薛耀華 楊斌 鄭和平

聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)梅毒螺旋體的應(yīng)用進(jìn)展

薛耀華 楊斌 鄭和平

梅毒的診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)，血清學(xué)檢測(cè)和梅毒螺旋體暗視野檢查。隨著人們對(duì)梅毒螺旋體基因組的認(rèn)識(shí)，已經(jīng)建立了多種基于梅毒螺旋體特異性基因序列的聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法，常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)、巢式聚合酶鏈反應(yīng)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、多重聚合酶鏈反應(yīng)和實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)可以檢測(cè)多種不同類型的臨床標(biāo)本，用于梅毒螺旋體的基因檢測(cè)。聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的靶基因有tpp47、polA、bmp、tmpA、arp、tpr等，其中tpp47、polA為常用的靶基因。皮損拭子、血液、腦脊液、病理組織、羊水等均可進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)。

梅毒；蒼白密螺旋體；聚合酶鏈反應(yīng)；基因擴(kuò)增；靶基因

梅毒是由梅毒螺旋體（Tp）感染引起的全身多系統(tǒng)疾病，近年來發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題［1-2］。梅毒的防治主要在于早發(fā)現(xiàn)，早診斷和早治療［3-4］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）在梅毒診斷和流行病學(xué)方面得到了不斷地更新和完善。在過去的20多年里，已經(jīng)建立了多種基于Tp特異性基因序列的PCR檢測(cè)方法，可以檢測(cè)多種不同類型的臨床標(biāo)本［5］。

作者單位：510515廣州，南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)系（薛耀華）；廣東省皮膚性病防治中心（薛耀華、鄭和平、楊斌）

1 Tp PCR檢測(cè)類型

1.1常規(guī)PCR：Tp基因是由1138006個(gè)堿基對(duì)組成的環(huán)狀DNA，有1 081個(gè)開放讀碼框架。常規(guī)PCR擴(kuò)增后需做凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物容易造成假陽(yáng)性污染，是早期廣泛應(yīng)用的基因診斷方法，但對(duì)Tp含量較低的標(biāo)本敏感性較低［6］。

1.2 反轉(zhuǎn)錄PCR：是將1條RNA鏈反轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。Centurion-Lara等［7］用反轉(zhuǎn)錄 PCR檢測(cè) Tp16S rRNA，先反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以cDNA為模板擴(kuò)增366 bp的基因片段。

1.3 巢式PCR：利用兩對(duì)PCR引物進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)，第2次PCR擴(kuò)增片段短于第1次擴(kuò)增片段。由于巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴(kuò)增，增加了檢測(cè)的敏感性；又有兩對(duì)PCR引物與檢測(cè)模板配對(duì)，從而增加了檢測(cè)的可靠性。Grange等［8］收集拭子標(biāo)本進(jìn)行巢式PCR與暗視野顯微鏡檢查，其中一期梅毒患者65例，二期梅毒44例，非梅毒患者43例，巢式PCR檢測(cè)的敏感性為82%，特異性為95%；暗視野顯微鏡檢查的敏感性為73%，特異性為88%。Grange根據(jù)Tp tpp47基因設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，第1次擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 103 bp，以此PCR產(chǎn)物為模板，第2次擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為168 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。由于巢式PCR進(jìn)行2次PCR反應(yīng)，操作較繁瑣。

1.4 多重PCR：在同一PCR反應(yīng)體系里有2對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)。與常規(guī)PCR方法相比，多重PCR的主要特點(diǎn)是高效，在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)能同時(shí)檢出多種病原微生物。Scott等［9］設(shè)計(jì) Tp、單純皰疹病毒的特異性引物，用多重PCR檢測(cè)692例生殖器潰瘍標(biāo)本，結(jié)果皰疹陽(yáng)性275例，15例Tp陽(yáng)性，1例梅毒和皰疹病毒雙陽(yáng)性。

1.5 實(shí)時(shí)熒光PCR：實(shí)時(shí)熒光PCR融合了PCR的高靈敏性、DNA分子雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確定量等優(yōu)點(diǎn)，可直接探測(cè)PCR過程中熒光信號(hào)的變化以獲得結(jié)果，不需要PCR后處理或電泳檢測(cè)，完全閉管操作，避免了產(chǎn)物的污染。近年來，實(shí)時(shí)熒光PCR已經(jīng)成為Tp PCR檢測(cè)的主要方法，實(shí)時(shí)熒光PCR包括實(shí)時(shí)熒光定性PCR和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR。Heymans等［10］擴(kuò)增 Tp polA 基因，TaqMan探針5′端標(biāo)記熒光染料FAM，3′端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ-1，Ct值 <36判斷為陽(yáng)性結(jié)果。Tipple等［11］用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)擴(kuò)增tpp47基因，應(yīng)用SYBR GreenⅠ染料進(jìn)行熒光定量，最低檢出限為10 μl模板 DNA 中有 1 個(gè) Tp DNA。 Cruz等［12］擴(kuò)增Tp polA基因，用TaqMan探針技術(shù)進(jìn)行PCR定量，探針5′端標(biāo)記熒光染料Cy5，3′端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ-3，該方法的檢出限為每毫升全血標(biāo)本中15～150個(gè)Tp。Cruz還檢測(cè)全血標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)二期梅毒患者Tp拷貝數(shù)范圍在194～1 954拷貝/ml。實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)于研究螺旋體在體內(nèi)的感染量有重要意義。

2 PCR擴(kuò)增的靶基因

2.1 tpp47基因：tpp47基因編碼相對(duì)分子質(zhì)量為47 000膜蛋白，常規(guī)PCR、巢式PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR應(yīng)用較多。tpp47基因在Tp亞種中均可高水平表達(dá)，而且是各種Tp亞種表達(dá)水平最高的基因之一，因此，是Tp檢測(cè)最常用的PCR靶基因。Brustain［13］用常規(guī)PCR擴(kuò)增螺旋體相對(duì)分子質(zhì)量為47 000膜蛋白基因，羊膜液、新生兒血液和新生兒腦脊液的敏感性為78%。Gayet-Ageron等［14］應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定性PCR檢測(cè)tpp47基因，一期梅毒皮損拭子、全血、血清和尿液的敏感性分別為80%、28%、55%和29%；二期梅毒皮損拭子、全血、血清、尿液的敏感性分別為 20%、36%、47%和 44%。雷震山等［15］用巢式 PCR法對(duì)195例硬下疳棉拭子和血液標(biāo)本中Tp特異性基因tpp47進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，所有標(biāo)本同時(shí)做暗視野鏡檢和Tp-ELISA血清學(xué)檢測(cè)。結(jié)果顯示，巢式PCR檢測(cè)出陽(yáng)性標(biāo)本176例，其靈敏度和特異性分別為90.3%和100%。暗視野鏡檢和Tp-ELISA檢測(cè)的靈敏度分別為82.1%和84.6%，特異性分別為85.8%和93.3%。

2.2 polA基因：polA即DNA聚合酶Ⅰ，比較Tp與其他微生物polA基因的同源性，發(fā)現(xiàn)polA基因非常獨(dú)特，所有編碼的半胱氨酸多達(dá)24個(gè)，占多聚酶氨基酸總數(shù)的2.4%，而絕大多數(shù)微生物只有l(wèi)～2個(gè)，僅占0.1%，并有4個(gè)特殊的插入點(diǎn)，因而Tp polA基因具有較高的敏感性和特異性。Cruz等［12］應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)擴(kuò)增Tp polA基因。Castro等［16］設(shè)計(jì)了擴(kuò)增Tptpp47基因和polA基因的引物，檢測(cè)隱性梅毒患者的血液標(biāo)本，tpp47基因的敏感性為39.1%，polA基因的敏感性為31.1%。張森淼等［17］以tpp47和polA為靶基因檢測(cè)40例隱性梅毒患者全血、血漿和血清的Tp，結(jié)果tpp47檢測(cè)全血、血漿、血清的DNA陽(yáng)性率分別為30.0%、37.5%、20.0%，polA陽(yáng)性率分別為22.5%、27.5%、15.0%，兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Gayet-Ageron等［18］系統(tǒng)性評(píng)價(jià)了Tp擴(kuò)增的靶基因，tpp47和polA為常用靶基因，在這兩個(gè)位置設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增Tp，PCR陽(yáng)性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 其他靶基因：在早期梅毒PCR研究中，Bruisten［13］應(yīng)用巢式PCR反應(yīng)檢測(cè)編碼相對(duì)分子質(zhì)量為39 000的膜蛋白bmp基因，收集372例生殖器潰瘍拭子標(biāo)本，PCR的敏感性為75.0%，特異性為100%；血清學(xué)檢測(cè)的敏感性為43.8%，特異性為100%。PCR檢測(cè)Tp并不僅局限于Tp DNA，16S rRNA和23S rRNA分子也可應(yīng)用于Tp的檢測(cè)。Centurion-Lara等［7］用反轉(zhuǎn)錄 PCR 檢測(cè) Tp 16S rRNA，可以檢測(cè)到1個(gè)拷貝的梅毒螺旋體。Chen等［19］檢測(cè)Tp阿奇霉素耐藥的23S rRNA的A2058G和A2059G點(diǎn)突變。近年來arp和tpr作為靶基因應(yīng)用于 Tp 基因分型研究［20］。

3 PCR檢測(cè)標(biāo)本類型

2013年世界衛(wèi)生組織頒布的《性傳播疾病包括人類免疫缺陷病毒實(shí)驗(yàn)室診斷》一書明確指出，Tp PCR檢測(cè)的標(biāo)本類型包括皮損、病理組織和體液等，這些樣本可以是新鮮的、凍存的、固定的或石蠟包埋的［21］。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者最常用的標(biāo)本類型是一期梅毒患者生殖器潰瘍分泌物樣本和二期梅毒患者的血液樣本。

Grange等［8］應(yīng)用巢式 PCR技術(shù)擴(kuò)增 tpp47基因，檢測(cè)拭子和血液標(biāo)本的Tp，其中一期梅毒87例，二期梅毒103例，早期隱性梅毒40例。對(duì)于有皮損的梅毒患者，用拭子收集組織液。如果二期梅毒患者沒有潰瘍，但皮膚有斑點(diǎn)或丘疹，用刀刮取皮膚，盡量收集皮膚滲液。同時(shí)收集梅毒患者的血液標(biāo)本，包括全血、血漿、血清和單個(gè)核細(xì)胞。作者還收集拭子標(biāo)本進(jìn)行巢式PCR檢測(cè)，敏感性為82%，特異性為95%；暗視野顯微鏡檢查的敏感性為73%，特異性為88%。178例一期和二期梅毒患者，單個(gè)核細(xì)胞、血漿、血清和全血樣本的敏感性為12%～38%，40例早期隱性梅毒患者的敏感性為4%～16%，一期、二期和早期隱性梅毒患者血標(biāo)本總特異性為92%～97%。

Dumaresq等［22］應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)122例HIV感染的早期梅毒患者的腦脊液，評(píng)價(jià)PCR在神經(jīng)梅毒診斷中的價(jià)值。PCR檢測(cè)的敏感性為58%，特異性為67%，PCR檢測(cè)可輔助診斷神經(jīng)梅毒。Castro等［16］發(fā)現(xiàn)，晚期隱性梅毒患者耳垂刮取液的Tp檢出率最高，為56%，血漿、全血和血清分別為42.9%、38.1%和25%，作者認(rèn)為耳垂血最適合做隱性梅毒患者PCR檢測(cè)。目前文獻(xiàn)顯示，只有Castro采用耳垂血進(jìn)行梅毒PCR檢測(cè)，尚無其他學(xué)者進(jìn)行耳垂血的PCR研究，耳垂血的優(yōu)勢(shì)還需要更多的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

4 PCR的應(yīng)用

4.1 一期梅毒：臨床表現(xiàn)主要為硬下疳，因此一期梅毒患者主要取潰瘍組織液標(biāo)本進(jìn)行PCR檢測(cè)。Müller等［23］研究 4例一期梅毒的皮損組織病理標(biāo)本，PCR全部陽(yáng)性。 Shields等［24］檢測(cè)55例一期梅毒患者的生殖器潰瘍、直腸拭子和口腔潰瘍標(biāo)本，49例PCR陽(yáng)性，敏感性為89.1%，特異性為99.1%。Gayet-Ageron等［14］研究26例一期梅毒患者，發(fā)現(xiàn)潰瘍拭子陽(yáng)性率為80%，全血為28%。目前認(rèn)為，一期梅毒患者潰瘍拭子PCR檢測(cè)的敏感性高，適用PCR檢測(cè)。尤其是血清學(xué)陰性的極早期梅毒患者，檢測(cè)更有臨床意義。

4.2 二期梅毒：臨床表現(xiàn)主要是皮膚黏膜損害，包括斑疹、丘疹等，外陰及肛周的濕丘疹或扁平濕疣為其特征性損害。Müller等［23］研究34例二期梅毒皮損組織病理標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)26例PCR檢測(cè)陽(yáng)性（76%）。Shields等［24］收集22例二期梅毒患者梅毒疹拭子和黏膜皮損拭子，11例PCR陽(yáng)性，敏感性為50%，特異性為100%。Gayet-Ageron等［14］研究40例二期梅毒患者，全血PCR陽(yáng)性率為36%。以上研究提示，二期梅毒血液標(biāo)本的陽(yáng)性率<40%，PCR檢測(cè)不適用于二期梅毒患者的診斷。

4.3 三期梅毒：可有一期或二期梅毒史，病程2年以上。Müller等［23］研究7例三期梅毒的皮損組織病理標(biāo)本，1例PCR檢測(cè)陽(yáng)性（14%）。三期梅毒的PCR陽(yáng)性率很低，不適用PCR檢測(cè)。

4.4 神經(jīng)梅毒：為Tp侵犯神經(jīng)系統(tǒng)所致，采集腦脊液檢測(cè)。Dumaresq等［22］研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)梅毒患者腦脊液PCR的敏感性為58%，特異性為67%。García等［25］檢測(cè)了8例神經(jīng)梅毒患者的腦脊液，敏感性為50%。Molepo等［26］采集50例懷疑神經(jīng)梅毒患者的腦脊液，PCR檢測(cè)28例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為56%，腦脊液PCR檢測(cè)陽(yáng)性可輔助診斷神經(jīng)梅毒。

4.5 胎傳梅毒：我國(guó)梅毒診療指南指出，暗視野顯微鏡檢查，或鍍銀染色在早期胎傳梅毒皮膚、黏膜損害及組織標(biāo)本中查到螺旋體，或Tp核酸檢測(cè)陽(yáng)性可確診為胎傳梅毒［4］。Michelow 等［27］研究 76 例未接受抗生素治療的梅毒孕婦分娩的胎兒，17例腦脊液PCR檢查螺旋體陽(yáng)性，其中15例胎兒體檢符合胎傳梅毒的診斷。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光PCR為梅毒PCR檢測(cè)的主要方法，PCR擴(kuò)增的靶基因主要有tpp47和polA。梅毒PCR檢測(cè)主要適用于一期梅毒的潰瘍拭子，其他各期梅毒標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性率較低，用于輔助診斷梅毒。

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Detection ofTreponema pallidumwith PCR

Xue Yaohua*,Yang Bin,Zheng Heping.
*Department of Clinical Laboratory,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China

The diagnosis of syphilis is mainly based on clinical manifestations,serological analysis,and dark-field microscopy for detection ofTreponema pallidum.With further clarification of the genomic sequence ofTreponema pallidum,several PCR methods based onTreponema pallidum-specific gene sequences have been developed during the last 20 years.Classical PCR,nested-PCR,reverse transcription-PCR,multiplex PCR and real-time fluorescent PCR can be used to amplifyTreponema pallidumDNA in different types of clinical specimens,including lesion swabs,blood,cerebrospinal fluid,biopsy tissue,amniotic fluid,and so on.The target genes for PCR amplification include tpp47,polA,bmp,tmpA,arp and tpr,with tpp47 and polA as the most common target genes.

Syphilis;Treponema pallidum;Polymerase chain reaction;Gene amplification;Targeted gene

Zheng Heping,Email:zhhpf@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2015.06.018

廣東省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目（2011B031800225）

鄭和平，Email:zhhpf@hotmail.com

2014-12-02）