(zhuǎn)染綿羊卵巢顆粒細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)經(jīng)pCYP19-1.1-EGFP-N2轉(zhuǎn)染后在卵巢顆粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中均有綠色熒光表達(dá)，而pCYP19-0.5-EGFP-N2在綿羊卵巢顆粒細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞中均未檢測(cè)到熒光，意味著pCYP19- 1.1-EGFP-N2在顆粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中均具有表達(dá)活性，能引導(dǎo)外源基因在其中的特異表達(dá)；而pCYP19-0.5-EGFP-N2不具有表達(dá)活性，調(diào)控綿羊CYP19基因卵巢啟動(dòng)子表達(dá)的核心序列區(qū)域不含在此0.5 kb(-683～-1 199 bp)序列。

研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢特異性啟動(dòng)子的近端含有許多保守調(diào)控元件結(jié)合位點(diǎn)，如調(diào)控cAMP 信號(hào)通路的類cAMP反應(yīng)元件序列((cAMP response element)-like sequence；CLS)[23-24]、孤核轉(zhuǎn)錄因子NR5A1/NR5A2和叉頭框家族FOXL2[25]、AP3(Activation protein 3)和GATA結(jié)合位點(diǎn)等。研究證實(shí)，在卵巢不同種類的細(xì)胞中這些順式作用元件起著不同的作用，對(duì)克隆1.1 kb序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析預(yù)測(cè)表明，1.1 kb也包含有CRE、NR5A1/NR5A2和叉頭框家族FOXL2等調(diào)控元件結(jié)合位點(diǎn)，預(yù)示克隆片段具有卵巢特異性啟動(dòng)子活性。此外， FOXL2在不同物種間的作用不同，在人和小鼠中，表現(xiàn)為抑制PII活性[26-27]，在山羊中則表現(xiàn)為促進(jìn)P2活性[20]。盡管本試驗(yàn)克隆的1.1 kb和山羊P2以及牛PII高度同源，但仍存在一些單堿基變異，這些變異可能會(huì)導(dǎo)致一些未知潛在調(diào)控元件結(jié)合位點(diǎn)的變化，進(jìn)而影響其活性和卵巢表達(dá)的特異性。C.H.Tu等[28]報(bào)道，能夠在卵巢組織中特異表達(dá)的啟動(dòng)子僅有OSP-1、OSP-2。CYP19、抑制素a(Inhibin a)和苗勒管抑制物質(zhì)Il型受體(Mulledan inhibiting substance typeII receptor，MISIIR)等針對(duì)卵巢的特異性啟動(dòng)子除了能調(diào)控基因在卵巢組織高效表達(dá)外，在其它組織也有相當(dāng)水平的啟動(dòng)功能，缺乏高度專一性。pCYP19-1.1-EGFP-N2在顆粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率的不同，顯示克隆所得1.1 kb卵巢啟動(dòng)子在組織特異性上缺乏高度專一性。有研究發(fā)現(xiàn)，人CYP19基因外顯子2的P2 啟動(dòng)子可以啟動(dòng)標(biāo)記基因在性腺組織的特異表達(dá)[29]。本試驗(yàn)克隆得到的綿羊CYP19基因卵巢啟動(dòng)子的1.1 kb雖具有活性，但并非真正卵巢特異性表達(dá)。M.Margaret等[30]克隆了PIIa 43、278和2 700 bp不同長度的啟動(dòng)子片段，并連接人生長激素基因作為表達(dá)基因，制備了轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果顯示，278和 2 700 bp兩種片段的小鼠在腦、腎、肺、肝、皮膚、大腦、卵巢等臟器中均有表達(dá)，P II a43只在卵巢特異表達(dá)，并在雌性小鼠中，該啟動(dòng)子將目的基因定位在顆粒細(xì)胞、黃體以及黃體化間質(zhì)細(xì)胞上。而將轉(zhuǎn)基因小鼠組織表達(dá)分析得知，278 bp片段表達(dá)程度較2 700 bp的片段高，而43 bp片段沒有表達(dá)，說明調(diào)控外顯子PIIa卵巢特異表達(dá)的區(qū)域在43～278 bp。由此推斷，調(diào)控CYP19基因卵巢特異表達(dá)的核心、關(guān)鍵區(qū)域可能集中在1.1 kb序列的某一區(qū)域。

A.轉(zhuǎn)染24 h； B.轉(zhuǎn)染48 h；C.轉(zhuǎn)染72 h。下同A.Transfection for 24 h;B.Transfection for 48 h;C.Transfection for 72 h.The same as Fig.7圖6 pCYP19-0.5-EGFP-N2轉(zhuǎn)染綿羊顆粒細(xì)胞100×Fig.6 The transfection of pCYP19-0.5-EGFP-N2 in sheep granulosa cells 100×

圖7 pCYP19-1.1-EGFP-N2轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細(xì)胞100×Fig.7 The transfection of pCYP19-1.1-EGFP-N2 in sheep fetal fibroblast cells 100×

A.顆粒細(xì)胞；B.成纖維細(xì)胞A.Granulose cells；B.Fetal fibroblast cells圖8 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞72 h流式圖Fig.8 The transfection of CYP191.1 in granulose cells and fetal fibroblast cells for 72 h assayed by flow cytometry

本研究僅克隆了綿羊CYP19基因卵巢啟動(dòng)子的1.1和0.5 kb兩個(gè)片段，對(duì)其調(diào)控元件的分析僅限于推測(cè)，其活性研究僅限于綿羊顆粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的體外嘗試。有關(guān)CYP19基因啟動(dòng)子1.1 kb片段的活性功能驗(yàn)證還有待于在更多種類細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。要確定綿羊CYP19基因卵巢啟動(dòng)子的核心區(qū)域，尤其是在卵巢中特異表達(dá)的區(qū)域，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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(編輯 程金華)

Cloning and Expression Assay of SheepCYPl9 Gene Ovarian Promoter

SUN Hong-xin1，2，ZHANG Ying-jie1*，LIU Yue-qin1，CHEN Xiao-yong2，DUN Wei-tao2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071000，China； 2.HebeiInstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，Baoding071000，China)

The research was conducted to clone the sheepCYP19 gene ovarian promoter fragments and detect the tissue-specific expression in cells level.According to the known sequence the specific prmiers were designed，1.1 and 0.5 kb of sheepCYP19 gene ovarian promoter fragment were amplified by PCR，then the sequences were analyzed by software with published sequences.After eukaryotic expression vector pCYP19-1.1-EGFP-N2and pCYP19-0.5-EGFP-N2were constructed by cloning promoter fragments into the pEGFP-N2vector without CMV，then the recombinant plasmids were transfected into sheep granular cells and fetal fibroblast cells by liposome LipofectamineTMLTX+PLUS.The EGFP fluorescence expression was observed under the microscope after transfection for 24，48 and 72 h.The sequenced results showed that sheepCYP19 gene promoter fragments which were cloned were 1.1 and 0.5 kb length and had highly homologous with the published sequences.The sequence analyzing with transcription factor binding sites prediction software indicated that the promoter fragment contained a core promoter cis-element smilar with TATA box and transcription factor binding sites.24 h after transferring with pCYP19-1.1-EGFP-N2，the EGFP-expressing positive granulosa cells could be observed，48 h after transferring，the EGFP-expressing positive granulosa was increased，72 h after transfection the EGFP-expressing positive granulosa increased to the most.But after transfection the EGFP which was expressed in sheep fetal fibroblast cells was little.The results also showed that no EGFP-expressing positive granulosa cells and fetal fibroblast cells were observed at 24，48 and 72 h after transfection with pCYP19-0.5-EGFP-N2.The sheepCYP19 promoter 1.1 kb can drive foreign gene expressing in sheep granulosa cells and it can be used for the functional studies of fecundity-related genes and transgenic animal research，but it is not ovarian specific expression promoter.

sheep；CYP19；ovarian promoter；expression

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.008

2015-01-26

國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項(xiàng)目(CARS-39)

孫洪新(1978-)，女，山東臨清人，高級(jí)畜牧師，博士生，主要從事羊遺傳繁育研究， E-mail：sdlqshx@126.com

*通信作者：張英杰，教授，博導(dǎo)，主要從事羊遺傳育種及營養(yǎng)研究，E-mail ：zhangyingjie66@126.com

S826.2

A

0366-6964(2015)09-1540-09