李鐵軍+丁邦琴+蔡鳳+陳玉霜

摘要：以枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis）菌株LDB1為試驗(yàn)材料，研究其固體、液體培養(yǎng)條件下的抑菌譜情況，明確該菌株對(duì)植物病原真菌[水稻紋枯病菌（Rhizoclonia solani）、蘋果輪紋病菌（Physalospora piricola）、腐霉病菌（Pythium）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小麥全蝕病菌（Gaetanannomyces graminis）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f . sp. Vasinfectum）、小麥根腐病菌（Helminthosporium sorokianum），番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers）]的抑制效果。結(jié)果表明，兩種培養(yǎng)條件下對(duì)供試的8種植物病原真菌均有較好的抑制效果;除水稻紋枯病菌和蘋果輪紋病菌外，液體培養(yǎng)對(duì)其他5種病原菌的抑制作用優(yōu)于固體培養(yǎng)，比較分析顯示兩種培養(yǎng)方式處理差異顯著。

關(guān)鍵詞：生防菌;枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis）菌株LDB1;植物病原真菌;抑制作用

中圖分類號(hào)：S476.1 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）02-0341-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.021

Antifungal Spectrum of Biocontrol Bacterium Strain LDB1 against

Plant Pathogen Fungi

LI Tie-jun，DING Bang-qin，CAI Feng，CHEN Yu-shuang

（Chemical and Biological Engineering Institute， Nantong Vocational College， Nantong 226007， Jiangsu， China）

Abstract： The bacillus subtilis strain LDB1 isolated by authors laboratory was cultured under the conditions of the solid and liquid to determine the antifungal activities against plant pathogen fungi including Rhizoclonia solani， Physalospora piricola，Pythium，Sclerotinia sclerotiorum，Gaetanannomyces graminis，F(xiàn)usarium oxysporum f. sp. Vasinfectum， Helminthosporium sorokianum， and Botrytis cinerea Pers. The results showed that the strain LDB1 cultured by both treatments had obvious inhibitory effect on the 8 plant pathogen fungi. The antifungal activity of the bacterial suspension was stronger than that of the solid in the overall level except Rhizoclonia solani and Physalospora piricola. The difference between the two treatments was significant.

Key words： biocontrol fungi; strain LDB1（Bacillus Subtilis）; plant pathogen fungi， antibacterial activity

化學(xué)殺菌劑暴露出的諸多難以克服的缺點(diǎn)使新型生防菌劑的研發(fā)成為農(nóng)業(yè)有害生物防治熱門。拮抗細(xì)菌在植物病害防治中起到了非常重要的作用，無論是在自然發(fā)生的生物拮抗現(xiàn)象還是在生物防治中，細(xì)菌的生防效果都非常明顯[1]。在眾多的生防細(xì)菌中，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）憑借其易培養(yǎng)、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、對(duì)人畜無毒等優(yōu)點(diǎn)而為人青睞[2，3]?？莶菅挎邨U菌用于防治的植物病害主要包括蔬菜病害[4]、作物病害[5]、林木果樹病害[6]，在用于植物病害的生物防治方面的研究和開發(fā)應(yīng)用取得令人矚目的成就，美國(guó)已有4株枯草芽孢桿菌生防菌株獲得環(huán)保局（EPA）商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可[7];中國(guó)已開發(fā)出一批生防效果優(yōu)良的枯草芽孢桿菌菌株[8]，如B916、B908、B3、B903、BL03、XMl6等?，F(xiàn)有商品化的枯草芽孢桿菌制劑由于使用的枯草芽孢桿菌菌株不盡相同，防治對(duì)象也各不相同。本研究以枯草芽孢桿菌菌株LDB1為試驗(yàn)材料，進(jìn)行固體、液體培養(yǎng)條件下的抑菌譜比較，以明確該菌株對(duì)不同類型植物病原真菌的抑制效果，從而為生防菌菌株LDB1制劑的研發(fā)、生產(chǎn)、田間應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試菌株 ?生防菌菌株LDB1，由南通職業(yè)大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室分離篩選得到，水稻紋枯病菌（Rhizoclonia solani）、蘋果輪紋病菌（Physalospora piricola）、腐霉病菌（Pythium）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小麥全蝕病菌（Gaetanannomyces graminis）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum）、小麥根腐病菌（Helminthosporium sorokianum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers）由南通職業(yè)大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。endprint

1.1.2 ?培養(yǎng)基 ?YPGA培養(yǎng)基（固體）：胰蛋白胨5 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。用于生防菌菌株LDB1的活化及固體培養(yǎng)。

YPGA培養(yǎng)基（液體）：胰蛋白胨5 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。用于生防菌菌株LDB1的液體發(fā)酵培養(yǎng)。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、 瓊脂15 g、蔗糖20 g、蒸餾水1 000 mL。用于植物病原真菌的活化及培養(yǎng)。

1.1.3 ?儀器和設(shè)備 ?分析天平，電磁爐，高壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)搖床，接種環(huán)（勾）、尺子、照相機(jī)、微波爐、報(bào)紙、紗布、鐵架臺(tái)、導(dǎo)管、試管、鑷子、玻璃器皿等。

1.2 ?方法

1.2.1 ?菌種活化 ?細(xì)菌活化：在超凈工作臺(tái)中，用接種環(huán)在斜面上挑一環(huán)生防菌菌株LDB1 到新的YPGA固體斜面培養(yǎng)基上，“Z”字形劃線接種，在恒溫培養(yǎng)箱中26 ℃培養(yǎng)2 d。

真菌活化：第一次活化。在超凈工作臺(tái)上，用接種針在斜面上挑一塊真菌菌種接種到PDA培養(yǎng)基的斜面上，在恒溫培養(yǎng)箱中26 ℃培養(yǎng)5～7 d。第二次活化。在超凈工作臺(tái)上，用接種針在第一次活化培養(yǎng)的PDA培養(yǎng)基斜面上挑一塊真菌菌絲接種到PDA平板中央。接種后，將培養(yǎng)皿放入26 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至能打出滿足試驗(yàn)所需的菌餅。

1.2.2 ?生防菌菌株LDB1固體培養(yǎng)下的抑菌譜測(cè)定 ?將PDA培養(yǎng)基熔化后倒入培養(yǎng)皿冷凝后，采用平板對(duì)峙法[9]，在平板中央接種直徑為5 mm的病原菌菌餅，在菌餅周圍四角用接種環(huán)將活化的菌株LDB1涂成5 mm直徑的圓形，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，對(duì)照組只接真菌菌餅不涂細(xì)菌。26 ℃恒溫培養(yǎng)至對(duì)照長(zhǎng)滿平板，用十字交叉法測(cè)量各培養(yǎng)皿中病原真菌的菌落直徑[10]，計(jì)算抑制率。抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.2.3 ?生防菌菌株LDB1發(fā)酵液的制備 ?采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)法[11]。在超凈工作臺(tái)中，用接種環(huán)取一環(huán)細(xì)菌接種到裝有50 mL YPGA培養(yǎng)基（液體）的250 mL三角錐形瓶中，搖床轉(zhuǎn)速130 r/min，26 ℃振蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.4 ?生防菌菌株LDB1液體培養(yǎng)下的抑菌譜測(cè)定 ?將PDA培養(yǎng)基熔化后倒入培養(yǎng)皿冷凝，采用濾紙片法，在平板中央接種直徑為5 mm的病原菌菌餅，在菌餅周圍四角用無菌鑷子放置直徑為5 mm的滅菌濾紙片，用滴管在每個(gè)濾紙片上滴加等量菌株LDB1的發(fā)酵液，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，對(duì)照組只接真菌菌餅不加發(fā)酵液。26 ℃恒溫培養(yǎng)至對(duì)照菌落長(zhǎng)滿平板。用十字交叉法測(cè)量各培養(yǎng)皿中病原真菌的菌落直徑，計(jì)算抑制率。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?生防菌菌株LDB1固體培養(yǎng)對(duì)病原真菌的抑菌譜

生防菌菌株LDB1固體培養(yǎng)對(duì)病原真菌的抑制作用測(cè)定結(jié)果（表1、圖1、圖2）表明，生防菌菌株LDB1固體培養(yǎng)對(duì)供試病原真菌皆具有不同程度的抑制作用，對(duì)水稻紋枯病菌、蘋果輪紋病菌、小麥全蝕病菌、小麥根腐病菌、腐霉病菌、油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌、番茄灰霉病菌的抑制率分別為29.4%、34.1%、24.7%、18.8%、11.8%、25.6%、33.3%、24.2%。其中對(duì)蘋果輪紋病菌和棉花枯萎病菌的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)腐霉病菌的抑制作用較弱。

通過SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件鄧肯氏多重比較，在0.05水平，生防菌菌株LDB1對(duì)棉花枯萎病菌和蘋果輪紋病菌的抑制作用差異不顯著，但是對(duì)這2種病菌的抑制作用與其他6種病菌相比差異顯著，說明固體培養(yǎng)條件下菌株LDB1對(duì)棉花枯萎病菌和蘋果輪紋病菌的抑制作用較強(qiáng)。

2.2 ?生防菌菌株LDB1液體培養(yǎng)對(duì)8種病原真菌的抑菌譜

生防菌菌株LDB1液體培養(yǎng)對(duì)病原真菌的抑制作用測(cè)定結(jié)果（表1、圖3、圖4）表明，生防菌菌株LDB1液體培養(yǎng)對(duì)供試病原真菌也有不同程度的抑制作用，其對(duì)水稻紋枯病菌、蘋果輪紋病菌、小麥全蝕病菌、腐霉病菌、小麥根腐病菌、油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌、番茄灰霉病菌的抑制率分別為27.1%、28.2%、25.9%、24.6%、27.1%、26.7%、34.2%、27.8%。其中對(duì)棉花枯萎病菌的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)腐霉病菌的抑制作用比較弱。

進(jìn)行比較分析表明，在0.05水平，生防菌菌株LDB1對(duì)棉花枯萎病菌的抑制作用與對(duì)其他7種病菌的抑制作用相比差異顯著，但是對(duì)水稻紋枯病菌、蘋果輪紋病菌、小麥全蝕病菌、腐霉病菌、小麥根腐病菌、油菜菌核病菌、番茄灰霉病菌這7種病菌的抑制作用差異不顯著，可見液體培養(yǎng)條件下該菌對(duì)棉花枯萎病菌的抑制作用較強(qiáng)。

2.3 ?不同處理生防菌菌株LDB1抑菌譜比較

除水稻紋枯病菌和蘋果輪紋病菌外，生防菌菌株LDB1液體培養(yǎng)對(duì)其他5種病原菌的抑制作用比其固體培養(yǎng)強(qiáng)，且經(jīng)過比較分析表明，在0.05的水平上，2種處理方式差異顯著。可見，生防菌菌株LDB1對(duì)供試的8種病原真菌抑制效果雖然各不相同，但均表現(xiàn)了較好的抑制效果，具有廣譜抗真菌作用。

3 ?小結(jié)與討論

枯草芽孢桿菌是具有較高生物應(yīng)用價(jià)值潛力的菌種之一，國(guó)內(nèi)外對(duì)于芽孢桿菌應(yīng)用方面的研究日益增多，枯草芽孢桿菌作為一種生防細(xì)菌越來越引起人們的關(guān)注[12]。本研究選用的生防菌菌株LDB1在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)多種植物病原真菌表現(xiàn)了良好的抑制作用，是一種廣譜拮抗菌。在接種量以及培養(yǎng)條件相同的情況下，該菌株對(duì)不同病原真菌的抑制作用不同，原因可能與真菌的生長(zhǎng)速度有關(guān)。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，番茄灰霉病菌在26 ℃恒溫培養(yǎng)條件下接種5 mm直徑的菌餅生長(zhǎng)速度很慢，還未開始生長(zhǎng)前，接種的生防菌菌株LDB1就幾乎長(zhǎng)滿平板，因此先接種真菌培養(yǎng)48 h后再接種細(xì)菌。另外，該生防菌對(duì)不同病原真菌的抑制作用不同，還可能與供試病原真菌本身的特性相關(guān)，由于供試病原真菌屬于不同的種屬，決定了它們?cè)谏L(zhǎng)習(xí)性、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等方面有所差異，導(dǎo)致了生防菌在和病原菌互作過程中所表現(xiàn)出的拮抗能力不同。此外，在整體水平上，生防菌菌株LDB1液體培養(yǎng)比其固體培養(yǎng)抑菌作用強(qiáng)，這可能與生防菌的作用機(jī)制有關(guān)?？莶菅挎邨U菌主要是通過直接作用和間接作用達(dá)到抑制效果，直接作用主要是空間競(jìng)爭(zhēng)，間接作用則是通過胞外分泌的各種酶和蛋白質(zhì)。含菌發(fā)酵液與固體態(tài)菌種均具有空間競(jìng)爭(zhēng)能力，但是發(fā)酵液中已經(jīng)含有部分胞外分泌的抑菌物質(zhì)，能夠比固態(tài)菌種更早發(fā)揮抑制作用。本試驗(yàn)只是初步的探索，對(duì)于生防菌菌株LDB1的具體作用機(jī)制及其分泌的抑菌物質(zhì)的抗菌活性尚有待進(jìn)一步研究。endprint

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