湖北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科 (湖北 武漢，430061)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)，每年約有100 萬(wàn)人死于肝癌、肝硬化或肝功能衰竭，在我國(guó)肝癌、肝硬化或肝功能衰竭多與乙型肝炎病毒感染有關(guān)，目前我國(guó)約有3.5 億HBV 攜帶者。乙型肝炎病程的發(fā)展與HBV 的持續(xù)高載量密切相關(guān)，一旦肝功能發(fā)生失代償，由于并發(fā)癥的發(fā)生，5年的死亡率高達(dá)85%。研究表明，抑制HBV 的復(fù)制是控制疾病進(jìn)程的關(guān)鍵所在。但是，使用核苷類似物控制HBV 復(fù)制面臨一個(gè)嚴(yán)峻的問(wèn)題，即核苷類似物的耐藥性［1，2］，核苷類似物的長(zhǎng)期使用導(dǎo)致患者體內(nèi)不同程度的出現(xiàn)病毒耐藥突變。

本研究采用巢式PCR 結(jié)合測(cè)序的方式檢測(cè)了115例我院門診、住院的慢性乙型肝炎(CHB)患者的耐藥突變形式，對(duì)核苷類似物耐藥位點(diǎn)特點(diǎn)進(jìn)行了分析，為評(píng)價(jià)藥物治療效果和合理用藥提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取115例2011年11月至2014年7月在湖北省中醫(yī)院進(jìn)行HBV 耐藥位點(diǎn)檢測(cè)的CHB 患者，診斷符合《病毒性肝炎防治方案》中CHB 的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，男63例，女52例，年齡在23～72歲。所有患者最短用藥時(shí)間為1年，最長(zhǎng)為4年。其中59例患者曾接受過(guò)拉米夫定或阿德福韋酯聯(lián)合拉米夫定口服治療6個(gè)月以上，定為拉米夫定組;另外56例患者中，12例使用阿德福韋、21例使用恩替卡韋、23例使用恩替卡韋、替比夫定、替諾福韋酯聯(lián)合治療，定為對(duì)照組。

1.2 主要儀器和試劑 乙肝病毒提取、檢測(cè)試劑盒(上海復(fù)興科技有限公司)，KOD Dash、Buffer 及配套dNTPs(武漢大風(fēng)生物科技有限公司)，普通PCR 儀(Bio-rad C1000 PCR 儀)，熒光定量PCR 儀(ABI-7500 型)，巢式PCR 引物委托上海生工生物有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 巢式PCR 引物的設(shè)計(jì) 依據(jù)HBV 的基因組情況結(jié)合以往的研究成果，以P 基因的逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域?yàn)榘行蛄性O(shè)計(jì)巢式PCR 的引物對(duì)，并包含目前已知的所有HBV 耐藥位點(diǎn)。通過(guò)訪問(wèn)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生圖書館生物技術(shù)信息中心(NCBI)的官方網(wǎng)站核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank 網(wǎng)頁(yè)，下載相應(yīng)序列，采用Beacon Designer 7.0 軟件設(shè)計(jì)引物，并使用NCBI 網(wǎng)站的對(duì)比基本檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)進(jìn)行驗(yàn)證，比對(duì)查看有無(wú)與其他病毒基因同源的情況。第一輪PCR 上、下游引物分別為AATCCTCACAATACCACAGAGTC 和TTGTATACATGCATATAAAGGCAT，第二輪PCR 上、下游引物分別為TCTCTCAATTTTCTAGGGGGA 和TTGACATACTTTCCAATCAATAGG。

1.3.2 HBV DNA 的提取和擴(kuò)增 采集患者血清，所有血清均進(jìn)行乙肝病毒載量檢測(cè)，選取其中HBV DNA 陽(yáng)性(即病毒載量103～108copies/mL)者進(jìn)行巢式PCR，檢測(cè)其耐藥位點(diǎn)形式。按試劑盒要求的步驟從血清中提取HBV DNA，用1.3.1 中設(shè)計(jì)的巢式PCR 引物進(jìn)行擴(kuò)增，50μl 反應(yīng)體系為:DEPC 水37.5μl、KOD Buffer 5μl、上游引物1μl、下游引物1μl、KOD DASH 0.5μl、DNA 模板5μl。擴(kuò)增條件為:第一輪94℃6min;94℃30s，53℃5s，74℃27s，40個(gè)循環(huán);74℃6min。第二輪94℃6min;94℃30s，54℃5s，74℃21s，40個(gè)循環(huán);74℃6min。擴(kuò)增完畢后，產(chǎn)物送測(cè)序公司進(jìn)行基因測(cè)序。

1.3.3 HBV 耐藥位點(diǎn)及基因分型分析 采用目前公認(rèn)的P 基因RT 區(qū)的8個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行耐藥分析，分別為rt173、rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt236、rt250。用MEGA3.1 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，在MEGA3.1 中與HBV 標(biāo)準(zhǔn)序列片段進(jìn)行比對(duì)，依次對(duì)上述8個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸分析，如測(cè)序圖中有一位點(diǎn)存在雙峰，且低峰高度為高峰的25%，則認(rèn)為存在套峰共存的現(xiàn)象，該位點(diǎn)發(fā)生突變。利用NCBI 的基因分型網(wǎng)頁(yè)進(jìn)行HBV 基因分型分析。進(jìn)入網(wǎng)頁(yè)，將測(cè)序結(jié)果輸入，并在選擇框中選擇HBV 分型，即得到分型結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 HBV DNA 檢測(cè) 在115例血清中，100例血清的HBV DNA 載量為陽(yáng)性，巢式PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳均得到與目的片段相同大小的條帶，測(cè)序結(jié)果與GenBank 上比對(duì)確證為HBV DNA 序列。測(cè)序結(jié)果如圖1。

圖1 HBV 野生型測(cè)序圖

2.2 HBV 基因分型分析 對(duì)100例HBV DNA 陽(yáng)性血清的HBV 基因分型結(jié)果顯示，CHB 患者HBV B 基因型有76例，占76%;C 基因型有29例，占29%;D 基因型占1例，占1%;其中B、C 共感染的患者有5例，占5%。結(jié)果顯示武漢地區(qū)CHB 患者，基因型主要為B 型(76%)和C 型(29%)，兼有少量D 型和B、C 共感染的患者。

2.3 HBV 耐藥位點(diǎn)分析 100例HBV DNA 陽(yáng)性血清中有48例發(fā)生耐藥位點(diǎn)突變，將發(fā)生耐藥的48例血清定為耐藥組，未發(fā)生耐藥的血清定為非耐藥組。耐藥組耐藥位點(diǎn)分布見(jiàn)表1。耐藥組HBV 基因分型結(jié)果顯示，HBV B 型占27例(56.3%)，C型占21例(43.7%)，經(jīng)卡方檢驗(yàn)?zāi)退幫蛔兊腍BV 基因分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

表1 耐藥組患者HBV 耐藥位點(diǎn)分布

2.4 兩組患者耐藥突變位點(diǎn)分析 研究表明，CHB 患者長(zhǎng)期應(yīng)用拉米夫定治療會(huì)引起rt204 位點(diǎn)的YMDD 突變，因此以rt204 位點(diǎn)的突變情況檢測(cè)拉米夫定的耐藥突變特點(diǎn)。拉米夫定組59例血清中，28例發(fā)生rt204 位點(diǎn)的YVDD 或YIDD 突變，對(duì)照組56例血清中，7例發(fā)生rt204 位點(diǎn)突變，經(jīng)卡方檢驗(yàn)兩組發(fā)生突變的概率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.5 耐藥株檢出與患者病情關(guān)系 對(duì)48例耐藥者和67例非耐藥者血清分別檢測(cè)HBV DNA 病毒載量和ALT，結(jié)果顯示，當(dāng)HBV 病毒在患者體內(nèi)發(fā)生耐藥時(shí)，其ALT 和HBV DNA 定量均與非耐藥患者有明顯差異(P＜0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 耐藥者與非耐藥者HBV DNA 和ALT 檢測(cè)結(jié)果比較()

表2 耐藥者與非耐藥者HBV DNA 和ALT 檢測(cè)結(jié)果比較()

與非耐藥組比較，△P＜0.01

3 討論

目前，用于乙型肝炎抗病毒治療的藥物一般有兩類，一類是干擾素(IFN)，一類是核苷類似物(NUCs)，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局準(zhǔn)許臨床治療應(yīng)用的核苷類似物包括拉米夫定(lamivudine)、阿德福韋(adefovir)、恩替卡韋(entecavir)和替比夫定(telbivudine)［4］。核苷類似物在臨床治療應(yīng)用中為抗病毒首選藥物，其治療目的是抑制HBV 復(fù)制并最終阻止或延緩慢性乙型肝炎并發(fā)癥的發(fā)生，但由于持久共價(jià)環(huán)狀DNA(cccDNA)的存在并能夠整合到受體肝細(xì)胞基因組中，因此，徹底根除HBV 感染是不可行的?，F(xiàn)階段的核苷類似物對(duì)病毒的抑制作用是通過(guò)影響反轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)及DNA 的延伸［5］，使病毒的復(fù)制受到抑制而發(fā)揮效用。近些年來(lái)，CHB 的治療從短期應(yīng)用干擾素到短期應(yīng)用核苷類似物再到今天長(zhǎng)期應(yīng)用核苷類似物的治療，充分說(shuō)明了核苷類似物的良好治療效果，尤其是恩替卡韋、替比夫定有著良好的治療效果和較高的耐藥屏障。

拉米夫定是第一個(gè)用于治療CHB 的核苷類似物，具有較低的耐藥屏障，長(zhǎng)期服用可導(dǎo)致患者204 位點(diǎn)產(chǎn)生YMDD 突變，有研究顯示拉米夫定的5年耐藥率為65%［6～8］。阿德福韋酯相比拉米夫定而言有更好的耐藥屏障，但大劑量的阿德福韋酯會(huì)加重腎臟毒性。恩替卡韋有較強(qiáng)的抗病毒作用，但血清轉(zhuǎn)換率較低，研究表明它對(duì)治療拉米夫定耐藥患者是最佳選擇。替比夫定作為一種新的有效替代藥物，其耐藥屏障明顯優(yōu)于拉米夫定，并在抗病毒療效和ALT 正?；寞熜黠@優(yōu)于拉米夫定。

有研究表明HBV DNA 的載量越高，發(fā)生耐藥的概率越大，本研究中耐藥組的轉(zhuǎn)氨酶和病毒載量均明顯高于非耐藥組，進(jìn)一步證實(shí)了耐藥的發(fā)生與患者病情的相關(guān)性。耐藥發(fā)生率最高的是拉米夫定(65%～70%，4～5年)［9］，一般而言拉米夫定耐藥可選擇繼續(xù)并聯(lián)合阿德福韋或替諾福韋，在耐藥的處理方面最困難的是多重耐藥的出現(xiàn)［10］，本研究中發(fā)現(xiàn)了幾種多重耐藥模式可供參考:①rt204V，rt180M/I;②rt250V/I，rt236T;③rt204V，rt202G，rt184I;一般認(rèn)為rt204V，rt180M/I 是典型的恩替卡韋耐藥，rt250V/I，rt236T 是典型的阿德福韋耐藥。在此基礎(chǔ)上還出現(xiàn)了兩例rt250V/L，rt204I，rt180M 和rt204V，rt202G，rt184I 新的突變組合。這種新的突變模式是否也會(huì)引起恩替卡韋耐藥或其他耐藥還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究對(duì)115例耐藥位點(diǎn)檢測(cè)患者的HBV RT 耐藥位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，使用拉米夫定治療的患者中HBV 耐藥發(fā)生概率較高，多重耐藥位點(diǎn)比率較高。為醫(yī)生制定抗病毒治療方案提供了依據(jù)，更有利于指導(dǎo)用藥，減少多重耐藥突變的發(fā)生。

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