王桂清+李凡海+姬蘭柱

摘要：采用超臨界CO2萃取遼細(xì)辛精油，硅膠柱層析法分離精油，氣相色譜-質(zhì)譜法分析其成分。以小菜蛾和淡色庫蚊3齡幼蟲為試蟲，對遼細(xì)辛精油及各餾分的殺蟲活性進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，各餾分的殺蟲效果不同，餾分A5成分比較簡單，但其殺蟲活性并不高;其他餾分（如A1和A6）的組成成分較多，然而它們的殺蟲活性卻較高，說明遼細(xì)辛精油中起殺蟲作用的主要成分并非一種，可能多種成分均起作用。該結(jié)果為進(jìn)一步研究和開發(fā)以遼細(xì)辛為原料的新型植物源殺蟲劑奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：細(xì)辛精油;GC-MS;硅膠柱層析;殺蟲活性

中圖分類號：S482.3 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）02-0355-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.025

Comparison of the Biological Activities of Asarum Volatile Oil and

Its Different Distillates

WANG Gui-qing1，LI Fan-hai1，JI Lan-zhu2

（1.College of Agronomy， Liaocheng University， Liaocheng 252059， Shandong， China; 2.Institute of Applied Ecology，

Chinese Academy of Sciences， Shenyang 110016， China）

Abstract： The asarum volatile oil was extracted with CO2 by supercutical fluid extraction（SFE） method and separated by silica column chromatography. GC-MS fingerprint chromatograms of different distillates were analyzed. The biological activities of the asarum volatile oil and different distillates were tested and compared by using the third instar larvae of Plutella xylostella and Culex pipiens pallens as the test insects. Results showed that the biological activities of different distillates were significant. The fifth distillate （A5） was unadulterated， but its biological activity was very low. Other distillates （for instance A1 and A6） were a mixture， but their biological activities were higher than that of A5. It is indicated that the main constituent of insecticidal action in asarum volatile oil was not onsdefold chemical compound. It is possible that many components in asarum volatile oil act on insecticide. It will provide a basis for developing new botanic insecticide using asarum as raw material.

Key words： asarum volatile oil; GC-MS; silica column chromatography; biological activity

遼細(xì)辛（Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum（Maxim）Kitag.）為馬兜鈴科多年生草本植物，又名北細(xì)辛、萬病草、細(xì)參、煙袋鍋花、東北細(xì)辛，屬于重要的中草藥，主產(chǎn)于中國東北，一直供應(yīng)全國及出口，在國際市場上享有盛名[1]。細(xì)辛的藥用部位為根及根莖，其主要的有效成分為揮發(fā)油即細(xì)辛精油[2，3]，近年來，它在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的價值也逐步顯現(xiàn)。很多研究表明，細(xì)辛精油對昆蟲可表現(xiàn)出不同程度的引誘、拒食、驅(qū)避、抑制生長發(fā)育及直接毒殺作用，具有良好的殺蟲抑菌活性[4，5]。但研究限于未分離的細(xì)辛精油或主要單一成分如細(xì)辛醚等，而對于遼細(xì)辛精油不同餾分的殺蟲活性鮮見報道。本研究采用超臨界CO2萃取法提取了遼細(xì)辛精油，采用硅膠柱層析進(jìn)行分離，同時使用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）進(jìn)行指紋圖譜分析，以小菜蛾3齡幼蟲和淡色庫蚊3齡幼蟲作為供試?yán)ハx，比較了各餾分的殺蟲活性，為研究和開發(fā)新型植物源殺蟲劑提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

供試植物樣品遼細(xì)辛的根購買于同仁堂藥房，將其進(jìn)一步陰干，粉碎，過380 μm孔徑篩。供試?yán)ハx包括粘小菜蛾（Plutella xylostella）3齡幼蟲和淡色庫蚊（Culex pipiens pallens）3齡幼蟲，均由沈陽化工研究院新藥生測實驗室提供。endprint

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?氣相色譜條件 ?石英毛細(xì)管柱HP-5MS，50 m×0.25 mm×0.25 μm;程序升溫：首先以8 ℃/min升至120 ℃，再以2 ℃/min升至150 ℃，最后以10 ℃/min升至280 ℃;載氣：He;柱流量：0.9 mL/min;進(jìn)樣量：1 μL;進(jìn)樣口溫度：250 ℃;接口溫度：230 ℃;柱壓：80 kPa;分流比：10∶1。

1.2.2 ?質(zhì)譜條件 ?離子源為EI;電離能：70 eV;離子源溫度：230 ℃;質(zhì)譜掃描范圍：50～500 amu;掃描周期：1 s。

1.2.3 ?精油提取方法 ?準(zhǔn)確稱取樣品1.85 kg，裝入5 L的萃取罐內(nèi)，采用超臨界CO2進(jìn)行萃取，萃取條件：壓力20 MPa，溫度40 ℃，流量20 kg/h;解析釜I壓力6～7 MPa，溫度45 ℃;解析釜II壓力5～6 MPa，溫度35 ℃，萃取時間為60 min，每20 min收集提取物稱量，密封，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 ?遼細(xì)辛精油的圖譜分析 ?將所得到的遼細(xì)辛精油用乙酸乙酯溶解后進(jìn)行GC-MS分析鑒定。

1.2.5 ?硅膠柱層析分離 ?采用硅膠柱層析法對超臨界CO2萃取法得到的細(xì)辛精油進(jìn)行了分離。柱長50 cm，直徑5 cm。硅膠為青島海洋化工廠分廠生產(chǎn)，型號為粗孔ZCX-Ⅱ，粒度109～152 μm。裝好柱后，將10 mL精油從最上端倒入，等精油被硅膠吸附后，用石油醚與乙酸乙酯的混合液進(jìn)行洗脫，石油醚與乙酸乙酯的比例依次為8∶1、6∶1、4∶1、2∶1和1∶1。用20 mL指形管接洗脫液，指形管事先編號，同時跟蹤試樣洗脫情況，即每接1管洗脫液，用毛細(xì)管吸取少量點滴在層析板上，在紫外燈下觀察顯色情況。最后將顯色的洗脫液全部點滴在層析板上進(jìn)行層析，根據(jù)層析情況，合并洗脫液。

1.2.6 ?殺蟲活性測定方法 ?采用葉碟法測定遼細(xì)辛精油對小菜蛾幼蟲的活性。挑選長勢良好、無藥的甘藍(lán)嫩葉，用濕布擦干凈，再將甘藍(lán)嫩葉用打孔器打成直徑2 cm的葉碟，放到直徑6 cm鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，1皿1個葉碟，編號。用噴霧器將細(xì)辛精油藥液（濃度分別為4 000、3 000、2 000、1 000和500 mg/L）噴在葉碟上，正反面噴均勻，用藥量約0.5 mL，自然晾干。然后接入供試小菜蛾幼蟲10頭，3 次重復(fù)，于24 h調(diào)查試蟲的死亡率，計算LC50。以噴含吐溫-80的蒸餾水為對照。采用浸漬法測定遼細(xì)辛精油對淡色庫蚊幼蟲的殺傷作用。先將24孔培養(yǎng)板編號，分別在孔中加入帶有蚊幼蟲20條左右的水1.20、1.60、1.80、1.90和1.95 mL，再加入200 mg/L的母液0.80、0.40、0.20、0.10和0.05 mL，終體積為2 mL，終濃度為80、40、20、10和5 mg/L。在溫度（25±1） ℃，相對濕度60%～80%，光照（L∶D=16 h∶8 h）的條件下培養(yǎng)24 h檢查結(jié)果，計算LC50。振動培養(yǎng)板，并用鑷子輕觸蚊幼蟲身體，以沉入孔底部不動者為死亡。每個樣品重復(fù)3次，每次均以2%乙醇浸漬蚊幼蟲作為空白對照。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?遼細(xì)辛精油的指紋圖譜分析

遼細(xì)辛根采用超臨界CO2提取后，1.85 kg的原料共萃取得到42 g精油，萃取率為2.27%。精油萃取效率較高，品質(zhì)較好，顏色為棕黃色。該精油指紋圖譜如圖1。由圖可見，超臨界CO2萃取得到的遼細(xì)辛精油的組成成分較多，能夠確定峰值的就超過35種，如果把次要的小峰也算入的話，遼細(xì)辛精油的組成成分將超過40種。

2.2 ?遼細(xì)辛精油的分離

超臨界CO2萃取法得到的精油（標(biāo)記為A0）經(jīng)過硅膠柱層析后，初次得到6個餾分，即A1-A6。這6個餾分的質(zhì)譜圖如圖2-7。從指紋圖譜看，這6個餾分仍然是混合物，其中餾分A5成分較少。

2.3 ?不同餾分殺蟲活性比較

遼細(xì)辛超臨界CO2萃取的精油（A0）及各餾分殺蟲活性的結(jié)果如表1。從表中可以看出，各餾分的殺蟲效果不同，其中餾分A6的殺蟲活性最好，對小菜蛾和淡色庫蚊的LC50分別為892.8 mg/L和1.27 mg/L，與萃取精油（A0，對2種試蟲的LC50分別為1 408.0 mg/L和25.05 mg/L）相比，其殺蟲活性分別提高36.59%和94.93%;對小菜蛾的殺蟲活性比A0高的餾分還有A1、A2和A3，LC50分別為1 218.2 mg/L、1 274.7 mg/L和1 352.0 mg/L，殺蟲活性分別提高13.48%、9.47%和3.98%;對淡色庫蚊的殺蟲活性比A0高的餾分還有A1和A4，LC50分別為6.31 mg/L和7.94 mg/L，殺蟲活性分別提高74.81%和68.30%;殺蟲活性最低的是餾分A5，對小菜蛾和淡色庫蚊的LC50分別為5 705.8 mg/L和114.87 mg/L，與萃取精油（A0）相比，其殺蟲活性顯著降低;對小菜蛾的殺蟲活性比A0低的餾分還有A4，LC50為1 504.1 mg/L，殺蟲活性降低6.40%;對淡色庫蚊的殺蟲活性比A0低的餾分還有A2和A3，LC50分別為48.74 mg/L和62.36 mg/L，殺蟲活性顯著降低。

從表1還可以看出，同一餾分對不同試蟲的殺蟲效果不同，如A2和A3，與A0比較，對小菜蛾的殺蟲活性均提高，提高率分別為9.47%和3.98%，而對淡色庫蚊的殺蟲活性均降低，說明同種物質(zhì)對不同試蟲的殺蟲效果不同。

結(jié)合圖2-7及表1可以看出，餾分A5成分比較簡單，但其殺蟲活性并不強(qiáng)，而其他餾分（如A1和A6）雖然組成成分較多，且組成成分存在差異，但其殺蟲活性卻較高，說明遼細(xì)辛精油中起殺蟲作用的主要成分并非是單一的化合物，但具體情況，有待于今后的繼續(xù)探索。endprint

3 ?小結(jié)與討論

采用超臨界CO2法萃取了遼細(xì)辛精油，并進(jìn)行了GC-MS指紋圖譜分析，結(jié)果表明遼細(xì)辛精油是由多種成分組成的混合物，成分較多，能夠標(biāo)定峰值的有35種。采用硅膠柱層析法對遼細(xì)辛精油進(jìn)行了分離，初步得到6個餾分，其指紋圖譜表明，各餾分均為混合物，餾分A5成分較少。以小菜蛾和淡色庫蚊為試蟲，對遼細(xì)辛精油及各餾分的殺蟲活性進(jìn)行了比較，表明各餾分的殺蟲效果不同，與萃取精油比較，殺蟲效果或提高或降低，餾分A5成分比較少，但其殺蟲活性并不強(qiáng)，而其它餾分（如A1和A6）雖然組成成分較多，且組成成分存在差異，但其殺蟲活性卻較高，說明遼細(xì)辛精油中起殺蟲作用的主要成分并非是單一的一種化合物，可能多種成分均起作用，但具體情況有待于繼續(xù)探索。

細(xì)辛屬于重要的中草藥，在醫(yī)藥上應(yīng)用廣泛的，其精油（揮發(fā)油）在動植物蟲害上也有一定的應(yīng)用。楊銀書等[6]研究了8種植物（川芎、細(xì)辛、前胡、橘皮、藿香、當(dāng)歸、石菖蒲、薄荷）精油對媒介硬蜱的驅(qū)避效果，結(jié)果表明細(xì)辛精油對草原革蜱（Dermacentor nuttallii）、日本血蜱（Haemaphysalis japonica）、青海血蜱（Haemaphysalis qinghainesis）、血紅扇頭蜱（Rhipicephalus sanguineous）若蟲和成蟲具有較好的麻痹及驅(qū)避作用。莫建初等[7]以黃胸散白蟻（Reticulitermes flaviceps）為對象，在室內(nèi)對細(xì)辛的抗白蟻效果作了研究，結(jié)果表明華細(xì)辛（Asarum sieboldii Miq.）粉對黃胸散白蟻不僅有較強(qiáng)的毒殺效果，而且有驅(qū)避活性;劉樹民等[8]研究顯示，北細(xì)辛揮發(fā)油對棲北散白蟻具有較好的驅(qū)避作用和熏蒸活性;尹紅等[9]發(fā)現(xiàn)北細(xì)辛醇提物與揮發(fā)油對棲北散白蟻也有較好的觸殺效果。韓俊艷等[10]研究表明，北細(xì)辛揮發(fā)油在8 μg/mL 時對二斑葉螨的熏蒸毒性最強(qiáng)，24、48 h的螨死亡率分別為72.6%和100%。細(xì)辛精油及單一成分對蚊蟲的生物活性，學(xué)者們研究的較多，王桂清等[11]研究證明遼細(xì)辛精油對淡色庫蚊幼蟲有較強(qiáng)的毒殺作用，對其成蟲有較好的熏蒸作用;Perumalsamy等[12，13]發(fā)現(xiàn)細(xì)辛對淡色庫蚊的成蚊與蚴蚊具有殺滅作用，其提取物有望開發(fā)成殺蟲劑;張靜等[14，15]的研究證明，細(xì)辛醚對家蠅、淡色庫蚊和部分農(nóng)業(yè)害蟲有明顯的殺蟲效果，細(xì)辛醚對昆蟲的致毒癥狀與神經(jīng)毒劑類似;本研究也證明，遼細(xì)辛精油及餾分均具有一定的殺蟲活性，作為植物源殺蟲劑有一定的研究前景。

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