(大連醫(yī)科大學(xué) 遼寧省高校蛋白質(zhì)組學(xué)重點實驗室，遼寧 大連116044)

邵淑娟

近年來，腫瘤已成為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病。早期就診的腫瘤患者5年生存率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于晚期就診患者，因此，早期診斷、早期治療已逐漸成為腫瘤防治研究的重中之重。深入認(rèn)識腫瘤的發(fā)病原因和機(jī)制，發(fā)現(xiàn)用于早期診斷的腫瘤標(biāo)志物是實現(xiàn)腫瘤早期診治的關(guān)鍵，也是目前腫瘤基礎(chǔ)研究和臨床研究的熱點。其中，以大規(guī)模高通量的蛋白質(zhì)分析技術(shù)為研究手段，深入挖掘腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，為腫瘤蛋白質(zhì)標(biāo)志物的篩選、臨床藥靶的鑒定以及探討腫瘤的分子機(jī)制提供了新思路和新途徑。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究策略

1994年，澳大利亞學(xué)者Wilkins 和Williams 等人首次提出了蛋白質(zhì)組(proteome)的概念，其研究目的是系統(tǒng)分析生物體內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能以及相互作用的動態(tài)變化。隨著技術(shù)的發(fā)展，研究的不斷深入，蛋白質(zhì)組學(xué)的概念和研究內(nèi)容在不斷發(fā)展深化。目前蛋白質(zhì)組學(xué)分離鑒定中最常用的是“Top-Down”和“Bottom-up”技術(shù)。

1.1 基于膠的蛋白分離和鑒定技術(shù)

二維凝集電泳(two dimensional electrophoresis，2D-PAGE)技術(shù)是“Top -Down”技術(shù)的經(jīng)典方法，其原理是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點和分子量的不同而實現(xiàn)樣品在聚丙烯酰胺膠上的分離。該技術(shù)具有高通量、高靈敏度、高分辨率等優(yōu)點，可同時提供蛋白質(zhì)等電點、相對分子量等信息，但對極酸或極堿的蛋白質(zhì)、高疏水性蛋白質(zhì)(如膜蛋白質(zhì))、低豐度蛋白質(zhì)以及極大和極小分子量蛋白質(zhì)的檢測仍存在困難。

熒光雙向差異凝膠電泳技術(shù)(fluorescence twodimensional differential gel electrophoresis，DIGE)改進(jìn)了二維凝膠電泳技術(shù)存在的重復(fù)性和精確性差的問題。該方法將待比較的蛋白質(zhì)樣品用不同的熒光染料(Cy2、Cy3、Cy5)標(biāo)記，并將所有樣品等比例混合作為內(nèi)標(biāo)［1-4］。與傳統(tǒng)的二維凝膠電泳技術(shù)相比，該方法減少了工作量，增強(qiáng)了定量的可靠性，提高了蛋白質(zhì)定量的重復(fù)性和準(zhǔn)確度。本研究小組利用該技術(shù)比較了肺癌和癌旁正常組織的蛋白表達(dá)差異，成功分離了75 個差異表達(dá)蛋白點，鑒定了413個差異蛋白，其中在肺癌組織中上調(diào)的蛋白質(zhì)有204 個，下調(diào)的蛋白質(zhì)有209 個［5］。隨后，研究小組對這些鑒定的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行了功能及其作用機(jī)制探討，如環(huán)指蛋白19［6］、甘油醛三磷酸脫氫酶［7］、膜聯(lián)蛋白A5［8］、果糖二磷酸醛縮酶A(ALDOA)［9］等。

1.2 基于色譜的分離和鑒定技術(shù)

由John Yates 等人引入蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的多維液相色譜(multidimensional liquid chromatography，MudPIT)極大的提高了蛋白質(zhì)的鑒定能力。該技術(shù)主要是基于“Bottom -up”技術(shù)，即將蛋白質(zhì)用特定的蛋白酶消化為肽段后，利用肽段在強(qiáng)陽離子交換柱(SCX)和反向柱(RP)上的保留能力的不同進(jìn)行二維液相色譜分離，分離的肽段再利用在線的串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。該方法由于質(zhì)譜鑒定效率高、自動化程度好而逐漸成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主流方法。在腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，最常見的就是研究疾病與對照組之間的差異表達(dá)蛋白質(zhì)?；诜€(wěn)定同位素標(biāo)記的定量技術(shù)可實現(xiàn)多個樣品之間的精確定量比較［10］，目前比較成熟的技術(shù)有化學(xué)標(biāo)記(ICAT、二甲基化標(biāo)記［11］)、代謝標(biāo)記(SILAC)［12］及等重同位素標(biāo)簽標(biāo)記定量法(iTRAQ)［13］等。ICAT 技術(shù)主要共價標(biāo)記半胱氨酸，因此無法定量不含半胱氨酸的蛋白和肽段［14］。二甲基化標(biāo)記法利用醛和氰硼氫化鈉及各自的同位素形式標(biāo)記肽段所有活性氨基。該方法具有反應(yīng)條件溫和、快速高效、無明顯副反應(yīng)、價格低廉等優(yōu)點［15］。有研究者利用原位二甲基標(biāo)記技術(shù)成功實現(xiàn)了肝癌患者和健康人血清中內(nèi)源性磷酸肽的相對定量分析［16］。代謝標(biāo)記是在細(xì)胞或生物體成長過程加入含有穩(wěn)定同位素標(biāo)記的培養(yǎng)基，完成細(xì)胞或生物體標(biāo)記的方法［17］。該方法易于實現(xiàn)、定量準(zhǔn)確度高，但實驗成本較高且難以用于人的組織樣品及體液的分析。有研究利用含15N 標(biāo)記的蛋白質(zhì)喂養(yǎng)小鼠，使整個老鼠實現(xiàn)同位素標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)了多種長壽命蛋白質(zhì)［18］。iTRAQ 技術(shù)標(biāo)記蛋白質(zhì)的N 端和賴氨酸側(cè)鏈，基本可以標(biāo)記所有蛋白質(zhì)［19］。目前商品化iTRAQ 試劑盒最多可以實現(xiàn)8個樣品的定量分析，但其價格相對比較昂貴，且標(biāo)記時容易受蛋白緩沖體系和雜蛋白的影響。Lv 等［20］利用iTRAQ 技術(shù)比較了結(jié)腸癌患者和健康人組織，發(fā)現(xiàn)了68 個差異蛋白質(zhì)，其中多個差異蛋白質(zhì)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

2 基于蛋白質(zhì)組學(xué)的腫瘤標(biāo)記物篩選生物樣本

生物標(biāo)志物(biomarker)是指“一種可客觀檢測和評價的特性，可作為正常生物學(xué)過程、病理過程或治療干預(yù)藥理學(xué)反應(yīng)的指示因子”。在腫瘤學(xué)領(lǐng)域，尋找早期檢測、診斷分型、治療監(jiān)測和預(yù)后的生物標(biāo)志物一直是近年來的研究熱點。目前常用的生物樣本有以下幾種。

2.1 血液(含血清、血漿)

血液由于便于實驗取材和臨床應(yīng)用、易于利用ELISA 等手段實現(xiàn)檢測的優(yōu)點，一直是腫瘤標(biāo)記物篩選的理想生物樣本。但血液的成分復(fù)雜、蛋白質(zhì)豐度動態(tài)范圍大、低豐度的與腫瘤密切相關(guān)的分泌蛋白質(zhì)易被高豐度蛋白掩蓋。如血清白蛋白占血清總蛋白的50%以上，高豐度蛋白質(zhì)與低豐度蛋白質(zhì)的濃度比高達(dá)1000 倍以上。因此，常采用離心超濾、親和層析等方法去除高豐度蛋白質(zhì)，或采用離子交換、金屬螯合樹脂、疏水相互作用色譜柱等對目的蛋白進(jìn)行富集和濃縮。Yang 等［21］利用iTRAQ 標(biāo)記技術(shù)，依次采用基于“Top -Down”的凝膠電泳-質(zhì)譜鑒定技術(shù)和基于“Bottom-up”的二維液相色譜-質(zhì)譜鑒定技術(shù)分析了口腔鱗狀細(xì)胞癌患者和健康人的血清蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)第一種方法可以定量281 個蛋白質(zhì)，第二種方法可以定量319 個蛋白質(zhì)，而且兩種方法所定量的結(jié)果之間具有很大的重疊，說明蛋白質(zhì)組學(xué)策略是發(fā)現(xiàn)血清中腫瘤生物標(biāo)記物可靠而有力的工具。

2.2 組 織

腫瘤組織也是腫瘤標(biāo)記物篩選的常用生物樣本之一，其所含蛋白質(zhì)直接與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，且蛋白含量高于血液、個體差異較小，但存在取材困難、易混有其他組織等困擾。手術(shù)取得的標(biāo)本應(yīng)盡量減少其在室溫的時間，最好在30 min 內(nèi)放入液氮凍存，以避免組織內(nèi)蛋白質(zhì)的降解。激光捕獲顯微切割(laser capture microdissection，LCM)可直接在顯微鏡下從組織切片上精確地切割特定的細(xì)胞或細(xì)胞群，解決了組織中特定類細(xì)胞獲取的問題，降低了背景干擾，極大地推進(jìn)了腫瘤蛋白質(zhì)組的研究。Zhu等［22］以CD24 為標(biāo)記試劑，利用LCM 技術(shù)從40 nL胰腺癌組織及癌旁正常組織中分別提取了胰腺癌干細(xì)胞和非干細(xì)胞，并利用基于色譜的蛋白質(zhì)組定量技術(shù)比較了胰腺癌干細(xì)胞和非干細(xì)胞的差異蛋白譜，發(fā)現(xiàn)375 個蛋白的表達(dá)差異2 倍以上。這些差異蛋白主要在腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲、增殖等方面起重要作用，可能是潛在的腫瘤早期篩查的生物標(biāo)記物或治療的新靶點。

2.3 體 液

在生理或病理狀態(tài)下，體液(如淋巴液、腦脊液、尿液、支氣管液、胸腹水等體液)中的蛋白質(zhì)會發(fā)生量或質(zhì)的動態(tài)變化，如老年癡呆患者會在腦脊液中產(chǎn)生β-淀粉樣蛋白。體液的成分相對簡單、目的蛋白含量高、取材相對容易，可以說是一種較好的生物標(biāo)記物研究材料。Davalieva 等［23］利用DIGE-質(zhì)譜技術(shù)對前列腺癌和良性前列腺增生患者的尿液進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)比較分析，發(fā)現(xiàn)23 個蛋白質(zhì)的差異在1.8 倍以上，進(jìn)一步豐富了用于前列腺癌早期篩查的生物標(biāo)記物數(shù)據(jù)庫。

2.4 細(xì)胞或動物等模式生物

模式生物包括各種腫瘤細(xì)胞系或動物模型，如線蟲、果蠅、非洲爪蟾、蠑螈、小鼠等。模式生物由于具有易于在實驗室內(nèi)飼養(yǎng)和繁殖、實驗操作簡單、取材方便等優(yōu)點而越來越受到廣泛的關(guān)注。大連醫(yī)科大學(xué)自主研制了在615 小鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率分別＞70%和＜30%的高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(Hca -F)和低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(Hca-P)模型。這兩株細(xì)胞具有高度同源性但轉(zhuǎn)移能力顯著不同，是研究腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移過程及機(jī)制的理想模型。Liu 和Sun 等［24-25］利用DIGE 和一維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對Hca -F 和Hca-P 細(xì)胞系進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)109 種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中多種為首次報道與肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移直接相關(guān)［26-27］。

3 腫瘤分子機(jī)制的研究

蛋白質(zhì)組學(xué)方法應(yīng)用于腫瘤標(biāo)記物的篩選，可以得到大量的差異蛋白信息，這些差異蛋白可能是與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的潛在標(biāo)志物。進(jìn)一步利用蛋白免疫印跡或免疫組織化學(xué)等方法對這些潛在標(biāo)記物進(jìn)行生物學(xué)驗證，即可明確其應(yīng)用于臨床腫瘤診斷和預(yù)后判斷的特異性和靈敏度，判斷其臨床意義。然而，如需進(jìn)一步應(yīng)用于臨床的腫瘤治療，則需進(jìn)行腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究，即需深入開展功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。

本實驗室前期基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出差異蛋白——ALDOA［9］，隨后在肺癌組織和細(xì)胞水平進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)其在肺鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)，與質(zhì)譜結(jié)果一致。并且發(fā)現(xiàn)ALDOA 在肺鱗癌組織中的表達(dá)水平與患者的生存時間密切相關(guān)，與肺鱗癌的轉(zhuǎn)移、原發(fā)腫瘤大小狀態(tài)和病理分期相關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤部位和分化程度無關(guān)，說明ALDOA 可能是肺癌的潛在標(biāo)記物。此外，本實驗室利用基因干擾技術(shù)體外抑制了人肺鱗癌細(xì)胞中ALDOA 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ALDOA 基因在NCI-H520 細(xì)胞株中具有促進(jìn)腫瘤增殖、遷移和侵襲能力的作用，ALDOA 可能通過參與細(xì)胞周期主要控制點G1/S 期和G2/M 期的調(diào)控，以及參與調(diào)控EMT 相關(guān)的分子機(jī)制等發(fā)揮作用。Xu 等［28］利用基于SILAC 的定量蛋白質(zhì)學(xué)，研究了紫杉醇對HeLa 細(xì)胞的作用機(jī)制。他們發(fā)現(xiàn)紫杉醇作用前后，HeLa 細(xì)胞中347 個蛋白發(fā)生顯著變化，這些差異蛋白參與眾多生物學(xué)過程，如紡錘體組裝、有絲分裂以及細(xì)胞粘附等。其中，細(xì)胞周期調(diào)控蛋白PDCD4 在紫杉醇刺激后的腫瘤細(xì)胞中顯著下調(diào)，其可在多個腫瘤細(xì)胞系中調(diào)控對紫杉醇的敏感性，而且紫杉醇治療后的肺癌患者組織中PDCD4的表達(dá)水平與患者的生存時間呈正相關(guān)。

Puig 等［29］發(fā)展了串聯(lián)親和純化(tandem affinity purificaiton，TAP)技術(shù)，特別適用于在生理條件下研究蛋白的相互作用。該技術(shù)在不破壞目標(biāo)靶蛋白結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，在靶蛋白一端插入一個蛋白質(zhì)標(biāo)簽(TAP)，再經(jīng)兩步親和純化即可得到蛋白質(zhì)復(fù)合體，隨后利用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。該技術(shù)因與傳統(tǒng)技術(shù)相比具有周期短、假陽性少、無需預(yù)先知道復(fù)合體的組成或功能等優(yōu)點而被廣泛使用。

Selbach 等［30］進(jìn)一步將免疫共沉淀、RNA 干擾(RNAi)、代謝標(biāo)記(SILAC)、質(zhì)譜定量等技術(shù)相結(jié)合，形成了QUICK 技術(shù)，進(jìn)一步提高了鑒定到的相互作用蛋白質(zhì)的特異性。Yang 等［31］利用免疫共沉淀結(jié)合穩(wěn)定同位素標(biāo)記-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)研究了細(xì)胞周期依賴激酶(CD9)復(fù)合物的生物功能。他們發(fā)現(xiàn)在RNA 激發(fā)前后分別有245 和162 個蛋白與CD9密切相互作用。RNA 激發(fā)前與CD9 相互作用蛋白主要具有RNA 解旋、核糖核酸外切、RNA 依賴的ATP 酶等功能;RNA 激發(fā)后與CD9 相互作用蛋白主要具有DNA 解旋、核糖體綁定、轉(zhuǎn)錄延長、未折疊蛋白綁定等生物學(xué)功能，證明CDK9 是一種動態(tài)的多功能酶復(fù)合物，不僅可調(diào)控轉(zhuǎn)錄延伸，而且還具有RNA 剪切和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等功能。

4 展 望

生命科學(xué)已經(jīng)進(jìn)入了后基因時代，隨著蛋白質(zhì)組技術(shù)，尤其是定量蛋白質(zhì)組的通量、準(zhǔn)確性和靈敏度的不斷提高，基因組、蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)以及相關(guān)生物信息學(xué)將會得到不斷完善和豐富，可以預(yù)見基于蛋白質(zhì)組學(xué)的腫瘤標(biāo)記物篩選會得到更多的潛在腫瘤標(biāo)志物信息，基于蛋白質(zhì)學(xué)的腫瘤機(jī)制研究也會更加深入。但如何從浩瀚的數(shù)據(jù)中篩選出具有高特異性，并且可真正用于臨床檢測和治療的腫瘤標(biāo)記物，則仍需蛋白質(zhì)組學(xué)、基礎(chǔ)腫瘤學(xué)、臨床腫瘤學(xué)等領(lǐng)域的研究人員的密切合作。

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