郭家鵬，朱利峰

（1.河南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南　鄭州　450008；2.河南省畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心）

瘋牛病檢測技術(shù)最新研究進(jìn)展

郭家鵬1，朱利峰2

（1.河南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南鄭州450008；2.河南省畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心）

瘋牛?。˙SE）的流行給許多國家的畜牧業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并不斷威脅人類健康。對于瘋牛病的防制，有效的檢測技術(shù)起十分重要的作用。對近年瘋牛病檢測技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行總結(jié)和展望。

瘋牛??；朊病毒；畜牧業(yè)；檢測技術(shù)

傳染性海綿狀腦?。═SE）是一類引起人和動物神經(jīng)組織退化的疾病，包括人的庫魯病、克-雅氏病、吉-斯綜合征、阿爾茨海默病以及動物的瘋牛病、羊瘙癢病等。其中瘋牛病發(fā)現(xiàn)的最早，動物采食含有朊病毒的肉骨粉可能引起該病的發(fā)生［1］。該病對養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展和人類健康構(gòu)成巨大威脅，并有“東擴(kuò)”蔓延的趨勢，已成為國際獸醫(yī)學(xué)界和醫(yī)學(xué)界共同關(guān)注的熱點問題。

1　瘋牛病流行狀況及其檢測技術(shù)研究的重要性

1.1瘋牛病的病原

瘋牛病的學(xué)名為牛海綿狀腦?。˙SE），病原為朊病毒，是一種無核酸的蛋白性侵染顆粒，屬慢性進(jìn)行性致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前認(rèn)為BSE的病原為癢病相關(guān)纖維（SAF），這種纖維源自非常規(guī)變異蛋白（PrPsc），它的存在是BSE的一大特征。發(fā)生變異的蛋白引發(fā)人和動物的腦組織形成海綿狀空洞，腦神經(jīng)會漸漸變得像疏松的海綿體，腦功能出現(xiàn)退化，行動失去控制，四處盲目沖撞直至死亡。這就是瘋牛病及其與人類相關(guān)的克-雅氏癥等疾病的病因?？茖W(xué)家經(jīng)過多年的研究還發(fā)現(xiàn)，老年癡呆癥的病變蛋白與其有驚人的相似，它們在化學(xué)致病機制上有許多類似性。

1.2瘋牛病的流行狀況

1986年，英國首先發(fā)現(xiàn)并報道該病，1987年正式命名為牛的海綿狀腦病，并且在世界上公開報道。1986年，英國首先發(fā)現(xiàn)并報道了14個病例，以后發(fā)病趨勢加快，至1993年達(dá)到了高峰，病牛達(dá)到了3.7萬多頭。到1999年7月，英國確認(rèn)的病例有17萬多頭。最新統(tǒng)計全球共有瘋病牛20多萬頭，其中英國占180 376頭，歐洲是重災(zāi)區(qū)［2］。除英國大規(guī)模的暴發(fā)外，美國、法國、德國、日本、荷蘭、葡萄牙、西班牙、意大利、愛爾蘭、瑞士、比利時、盧森堡、丹麥等20多個國家和地區(qū)發(fā)生了瘋牛?。?］。但是這些國家基本上是散發(fā)性的，只有英國是大規(guī)模流行。瘋牛病近年出現(xiàn)了東擴(kuò)的趨勢，日本已證實了瘋牛病的發(fā)生，并且流行趨勢相當(dāng)嚴(yán)峻，不斷有新病例發(fā)生的報道［4］。

1.3瘋牛病檢測研究的重要意義

瘋牛病潛伏期比較長，一般為4至5年，而且機體不能對其產(chǎn)生免疫反應(yīng)，對人類和動物都有極大的威脅性。強調(diào)瘋牛病的嚴(yán)重性，不僅是因為瘋牛病傳染給人后會使人患上克-雅氏癥，更因為人類目前對瘋牛病還沒有有效的防治和治療措施，所以檢測和診斷就顯得尤為重要。

2　目前瘋牛病檢測技術(shù)的研究水平

目前，世界各國對瘋牛病的檢測尚無經(jīng)濟(jì)實用、簡便高效的方法。對瘋牛病的檢測步驟一般為：先根據(jù)臨床特征和流行病學(xué)資料做出初步診斷，再根據(jù)病理組織學(xué)變化、免疫學(xué)以及分子生物學(xué)檢測等方法確診。隨著生物學(xué)及生物學(xué)相關(guān)邊緣科學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了許多新的檢測方法。

2.1病理組織檢測方法

可疑BSE病例被屠宰后，首要的診斷方法是病理組織學(xué)檢查，當(dāng)發(fā)現(xiàn)BSE特征性病變即海綿狀空洞即可確診。BSE病牛具體病理組織學(xué)變化是：腦兩側(cè)灰質(zhì)神經(jīng)叢對稱性海綿樣病變和腦干神經(jīng)核神經(jīng)元空泡化，以腦組織中淀粉樣核心周圍有由海綿樣變性形成的“花瓣”組成的雛菊花樣病理斑為特征。

2.2生物鑒定方法

通過被檢標(biāo)本勻漿（腦、脊髓、脾等）接種小鼠或倉鼠，接種動物3 d檢查1次，瀕死撲殺取腦組織做病理學(xué)檢查。最后根據(jù)動物發(fā)病和死亡數(shù)計算終點滴度。倉鼠觀察期為7～8個月，小鼠為12～36個月，而且代價高昂，臨床不常采用［1，5］。

2.3免疫學(xué)檢測方法

BSE診斷的實際應(yīng)用需要更加快速并且可同時檢測大量樣本的方法，目前有多種免疫診斷技術(shù)可區(qū)分正常和異常的朊病毒蛋白，其中有些能精確確定朊病毒蛋白含量水平。

2.3.1免疫細(xì)胞化學(xué)法（ICC）

ICC試驗利用抗原直接在組織切片上檢查PrPsc。試驗從每個腦組織上分別取延髓、腦橋、中腦、丘腦、大腦皮質(zhì)、小腦組織做成切片，在切片上滴加第一抗體（如鼠抗PrP單克隆抗體FH11），第二抗體為標(biāo)記有生物素的馬血清。若病理組織切片中有PrPsc，就會與第一抗體結(jié)合，隨后與第二抗體結(jié)合。再加入ABC（Avidin+ Biotin-peroxidase complex）試劑，后者可結(jié)合到第二抗體上。之后再加入底物（H2O2），即可出現(xiàn)反應(yīng)。最后用蘇木素復(fù)染，PrPsc呈紅褐色。陽性對照切片是羊癢病腦組織切片，從而鑒定樣品中有無瘋牛病病原［6］。

2.3.2免疫組織化學(xué)法

免疫組化是利用標(biāo)記的特異性抗體來顯示組織切片上的PrPsc。其基本步驟是：將甲醛固定或石蠟包埋的組織標(biāo)本經(jīng)一系列預(yù)處理后，依次與特異性抗體和酶標(biāo)記二抗反應(yīng)，最后加底物顯色，顯微鏡下觀察。用該方法檢測靈敏度、特異性都很高，且具有高度的解剖學(xué)分辨率，已成為傳染性海綿狀腦病的標(biāo)準(zhǔn)檢測法［7-8］。有關(guān)專家利用該方法對英國和意大利的瘋牛病的檢測進(jìn)行比較得到了相同的檢測結(jié)果，進(jìn)一步說明了該方法的可靠性。法國食品公共衛(wèi)生部研究出的石蠟包埋斑點法（PET-blot）也可以用來檢測受感染的腦組織。

2.3.3免疫印跡法

瑞士Prionics公司是瘋牛病和羊癢病等朊病毒疾病早期診斷的全球領(lǐng)先企業(yè)。Pronics公司開發(fā)的免疫印跡法采用Westernblot法檢測朊病毒蛋白，需要6 h就能出檢測結(jié)果，這種方法現(xiàn)在被瑞士政府和英國授權(quán)用于牛的瘋牛病管理，并可用于對潛伏期動物進(jìn)行檢測。目前，歐洲委員會建議，在歐盟監(jiān)管項目的瘋牛病檢測中采用新型Prionics（R-Check LIA）法，LIA專門設(shè)計用來進(jìn)行BSE檢測，具有很高的精確性和可靠性。歐委會瘋牛病專家的評估顯示出百分之百的敏感性和特異性［9］。

2.3.4ELISA法

愛爾蘭Enfer Scientific公司的ELISA法采用了新的抽取技術(shù)，利用化學(xué)熒光和多細(xì)胞抗-PrP抗體進(jìn)行檢測，約24 h出結(jié)果。這種檢測方法已被愛爾蘭政府應(yīng)用于感染BSE的牛監(jiān)測。法國和英國的Bio-Rad公司開發(fā)的Platelia試驗和TeSeE試驗采用夾心免疫法，約4 h出結(jié)果，該方法使用兩個單克隆抗體，第一個抗體在固相中被免疫，而第二個抗體用共價酶做標(biāo)記，PrP通過測量這種酶的活性來檢測。該方法尤其適用于有大量樣本的情況，與傳統(tǒng)接種動物的方法平行對比，檢測感染BSE牛腦組織稀釋樣本，準(zhǔn)確性好，并有可能用于檢測處于潛伏期的標(biāo)本。日本東京Fujirebio公司研發(fā)的一步法ELISA試驗將牛腦組織制備成勻漿懸液后，先用DNAse I和膠原酶（Collagense）處理，再用蛋白酶消化。之后，依次經(jīng)過蛋白沉淀，耐受蛋白酶蛋白水解折疊，水浴超聲懸浮，將懸浮物加到包被有特異單克隆抗體的微孔板，再加入HRP標(biāo)記的檢測抗體，TMB顯色等試驗步驟后，用酶標(biāo)儀讀取結(jié)果，顯示出了很高的檢測準(zhǔn)確性。

2.3.5構(gòu)象依賴性免疫測定法

美國加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）的研究人員開發(fā)出的構(gòu)象依賴性免疫測定方法（CDI），比現(xiàn)在應(yīng)用的普通免疫測定方法能檢測出更微量的prion蛋白，而且5 h即可出結(jié)果。該方法將可用于檢測活動物而且準(zhǔn)確性相當(dāng)高，對西班牙、德國和英國的11 000頭屠宰牛檢測結(jié)果完全與現(xiàn)在應(yīng)用的方法相符，而且在實驗室和臨床試驗中，還沒有發(fā)現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果。另外，該方法的另一突出優(yōu)點是自動化，因此可以用于大量動物的篩選［10］。

2.3.6免疫熒光法

EGG Wallac的基于免疫熒光方法的Delfia試劑，敏感性比較高，該方法檢測是使用兩個單克隆靶PrP的非競爭性檢測方法，英國的農(nóng)漁食品部（MAFF）已同意將其用于檢測英國的牲畜。德國學(xué)者研制出利用熒光相關(guān)光譜檢測瘋牛病的方法，可以不用蛋白激酶K進(jìn)行消化，這對于潛伏期動物的診斷有很大的優(yōu)勢。

2.3.7高效色譜免疫分析法

高效色譜免疫分析法于2004年被歐盟委員會接受用于瘋牛病的檢測，巴薩羅那大學(xué)研究的Prionics-Check PrioSTRIP是一種針對瘋牛病開發(fā)的高效色譜免疫分析法，也有很高的可靠性。

2.3.8雞卵黃抗體檢測

日本廣島大學(xué)、國家動物健康研究所和廣島科技研究所的研究人員重組了一種可以檢測瘋牛病的雞卵黃抗體（IgY），這種抗體的可變區(qū)包括Ab3-15和Ab4-19兩個抗哺乳動物朊病毒蛋白的區(qū)域，從而能敏感的識別PrPsc蛋白準(zhǔn)確檢測瘋牛病。

2.4分子生物學(xué)檢測方法

2.4.1Westernblotting檢測法

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)國家動物海綿狀腦病實驗室的王輝暖、趙德明等于2007年以朊蛋白單抗AH6和堿性磷酸酶標(biāo)記的馬抗鼠酶標(biāo)二抗建立了瘋牛病和羊癢病的Western blotting檢測方法。其敏感性為100%，特異性為99.4%，與進(jìn)口試劑盒無顯著差異，這為國產(chǎn)試劑盒研制提供了條件［11］。國家瘋牛病參考實驗室利用小鼠骨髓瘤細(xì)胞和經(jīng)過重組魯西黃牛PrP或重組小尾寒羊PrP免疫的脾細(xì)胞建立了5個雜交瘤細(xì)胞系。經(jīng)過Western blot反應(yīng)，其中有4組可以識別牛和羊的re-PrP、PrPc和PrPsc，兩組只能識別羊的re-PrP和PrPsc，對牛和羊的PrPc都不能識別，利用此方法可以進(jìn)行瘋牛病的監(jiān)測。荷蘭動物疾病中心利用咽喉淋巴結(jié)進(jìn)行Western blotting檢測，不但能檢測瘋牛病而且可以區(qū)分瘋牛病和羊癢病。

2.4.2瘋牛病特殊風(fēng)險物質(zhì)熒光RT-PCR檢測法

北京出入境檢驗檢疫局的史喜菊等人建立了檢測牛肉中瘋牛病特殊風(fēng)險物質(zhì)（主要是中樞神經(jīng)組織）標(biāo)記物膠原纖維酸性蛋白（GFAP）mRNA的熒光RT-PCR檢測技術(shù)。能從牛源和羊源的中樞神經(jīng)組織中檢測到GFAP［12］。

2.4.3利用紅細(xì)胞分化相關(guān)因子（EDRF）檢測法

英國的中洛錫安群羅斯林研究所的Gino Miele等人利用cDNA的差異顯示分析，來鑒定在朊蛋白疾病中具有異常表達(dá)的EDRF轉(zhuǎn)錄物。朊病毒侵入大腦前首先在脾臟復(fù)制，由此他們推測朊病毒可能會影響基因表達(dá)，于是他們分析了來自正常小鼠脾臟和BSE感染小鼠脾臟的RNA轉(zhuǎn)錄物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在感染小鼠的脾臟中，EDRF的轉(zhuǎn)錄水平下降，不僅如此，受感染小鼠的血液和骨髓也存在EDRF的減少，在羊癢病患羊和BSE患牛的骨髓中，EDRF的水平同樣低于正常。由此判斷不論EDRF是否參與致病，它可能會成為很好的診斷標(biāo)記物。

2.4.4利用標(biāo)記核糖核酸檢測法

2004年德國吉森獸醫(yī)與食品研究所米夏埃爾·比爾特教授等開發(fā)出利用核糖核酸（RNA）作為標(biāo)記物的檢測方法。動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含有膠質(zhì)纖維酸性蛋白，而合成這種蛋白質(zhì)的過程中會產(chǎn)生信使RNA，通過實時聚合酶鏈反應(yīng)，就能找到信使RNA的痕跡，進(jìn)而判斷肉類食品中是否摻入了含有瘋牛病病毒粒子的腦或脊髓組織［13］。

2.5其他檢測方法

2001年，美國和英國合作研制出通過檢測尿液診斷瘋牛病的方法。可檢測到病牛尿液中的瘋牛病因子，而且特異性很好［14］。俄羅斯科學(xué)家用人工方法合成了瘋牛病的普里昂蛋白質(zhì)，并培育出有彩色標(biāo)記、能攻擊正常的普里昂蛋白質(zhì)的抗體。檢測前先向腦組織中注入一種酶，這種酶只能與正常的普里昂融合在一起。由于人工抗體帶有彩色標(biāo)記，故顯微鏡下所有普里昂蛋白質(zhì)周圍都會出現(xiàn)彩色亮點。通過觀察這些蛋白質(zhì)是否與特殊酶發(fā)生融合，便可以分辨出是否有變異普里昂蛋白質(zhì)（未與特殊酶融合的）存在，從而可以斷定被測的牛是否患上BSE［15］。

2003年，英國根據(jù)瘋牛病感染牛出現(xiàn)異常的腦電圖的現(xiàn)象，將其作為瘋牛病的生前診斷，英國腦電圖診斷法作為法定的診斷方法［16］。同年，英國四家機構(gòu)的神經(jīng)學(xué)家和輻射學(xué)家稱，利用磁共振影像，以高功率將焦點集中于大腦的中央部位的尾丘腦。瘋牛癥典型特征的腦細(xì)胞喪失的形狀，就會在影像的黑斑中顯示出來，因此，也可利用此法進(jìn)行瘋牛病的診斷［17］。

2004年，美國北達(dá)科他州立大學(xué)（NDSU）科研人員研究出使用無線射頻識別技術(shù)（RFID）來檢測瘋牛病的方法［18］。

2005年，日本九州大學(xué)研究出對異常普里昂蛋白質(zhì)有特殊捕捉能力的有機分子和電化學(xué)顯色劑相結(jié)合的電極裝置檢測法，該方法不但精確度高，節(jié)約檢測時間，而且可以用于20個月以下小牛的檢測［19］。

2007年，德國科學(xué)計算跨學(xué)科中心和Heidelberg大學(xué)研究利用紅外光譜特征檢測活牛血清來診斷牛是否染上瘋牛病。同年，多位科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)成朊蛋白基因（PRNP）的多態(tài)性和瘋牛病的發(fā)生有很強的關(guān)聯(lián)性，通過該項檢測也可以間接確定瘋牛病的發(fā)生。

3　瘋牛病檢測技術(shù)研究發(fā)展方向

瘋牛病活體檢測是當(dāng)前和今后一段時間內(nèi)瘋牛病研究的難點和重點。目前已取得了一些進(jìn)展：除了前面所提到的尿液診斷法、腦電圖診斷法、磁共振影像法、無線射頻識別法、紅外光譜特征檢測活牛血清法、血纖維蛋白溶酶原早期檢測法。其他的方法還有：荷蘭研究的活體動物采血檢測法；英國曼徹斯特大學(xué)利用心電圖來監(jiān)測在感染BSE的早期階段的心率變異信號，從而來檢測瘋牛病以及診斷人類變異克雅氏病；德國哥廷根大學(xué)開發(fā)出一種在活牛身上檢測瘋牛病的血液檢測法［20］。

我國目前沒有發(fā)現(xiàn)瘋牛病，但從其發(fā)病機理和我們與國外在畜牧業(yè)方面的貿(mào)易往來史看，仍然不能放松警惕。在歐洲真正認(rèn)識瘋牛病之前，我們從英國等歐洲國家引進(jìn)種羊和種牛的同時就有可能埋下了隱患。國內(nèi)基層對瘋牛病認(rèn)識不足，缺乏有效、快速的檢測手段，瘋牛病可能隨著經(jīng)濟(jì)交往和人員交流而形成全球化。所以目前當(dāng)務(wù)之急就是找到一種特異性高、簡便、非創(chuàng)傷性和有早期診斷意義的檢測方法。鑒于目前對瘋牛病檢測試驗需要的迫切性，相信這些問題很快會得到解決。

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2015-08-21）