蔡林雪 劉澍楠

(1 福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析系,福州,350004; 2 福州總院四七六醫(yī)院,福州,350001)

半枝蓮提取物對(duì)黃曲霉素B1所誘發(fā)肝癌Notch1的影響

蔡林雪1劉澍楠2

(1 福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析系,福州,350004; 2 福州總院四七六醫(yī)院,福州,350001)

目的:探討半枝蓮提取物(ESB)對(duì)黃曲霉素B1所誘發(fā)的肝癌大鼠Notch1的影響。方法:選取60只Wistar大鼠,隨機(jī)分為空白組、模型組、半枝蓮提取物低、高劑量組,每組15只。建立用黃曲霉素B1所誘發(fā)的肝癌大鼠的動(dòng)物模型。其中空白組與模型組給予蒸餾水灌胃,半枝蓮提取物低、高劑量組給予不同濃度的ESB灌胃治療。灌胃1次/d,連續(xù)治療1個(gè)月。治療結(jié)束后將所有大鼠處死,觀察各組大鼠的體質(zhì)量、肝表面的結(jié)節(jié)數(shù),并取肝組織采用免疫組化法檢測(cè)肝組織中Notch1的表達(dá)情況。結(jié)果:與空白組比較,模型組和ESB低、高劑量組大鼠的體質(zhì)量明顯降低(P<0.05),肝表面的結(jié)節(jié)數(shù)明顯增多(P<0.05),Notch1陽性細(xì)胞數(shù)明顯升高(P<0.05);與模型組比較,ESB低、高劑量組大鼠的體重升高(P<0.05),肝表面的結(jié)節(jié)數(shù)及Notch1陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05)。結(jié)論:低、高劑量的半枝蓮提取物能夠有效的抑制肝癌的惡化,其機(jī)制可能與下調(diào)肝組織中Notch1有關(guān)。

半枝蓮提取物;黃曲霉素B1;肝癌;Notch1

半枝蓮(ScutellariaBarbataD.Don),學(xué)名為大花馬齒莧,屬于黃芩亞科植物,其性寒、苦、辛具有活血祛瘀、清熱解毒、消腫止痛等作用。中醫(yī)常用于治療咽喉腫痛、疔瘡、毒蛇咬傷、水腫、黃疸等,現(xiàn)代臨床常廣泛用于癌癥的治療中,但有關(guān)半枝蓮抗腫瘤的機(jī)制尚不明確[1-2]。肝癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一,其每年的新發(fā)率和死亡率均占全球的50%以上,我國(guó)肝癌的死亡率占所有癌癥死亡率的14%,僅次與肺癌,其中農(nóng)村發(fā)病率明顯高于城市,受到廣泛的重視[3]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察半枝蓮提取物對(duì)黃曲霉素B1所誘發(fā)肝癌大鼠肝臟中Notch1的影響,探討半枝蓮抗癌的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器 半枝蓮,廣州市藥材公司;黃曲霉素B1(AFB1),啟東肝癌研究所提供;免疫組化SP試劑盒,Bio-Rad公司;Notch1抗體,美國(guó)Cell Signaling公司;凝膠成像系統(tǒng),Bio-Rad公司

1.2 半枝蓮提取物(ESB)的制備 取新鮮半枝蓮進(jìn)行清洗、烘干、粉碎、經(jīng)過3次2 h水提后,合并水提后的濾液,進(jìn)行濃縮噴霧干燥,其規(guī)格為10:1。

1.3 動(dòng)物與分組 選用Wistar大鼠60只,4周齡,雌雄各半,(150±5.2)g,由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。采用隨機(jī)分組法將60只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、半枝蓮提取物低劑量組(ESB低組)、半枝蓮提取物高劑量組(ESB高組),每組15只。

1.4 肝癌大鼠模型的制備 參照陳志英等[4]建立短期的黃曲霉素B1所誘發(fā)肝癌大鼠模型。采用二甲基砜(DMSO)溶解黃曲霉素B1后,按400 μg/kg溶解液腹腔注射2周,每周6次。注射結(jié)束后,改用含0.015%的2-AFF飼料喂養(yǎng)大鼠2周。

1.5 實(shí)驗(yàn)干預(yù) ESB低組給予ESB 6 g/kg灌胃治療、ESB高組ESB 12 g/kg灌胃治療,1次/d,連續(xù)治療30 d。模型組與正常組給予蒸餾水0.5 mL灌胃,其療程同枝蓮提取物灌胃組。

1.6 免疫組化法檢測(cè)肝癌組織中Notch1的表達(dá) 治療結(jié)束后,將75只大鼠處死后,冰上操作,取肝組織放于4%多聚甲醛固定液中固定24～48 h,常規(guī)石蠟包埋。將包埋好的組織進(jìn)行石蠟切片后為5 μm黏附在載玻片上,放入二甲苯I 15 min,二甲苯II 15 min,100%乙醇I 3 min,100%乙醇II 3 min,95%乙醇3min,80%乙醇3 min,70%乙醇3 min,雙蒸水沖洗1 min,PBS洗3次×3 min進(jìn)行脫蠟和水化處理。用3%H2O2室溫下孵育15 min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS沖洗3次,置于0.01 mol/L的枸櫞酸緩沖液微波爐內(nèi)抗原修復(fù)30 min,加入10%正常山羊血清封閉，37 ℃孵育30 min。加入一抗稀釋液稀釋后的兔抗大鼠的Notch1抗體,4 ℃孵育過夜。PBS沖洗3次×5 min,加入生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG(二抗),室溫靜置30 min。PBS洗3次×5 min,滴加三抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素),37 ℃溫箱孵育30 min。DAB顯色5～10 min,鏡下掌握染色程度,自來水沖洗10 min。蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水、透明、封片,顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠的體質(zhì)量的比較 模型組與ESB低組、ESB高組大鼠的體質(zhì)量明顯低于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);ESB低組、ESB高組大鼠的體質(zhì)量明顯高于模型組大鼠的體質(zhì)量,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

2.2 各組大鼠肝表面的結(jié)節(jié)數(shù)的比較 模型組與ESB低組、ESB高組大鼠的肝表面的結(jié)節(jié)數(shù)明顯高于空白組大鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);ESB低組、ESB高組大鼠肝表面的結(jié)節(jié)數(shù)明顯低于模型組大鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

2.3 各組大鼠肝組織中Notch1蛋白表達(dá)情況 Notch1蛋白陽性表達(dá)為棕褐色顆粒,位于細(xì)胞膜或是胞質(zhì)內(nèi)。模型組與ESB低組、ESB高組大鼠的Notch1陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯高于空白組大鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);ESB低組、ESB高組大鼠Notch1陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯低于模型組大鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1、表1。

表1 各組大鼠的體質(zhì)量、肝表面的結(jié)節(jié)數(shù)、 Notch1蛋白的比較

注:與空白組比較,*P<0.05,與模型組比較，▲P<0.05。

注:A.空白組;B.模型組;C.ESB低組;D.ESB高組。

圖1 各組大鼠肝組織中Notch1蛋白表達(dá)的比較(×400)

3 討論

黃曲霉素為二氫呋喃香豆素的衍生物,主要為黃曲霉寄生曲霉產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)20多種,其中以黃曲霉素B1最為常見,且毒性最強(qiáng)。其毒性可以導(dǎo)致肝肝細(xì)胞脂肪變性及出血性壞死等,黃曲霉素B1其致癌力極強(qiáng)是目前已經(jīng)的最強(qiáng)致癌物之一[5]。

半枝蓮是一種類似薄荷的唇型科植物,其提取物可以破壞為癌組織供應(yīng)血液的血管,是一種常用的抗癌藥物,其抗癌效果較好,且對(duì)正常細(xì)胞無損壞。研究表明半枝蓮提取物能夠H22肝癌荷瘤有明顯的抑制作用,且能夠減輕毒性反應(yīng),延長(zhǎng)生存時(shí)間,改善荷瘤小鼠的免疫功能[2,6]。ESB能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖,阻滯細(xì)胞周期,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Notch1是Notch信號(hào)家族中的一個(gè)受體,其參與腫瘤的發(fā)生、增殖、分化和轉(zhuǎn)移的過程。Notch信號(hào)通路,廣泛存在于各種動(dòng)物中,能夠動(dòng)態(tài)的影響細(xì)胞發(fā)育的多個(gè)過程,其信號(hào)的紊亂與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。正常肝組織中均能檢測(cè)出Notch信號(hào)通路的四個(gè)受體Notch1、Notch2、Notch3、Notch4的表達(dá),其表達(dá)的強(qiáng)度不一,肝癌組織中Notch1的表達(dá)量會(huì)明顯的升高,且Notch1的表達(dá)與腫瘤的大小、局部的侵潤(rùn)、腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)[7-8]。目前有關(guān)Notch1信號(hào)通路調(diào)控肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖的機(jī)制尚不明確。Notch的靶基因包括Hes和Hey兩大基因家族,Hes1在感覺系統(tǒng)、內(nèi)分泌細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育中起到關(guān)鍵的作用,其對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響可能與調(diào)控下游Hes1和Hes2的表達(dá)水平,引起細(xì)胞周期的停滯,從而影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為[9]。Notch信號(hào)通路具有雙向的調(diào)控作用,既可以促進(jìn)癌癥細(xì)胞的生長(zhǎng),亦可抑制癌癥細(xì)胞的生長(zhǎng),其在不同的腫瘤發(fā)展的不同階段其調(diào)控的機(jī)制可能不同,從而使得有時(shí)抑制,有時(shí)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。這種雙向調(diào)控主要與細(xì)胞周圍所處的維環(huán)境的不同和Notch受體的數(shù)量和種類有關(guān)[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,模型組和ESB低、高劑量組大鼠的體質(zhì)量較空白組明顯降低,肝表面的癌結(jié)節(jié)數(shù)較空白組明顯升高,確定黃曲霉素B1誘導(dǎo)大鼠癌變成功。經(jīng)過ESB灌胃之后,ESB低、高劑量組的體質(zhì)量、癌結(jié)節(jié)數(shù)均明顯改善,且Notch1較模型組明顯降低,表明ESB在一定程度上能夠緩解黃曲霉素B1誘導(dǎo)大鼠肝癌的程度,其作用的機(jī)制可能與下調(diào)Notch1表達(dá)有關(guān)。

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(2014-04-06收稿 責(zé)任編輯：王明)

Effects of Banzhilian Extract on Notch1 of Aflatoxin B1-induced Hepatic Carcinoma

Cai Linxue1,Liu Shunan2

(1DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,CollegeofPharmacy,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350004; 2thePeople'sLiberationArmy476Hospital,FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryRegion,Fuzhou,350001)

Objective: To investigate the Banzhilian extract's effects on Notch1 of rats with aflatoxin B1-induced hepatic carcinoma.Methods: Sixty Wistar rats were randomly divided into 4 groups: normal control group,hepatocarcinoma model group,extract's high dose group and low dose group.Hepatic carcinoma model were induced by aflatoxin B1.The control group and the model group were given distilled water lavagely,the extract's groups were given different concentrations of extracts lavagely,qd.for a month.All rats were killed in the 4th week,measure weight,counted number of nodules on the surface of liver.Immunohistochemistry were used to detect the expression of Notch1.Results: Compared with the control group,the rats' weight in other groups dropped significantly (P<0.05),while the nodule number and Notch1 levels increased significantly (P<0.05); Compared with the model group,the rats' weight in the extract's of high dose group and low dose group were increased (P<0.05),while the nodule number and Notch1 levels were reduced considerably(P<0.05).Conclusion: Banzhilian extract could inhibit aggravation of liver carcinoma,which is probably related to the down-regulating of liver Notch1.

Banzhilian; Aflatoxin B1;Hepatic carcinoma; Notch1

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào):2012J01131)

R284.2;R273

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.01.022