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（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)部，廣東廣州 510006）

大腸埃希菌sdi A基因缺失株的建立*

伍彬?qū)?，蔡壬?，曾建明，鄂順梅，李有強，葉大檸，魯 洋，陳 茶△

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)部，廣東廣州 510006）

目的為研究HSL信號分子對大腸埃希氏菌的影響而建立大腸埃希菌sdi A基因缺失株。方法通過Red重組系統(tǒng)敲除大腸桿菌BW25113和SM10λpir的sdiA基因，PCR測序鑒定；不同時間點檢測A600值，繪制細菌生長曲線；熒光定量PCR檢測csg D、csg B基因水平。結(jié)果PCR測序結(jié)果經(jīng)DNAman軟件比對分析，與預(yù)想結(jié)果一致；與野生株相比，sdiA基因突變對細菌生長曲線無明顯影響。結(jié)論成功建立BW25113、SM10λpir的sdi A基因缺失株，為后續(xù)研究銅綠假單胞菌信號分子HSL對大腸埃希菌的影響奠定了基礎(chǔ)。

大腸埃希菌； 基因敲除； Red重組系統(tǒng)； sdi A基因； HSL信號分子； 接合反應(yīng)

銅綠假單胞菌（PA）是臨床常見的條件致病菌，近年來，PA耐藥問題日益嚴(yán)重。目前認為基因水平轉(zhuǎn)移是介導(dǎo)細菌耐藥的重要途徑，其方式有：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合。接合介導(dǎo)的耐藥基因水平轉(zhuǎn)移是PA多重耐藥的重要原因，但PA接合的調(diào)控機制尚不清楚。有研究證明Ti質(zhì)粒在根癌土壤桿菌結(jié)合轉(zhuǎn)移過程中受到一種由細菌釋放，稱為接合因子的信號分子的調(diào)控。接合因子實質(zhì)上是一種酰基高絲氨酸內(nèi)酯（HSL）分子，能提高Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的頻率［1-2］。目前，有研究證實PA等革蘭陰性菌廣泛存在“群體感應(yīng)”系統(tǒng)。在“群體感應(yīng)”系統(tǒng)中，HSL分子作為自誘導(dǎo)劑來監(jiān)測群體密度［3］。當(dāng)細菌達到一定數(shù)量后，HSL濃度升高到一定閥值，啟動一系列基因的表達，調(diào)節(jié)細菌的群體行為，如：PA胞外酶的產(chǎn)生、發(fā)光菌的生物發(fā)光性、Ti質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移、細菌抗生素的合成、毒性因子的表達、生物膜的形成等。課題組前期在國家自然科學(xué)基金資助下研究PA信號分子HSL對大腸埃希菌（E.coli）-PA接合反應(yīng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSL有促進接合反應(yīng)，并引起接合相關(guān)基因tra I、traG和trbC表達增高的作用。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子sdi A是供體菌E.coli中唯一的HSL受體蛋白，為明確sdi A在接合中的作用，本文通過基因同源重組技術(shù)突變供體菌E.coli SM10λpir的sdiA基因，為后續(xù)研究HSL信號分子對E.coli-PA接合體系的影響打下基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 材料 BW25113菌株和基因敲除所用質(zhì)粒［4］：p KD3、p KD46、pCP20由Barry L.Wanner教授惠贈，見表1。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 sdiA基因突變所用引物D-sdiA_F/R引物序列參考文獻［5］進行設(shè)計，另外按NCBI數(shù)據(jù)庫中E.coli基因組序列（登錄編號：NC_000913.2）設(shè)計測序引物C-sdi A_F/ R，見表2。

1.2.2 基因敲除 本試驗通過Red重組技術(shù)敲除E.coli SM10λpir的sdiA基因［4］。以p KD3質(zhì)粒為模板，引物D-sdi A _F/R擴增重組同源DNA，純化后電轉(zhuǎn)化SM10λpir（p KD46）感受態(tài)，篩選氯霉素抗性克隆，42℃培養(yǎng)消除p KD46質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化pCP20質(zhì)粒，再次42℃培養(yǎng)消除氯霉素抗性及pCP20質(zhì)粒，獲得候選菌株用于后續(xù)試驗鑒定。

1.2.3 測序鑒定 以引物C-sdiA_F/R擴增候選菌株，PCR產(chǎn)物通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳成像，同時送測序，測序結(jié)果用DNAman軟件比對分析。

1.2.4 熒光定量PCR（qPCR） 挑取單個SM10λpir野生株及sdiA突變株菌落至3 m L LB培養(yǎng)液中，37℃、200 r/min搖菌過夜，按1∶100比例稀釋到新鮮LB培養(yǎng)基中，30℃、200 r/ min搖菌8 h，離心收集菌液提取RNA后通過SYBR Green染料法定量檢測csg D和csg B基因表達，rpoD為內(nèi)參基因，引物序列見表2。

1.2.5 生長曲線和細菌染色 從-80℃取E.coli SM10λpir sdi A基因突變株與野生株，接種血平板，挑取單克隆至3 m L LB液體培養(yǎng)基中37℃，200 r/min增菌12 h，取各菌液調(diào)0.5 MCF，再各取20μL至3 m L LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/ min，于0、2、4、6、8、10、12 h時，在721分光光度計測定菌液A600值，繪制生長曲線。同時進行常規(guī)制片，革蘭染色，光學(xué)顯微鏡觀察細菌形態(tài)并成像。

2 結(jié) 果

2.1 sdi A基因敲除的鑒定 因PCR鑒定引物在sdi A基因突變處上下游約200 bp處，突變后染色體上殘留一個FRT序列，所以PCR產(chǎn)物應(yīng)為622 bp，而野生株則為1 169 bp。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果與預(yù)期一致，見圖1。測序峰形圖顯示測序質(zhì)量良好，結(jié)果比對正確，見圖2（見《國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”）。

2.2 細菌生長曲線 細菌生長曲線顯示，E.coli SM10λpir sdi A基因突變株與野生株無明顯差異；此外，細菌培養(yǎng)4 h和12 h時的革蘭染色結(jié)果顯示SM10λpir sdi A基因突變株與野生株無明顯差異，提示sdiA突變對細菌表型無明顯影響。見圖3、4（見《國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”）。

2.3 qPCR檢測生物膜相關(guān)基因的變化［6］qPCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)E.coli SM10λpir sdiA基因突變株csg D和csg B基因表達量明顯高于野生株，提示csg D和csg B合成受sdi A蛋白影響，見圖5。

3 討 論

本課題組前期試驗發(fā)現(xiàn)受體菌PAO1的HSL合成基因缺失將降低E.coli-PA接合反應(yīng)頻率，因轉(zhuǎn)錄因子sdi A是供體菌E.coli中唯一的HSL受體蛋白，為明確sdi A在接合中的作用，本研究對供體菌E.coli SM10λpir sdi A基因進行了靶向缺失突變。

Red同源重組是一種利用同源重組方法改變生物體某一內(nèi)源基因的遺傳學(xué)技術(shù)。它將靶基因突變位點左右各35～50 bp DNA片段連接到耐藥基因（本實驗為氯霉素CmR）兩側(cè)，導(dǎo)入細菌后，在p KD46質(zhì)粒攜帶的λ噬菌體Red重組酶作用下，與染色體上靶基因發(fā)生同源重組，從而實現(xiàn)在基因水平上對目的基因的敲除、替換和突變等操作［4］。本研究以Red同源重組技術(shù)敲除sdi A基因，證實該技術(shù)是一種高效準(zhǔn)確的基因突變技術(shù)。

首先，本研究通過PCR測序檢測結(jié)果證實sdi A基因突變成功。其次，在細菌表型方面，sdi A基因高表達能夠抑制生物膜成分curli形成。因剛果紅能結(jié)合curli和纖維素，是檢測curli形成的非特異性試驗［6］；所以課題組嘗試進行剛果紅試驗驗證。然而結(jié)果發(fā)現(xiàn)SM10λpir和BW25113 sdi A基因突變株的剛果紅試驗結(jié)果與野生株間無明顯差別（未在本文結(jié)果中描述），不能用于sdiA突變株表型鑒別。因此，本研究在基因水平上檢測了curli形成相關(guān)基因csg D和csg B的表達。結(jié)果提示csg D、csg B基因在SM10λpir sdiA缺失株高表達，與文獻報道一致，側(cè)面說明試驗菌株建立成功。

文獻報道，E.coli細胞分裂需要ftsQ、fts A和ftsZ產(chǎn)物的參與，而轉(zhuǎn)錄因子sdiA能識別ftsQAZ基因簇啟動子［7］，促進基因轉(zhuǎn)錄，并導(dǎo)致細菌分裂加速，形態(tài)上多為短桿狀［8-9］。本實驗通過細菌生長曲線和對延緩期、對數(shù)期（4、12 h）的細菌進行革蘭染色，發(fā)現(xiàn)37℃下sdiA基因的缺失對E.coli SM10λpir菌株的生長曲線和形態(tài)無明顯影響，與文獻報道的在sdi A基因高表達的條件下，sdi A蛋白促進細菌分裂現(xiàn)象并不矛盾。

綜上所述，本文成功建立E.coli sdi A基因缺失株，為后續(xù)研究PA信號分子HSL對大腸埃希菌的影響奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of The sdiA Gene Mutant in Escherichia coli Strains*

Wu Binning，Cai Renxin#，Zeng Jianming，E Shunmei，Li Youqiang，Ye Daning，Lu Yang，Chen Cha△

（Department of Laboratory Medicine，the Second Clinical Medical College of Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou，Guangdong 510006，China）

ObjectiveTo build sdiA gene muants of Escherichia coli BW25113 and SM10λpir strains.MethodsThe sdiA gene of Escherichia coli BW25113 and SM10λpir were knocked out with Red recombination system.The mutants were detected by PCR technique，and the following sequencing results were analyzed through alignment by software DNAman.Growth curve of strains were assayed by detecting the A600 value at different time point.The csg D and csg B genes expression levels were detected by fluorescent quantitative PCR in SM10λpir sdi A mutant thereafter.ResultsPCR products electrophoresis showed a shorten fragment in mutants comparing to their parental strains BW25113 and SM10λpir，and it was confirmed by DNA sequencing.The growth curves and cells morphology in Gram stain were similar in both mutants and wild-type strains.The expression of csg D and csg B genes was higher in SM10λpir sdiA mutants than those in wild-type strain.ConclusionThe mutants of sdiA deletion of Escherichia coli BW25113 and SM10λpir were constructed successfully，and it will be the foundation for further research of the effects of the signal molecular HSL on Escherichia coli.

Escherichia coli； gene knockout； Red recombination system； sdi A gene； HSL signal molecular； conjugation reaction

10.3969/j.issn.1673-4130.2015.17.005

A

1673-4130（2015）17-2466-03

2015-04-28）

國家自然科學(xué)基金資助項目（81071397、81271909）；廣東省自然科學(xué)基金資助項目（S2013010012970）。 作者簡介：伍彬?qū)?，男，碩士研究生在讀，主要從事臨床微生物學(xué)與檢驗的研究；蔡王辛，男，檢驗技師，主要從事臨床微生物與檢驗的研究。#共同第一作者。

△通訊作者，Email：chencha906@163.com。