張海霞 盧永昌 王庶

摘要：建立測(cè)定雪蓮（Saussurea involucrata）中綠原酸、蘆丁和木犀草素含量的方法，采用HPLC法，色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈-0.8%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，柱溫30 ℃。綠原酸、蘆丁、木犀草素的線性范圍分別為0.081～0.408 μg/mL、0.090～0.449 μg/mL、0.045～0.224 μg/mL;平均加樣回收率分別為99.78%、99.89%、100.70%，其中綠原酸、蘆丁在天山雪蓮中含量最高，木犀草素在苞葉雪蓮中含量最高。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法（HPLC）;雪蓮（Saussurea involucrata）;綠原酸;蘆丁;木犀草素

中圖分類號(hào)：R284.2;S567 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）02-0434-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.045

Determing Chlorogenic Acid， Rutin and Luteolin in Saussurea Involucrate of Three Varieties with HPLC

ZHANG Hai-xia1，LU Yong-chang2，WANG Shu1

（1.College of Life Science and Chemistry，Qinghai University for Nationalities， Xining 810007， China;

2.Key Laboratory of Chemical， Qinghai-Tibet Plateau Plants Resources，Xining 810007， China）

Abstract： To establish a method for determining chlorogenic acid， rutin and luteolin in Saussurea involucrate， the Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm， 5μm） column was used. The mobile phase was consisted of acetonitrile and 0.8% aqueous phosphoric acid with gradient elution.The flow rate was 1. 0 ml·min-1 and the detective wavelength was 360 nm. The column temperature was 30℃. The peak areas and concentrations of chlorogenic acid， rutin and luteolin had good correlation in the ranges of 0.081～0.408μg/mL，0.090～0.449μg/mL and 0. 0448～ 0.224μg/mL， with the average recovery rates of 99.78%，99.89% and 100.70%， respectively. The contents of chlorogenic acid and rutin were the highest in Saussurea involucrata（Kar. et Kir.） Sch.-Bip. Saussurea obov-allata （DC.） Edgew had the maximum content of luteolin.

Key words：HPLC; Saussurea involucrata （Kar. et Kir.） Sch.-Bip.; chlorogenic acid; rutin; luteolin

雪蓮（Saussurea involucrata）又名雪荷花，為菊科（Asteraceae）鳳毛菊屬（Saussurea）植物，珍稀名貴中藥材，常見(jiàn)的有苞葉雪蓮、水母雪蓮、天山雪蓮、唐古特雪蓮等，主要分布在2 400 m以上的高原寒帶地區(qū)的青海、新疆、甘肅、四川、西藏等地。雪蓮性溫、微苦，祛風(fēng)除濕，通筋活血，暖宮散瘀效果顯著。此外，對(duì)風(fēng)濕性疾病具有特殊效果，還具有抗炎鎮(zhèn)痛、止血消腫之功效，使用安全，無(wú)明顯的不良反應(yīng)[1-3]。藥理研究顯示蘆丁、木犀草素和綠原酸為雪蓮中的主要抗腫瘤抗癌有效成分[4-6]。對(duì)于蘆丁、木犀草素和綠原酸在雪蓮中的含量同時(shí)分析測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道。為有效控制雪蓮藥材質(zhì)量，本試驗(yàn)采用微波提取法對(duì)雪蓮中蘆丁、木犀草素和綠原酸進(jìn)行提取，采用高效液相色譜法對(duì)蘆丁、木犀草素和綠原酸的含量進(jìn)行了測(cè)定，并比較了不同種雪蓮藥材3種物質(zhì)的含量差異。該方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為雪蓮藥材的進(jìn)一步研究和綜合開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料與儀器

雪蓮系2012年8月采自青海、新疆（經(jīng)高原生物研究所胡鳳祖副研究員鑒定）。

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括G1311A四元輸液泵，G1316A柱溫箱，G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1315A二級(jí)管陣列（DAD）檢測(cè)器，Agilent1200色譜工作站。

1.2 ?試驗(yàn)試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100080-200707）、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110753-200212）和木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111520-200504）;乙腈，甲醇為色譜純，磷酸為分析純;水為超純水。

1.3 ?色譜條件

色譜柱采用Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）; 流動(dòng)相乙腈（A）-0.8% 磷酸水溶液（B） ，梯度洗脫（0～8 min，10%～15% A;8～12 min，15%～30%A;12～35 min，30%～32% A）;檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm;流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣10 μL，柱溫30 ℃。

1.4 ?溶液的配制

1.4.1 ?標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 ?分別精密稱取綠原酸 10.20 mg、蘆丁 11.23 mg、木犀草素5.60 mg，置于 50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度分別為204.0、224.6、112.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

1.4.2 ?供試品溶液的制備 ?精密稱取雪蓮藥材粉末1.30 g，置具塞錐形瓶中，精密加入純甲醇40 mL，超聲波處理2 h，冷卻，再稱定重量，用純甲醇補(bǔ)足減失重量，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾即得。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，按“1.3”的色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。結(jié)果表明在此色譜條件下，綠原酸、蘆丁、木犀草素分離良好，分離度均大于1.5，且理論塔板數(shù)均不低于4 000，結(jié)果見(jiàn)圖1至圖4。

2.2 ?線性關(guān)系考察

精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，配成系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取10 μL進(jìn)樣后記錄峰面積，以質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到綠原酸、蘆丁、木犀草素的回歸方程。

綠原酸：Y=12 316X+99.5（r=0.999 9）

蘆?。篩=11 276X+246.5（r=0.999 7）

木犀草素：Y=22 277X+20.8（r=0.999 5）

結(jié)果表明，綠原酸、蘆丁、木犀草素分別在0.081～0.408、0.090～0.449、0.045～0.224 μg/mL與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3 ?穩(wěn)定性試驗(yàn)

用自動(dòng)進(jìn)樣器依次對(duì)同一供試品溶液進(jìn)樣，在1、 2、3 d后分別進(jìn)樣10 μL，以峰面積計(jì)算。結(jié)果表明，綠原酸的RSD為1.23%，蘆丁的RSD為1.35%，木犀草素的RSD為1.30%，供試品溶液在3 d內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 ?精密度試驗(yàn)

按“1.3”的色譜條件，綠原酸，蘆丁和木犀草素的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各進(jìn)10 μL，每種溶液測(cè)定6次，記錄峰面積，綠原酸RSD為0.88%，蘆丁RSD為1.18%，木犀草素RSD為1.22%，表明進(jìn)樣精密度良好。

2.5 ?重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取水母雪蓮粗粉（過(guò)100目）6份，按“1.4.2”制備樣品溶液，用“1.3”的色譜條件，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，綠原酸的RSD為0.89%（n=6），蘆丁的RSD為0.89%（n=6），木犀草素的RSD為1.11%（n=6）。

2.6 ?加樣回收試驗(yàn)

取已知綠原酸、蘆丁和木犀草素含量的雪蓮9份，分別在上述9份藥材中加入綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.204 mg/mL）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.225 mg/mL）和木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.112 mg/mL），按“1.4.2”制得供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄雪蓮中綠原酸、蘆丁和木犀草素的峰面積，計(jì)算含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6 ?樣品測(cè)定

按“1.3”的色譜條件，分別精密稱取3種雪蓮藥材粉末各1 g，按上述方法測(cè)得綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.132 1%～0.193 3%，平均為0.160 7%（n=8）;蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.113 4%～0.202 2%，平均為0.171 2%（n=8）;木犀草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.020 4%～0.058 2%，平均為0.036 1（n=8），其中綠原酸、蘆丁在天山雪蓮中含量最高，木犀草素在苞葉雪蓮中含量最高（表2）。

3 ?小結(jié)與討論

雪蓮中所含成分復(fù)雜，其理化性質(zhì)相差較大，表現(xiàn)出較大的色譜行為差異。目前文獻(xiàn)報(bào)道的多組分含量測(cè)定方法不甚理想，多有拖尾現(xiàn)象?？紤]到綠原酸與蘆丁2組分均具酸性，筆者通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH，以抑制樣品組分的解離，較好地改善了峰形[7]。同時(shí)，三者的極性差異較大，為了使各組分有較好的分離效果，采用梯度洗脫技術(shù)[8，9]。先后使用不同比例的甲醇、甲醇-磷酸、乙腈、乙腈-甲酸、乙腈-醋酸、乙腈-磷酸等，分離效果均不顯著，分離度不達(dá)標(biāo)，采用乙腈-0.8%磷酸水溶液梯度洗脫后，拖尾情況有較好改善，圖譜特征性增強(qiáng)，目標(biāo)峰的峰型和分離度均較好，故選擇乙腈-0.8%磷酸水溶液為流動(dòng)相[6]，用于梯度洗脫。

通過(guò)對(duì)3種雪蓮樣品中3種藥效化合物的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，不同種雪蓮有效成分含量有差異：木犀草素在苞葉雪蓮中含量最高;綠原酸、蘆丁在天山雪蓮中含量最高。可見(jiàn)，品種基因影響了藥材有效成分的積累，根據(jù)有效成分的含量確定藥材的品種是非常必要的，為今后雪蓮的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了必要的信息。

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