李華成 王建剛 費新應△ 汪建平

1.黃石市中醫(yī)醫(yī)院(傳染病醫(yī)院)肝病科 (湖北 黃石，435100) 2.湖北中醫(yī)藥大學(湖北 武漢，430065) 3.華中科技大學同濟醫(yī)學院藥學院 (湖北 武漢，430030)

原發(fā)性肝癌(簡稱肝癌)是一種惡性程度高、進展快、預后差的惡性腫瘤，其全球發(fā)病率和死亡率分別列所有腫瘤的第7位和第4 位［1］。我國是乙型肝炎高發(fā)區(qū)，肝癌發(fā)病率占全球總數(shù)的55%，近80%患者確診時已屬中晚期，5年以上長期生存率僅為10%左右［2］。我們運用膈下逐瘀湯加減方(以下簡稱GXZY)治療肝癌，發(fā)現(xiàn)能夠提高患者的生存率，可以改善患者生活質(zhì)量，且沒有明顯的毒副作用［3］。前期實驗研究顯示膈下逐瘀湯加減方對肝癌H22荷瘤小鼠有明顯抑制作用［4］，并可以抑制人肝癌細胞SMMC-7721 的增殖，誘導SMMC-7721 細胞凋亡，抑制SMMC-7721 細胞端粒酶活性，調(diào)控癌基因活化與抑癌基因失活，阻止腫瘤細胞的無限繁殖［5，6］。本研究從蛋白質(zhì)組學的水平探討膈下逐瘀湯加減方對肝癌的作用機制，尋找其藥效作用的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與細胞 健康SD 大鼠20 只，SPF 級，雌雄各半，體質(zhì)量(250 ±20.9)g，購自華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心，實驗動物質(zhì)量合格證編號:No.42009800000170-42009800 000172;人肝癌細胞株SMMC-7721 購自中國科學院細胞庫。

1.1.2 實驗用藥 GXZY 由五靈脂、桃仁、赤芍、紅花各6g，當歸、川芎、丹皮、玄胡、甘草各10g，龍葵、茯苓各20g，蜈蚣3g，薏苡仁30g 組成。GXZY 湯制備及提取流程:加水煎煮，濃縮得藥液，濃度為3g/ml，置冰箱中備用。

1.1.3 主要試劑及儀器 固相pH 梯度IPG 干膠條(pH 4～7，24 cm Bio-Rad 公司，美國);除白蛋白和球蛋白試劑盒(Merck，美國公司);蛋白沉淀試劑盒(Merck，美國公司);HRP 標記的山羊抗兔IgG(KPL 公司);ABC 免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒(武漢博士德公司);ECL 化學發(fā)光系統(tǒng)(碧云天生物技術(shù)研究所);Cocktail 蛋白酶抑制劑(Roche 公司);ReverTra Ace 定量PCR 試劑盒(TOYOBO 公司，日本);Trizol Reagent RNA 提取試劑盒、PCR 引物(Invitrogen 公司，美國);IPGphor 等電聚焦儀、垂直電泳槽(GE Healthcare 公司，美國);JY96-Ⅱ超聲儀(寧波新芝公司);超凈工作臺(蘇州蘇凈安泰);Ultraflex ⅢTOF/TOF 質(zhì)譜儀(Bruker Dalton，德國);UMAX Powerlook 1100 掃描儀(力捷，臺灣);ImageMaster 2D platinum 5.0 圖像分析軟件(GE 公司，美國)

1.2 方法

1.2.1 動物模型及藥物血清制備 將20 只SD 大鼠隨機分為空白對照組、GXZY 血清組(各10 只)。空白對照大鼠每日灌胃生理鹽水5ml/只，GXZY 組大鼠每日灌胃10ml/kg GXZY 藥液，均連續(xù)灌胃3d。于第3d 最后一次灌胃后1h(灌胃前12h 禁食)股動脈采血，3 000rpm，20min 離心，合并同組動物血清，用0.221μm微孔濾膜過濾除菌，于56℃、30min 水浴滅活，并用完全培養(yǎng)液配成10%的GXZY 血清培養(yǎng)液以及無藥血清培養(yǎng)液，4℃保存，兩周內(nèi)使用。

1.2.2 細胞培養(yǎng)條件與處理 人肝癌細胞株SMMC-7721 接種于含10%小牛血清、100U/ml 青霉素和100μg/ml 鏈霉素的RPMI-1640 完全培養(yǎng)液中，在37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，并用0.25%胰蛋白酶消化傳代，接種于6 孔培養(yǎng)板，每孔5×105個細胞，每組均設為6個平行孔。培養(yǎng)24h 至細胞生長旺盛后，去培養(yǎng)液，隨機分為兩組，GXZY 血清組(加入GXZY 含藥血清培養(yǎng)液)、空白對照組(加入無藥血清培養(yǎng)液)，繼續(xù)培養(yǎng)48h 后結(jié)束。

1.2.3 細胞蛋白質(zhì)樣品制備 按除白蛋白和球蛋白試劑盒的說明書進行高豐度蛋白去除，預處理后的樣品采用Bradford 蛋白定量方法進行蛋白定量。

1.2.4 雙向凝膠電泳(2-DE)和圖像分析 按Bio-Rad 公司雙向凝膠電泳手冊進行。第一向固相pH 梯度等電聚焦，膠條經(jīng)兩步平衡后轉(zhuǎn)移至12.5%的均勻膠上進行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，運用ImageMaster 2D platinum 5.0 圖像分析軟件進行電泳圖分析。

1.2.5 MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜分析 將差異表達的蛋白質(zhì)點從膠上切下，經(jīng)脫色、真空離心干燥、Trypsin 酶切萃取兩次，將萃取液冷凍真空抽干后以3μl 50% ACN/0.5% TFA 水溶液復溶，加入過飽和基質(zhì)溶液3 μl，混勻后取2 μl 點樣于不銹鋼靶板上，空氣自然干燥后備用。利用Bruker Dalton Ultraflex III TOF/TOF 質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。UV 波長為355nm，重復速率為200HZ，加速電壓為20000V，最優(yōu)質(zhì)量分辨率為1500Da。掃描質(zhì)量范圍為700～3200Da，收集信號。胰酶自切峰為內(nèi)標校正質(zhì)譜儀。所有實驗樣品的質(zhì)譜圖均以默認模式獲得。利用軟件Bruker Dalton flexAnalysis 過濾基線峰、識別信號峰，Bruker Dalton BioTools 軟件搜索NCBI 數(shù)據(jù)庫，尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)，同時查詢其功能，來明確鑒定的蛋白質(zhì)為何種蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 2-DE 圖譜結(jié)果分析 GXZY 含藥血清組和空白對照組2-DE 圖譜經(jīng)過ImageMaster 2D platinum 5.0 軟件分析，獲得兩組間差異表達的蛋白質(zhì)點66個，其中GXZY 血清組的蛋白電泳圖譜上有33個蛋白質(zhì)點高表達，空白對照組的蛋白電泳圖譜上有33個蛋白質(zhì)點高表達。其中部分差異表達明顯的蛋白質(zhì)點2-DE 放大圖譜結(jié)果見圖1。

圖1 部分差異表達蛋白質(zhì)點2-DE 圖譜放大結(jié)果(圖1 中1～6 處的蛋白質(zhì)名稱見表1)

表1 差異蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

2.2 差異表達蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜鑒定 根據(jù)圖像分析，選取10個差異表達顯著的蛋白質(zhì)點經(jīng)膠內(nèi)酶解后進行MALDI-TOF-MS分析，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜，利用BioTools 軟件搜索NCBI 數(shù)據(jù)庫，結(jié)果顯示有6個蛋白質(zhì)點得到鑒定，其中與空白對照組比較，GXZY 血清組有5個蛋白質(zhì)點表達下調(diào)，1個蛋白質(zhì)點表達上調(diào)。差異表達蛋白質(zhì)點質(zhì)譜鑒定結(jié)果見表1。

3 討論

中藥復方具有多靶點、多途徑、多層次作用的特點，傳統(tǒng)研究方法不能從整體水平研究中藥復方的治療機制。蛋白質(zhì)組學的誕生與發(fā)展，可以在整體水平上發(fā)掘肝癌發(fā)病機制、早期診斷、預后判斷的蛋白標志物，并尋求潛在藥物作用靶點，在肝癌臨床診斷和治療方面有十分誘人的前景［7］。隨著高分辨率的2-DE 分離及質(zhì)譜分析等蛋白質(zhì)研究技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學的差異蛋白質(zhì)組分析成為篩選中藥作用靶點的一種有效手段，已大量應用于中藥新藥研究［8］。

PGAM1 即磷酸甘油酸變位酶1，是糖酵解過程重要的酶之一，主要催化3-磷酸甘油酸生成2-磷酸甘油酸的過程。腫瘤細胞內(nèi)糖酵解過程較正常細胞活躍，在這過程中涉及的多種酶常表達異常。Ren F［9］等對肝細胞癌組織及肝正常組織研究發(fā)現(xiàn)，PGAM1 在66.7%的肝細胞癌組織中被發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對照組細胞中PGAM1 表達顯著上調(diào)，而經(jīng)GXZY 藥物血清處理的細胞表達下調(diào)，提示GXZY 可能抑制肝癌細胞能量代謝過程，阻止癌細胞生長。

STMN1，也稱癌蛋白18，是一種普遍存在，高度保守，分子量為19kD 的胞質(zhì)磷蛋白。多種惡性腫瘤中STMN1 都有高水平表達。甘淋等［10］研究發(fā)現(xiàn)stathmin 的表達下調(diào)可抑制肝癌細胞HCCLM3 的增殖，誘導其凋亡，以及抑制其黏附、運動和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，GXZY 血清組細胞STMN1 表達下調(diào)，提示該蛋白可能為GXZY 的作用靶點。

Tropomyosin(TPM)，即原肌球蛋白，是肌肉收縮過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，在骨骼肌和平滑肌細肌絲中，與肌動蛋白雙螺旋并行存在，可影響并調(diào)控肌動球蛋白之間的相互作用［11］。TPM 在調(diào)節(jié)細胞能動性，細胞移動和誘導內(nèi)皮細胞凋亡等方面起著重要作用，參與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程［12］。原肌球蛋白4(TPM4)是已經(jīng)確認的4 種基因(TPM1，TPM2，TPM3 和TPM4)編碼的蛋白質(zhì)家族中的一個［13］。眾多惡性腫瘤包括卵巢癌、前列腺癌、口腔立方上皮癌等，以及非小細胞肺癌、結(jié)腸癌，TPM均表達下降［14］。本研究結(jié)果中，GXZY 血清組細胞TPM4 呈表達上調(diào)，提示該蛋白可能為GXZY 的作用靶點。

熱休克蛋白90(HSP90)是維持細胞內(nèi)蛋白構(gòu)象穩(wěn)定與功能正常所必需的分子伴侶，有HSPα、HSPβ 兩種亞型。許多信號轉(zhuǎn)導蛋白的正常功能發(fā)揮都依賴于HSP90。正常細胞中HSP90 是受細胞周期調(diào)控的，但在腫瘤細胞中，HSP90 呈現(xiàn)持續(xù)的高誘導表達，在調(diào)節(jié)腫瘤細胞周期、增殖、分化等方面有著重要作用，成為抗癌藥物作用的靶點［15，16］。本研究結(jié)果中GXZY血清組細胞HSP90β 呈表達下調(diào)，提示該蛋白可能為GXZY 的作用靶點。

突觸囊泡膜蛋白同源蛋白(VAT1)在胚胎發(fā)育中依次在三叉神經(jīng)簇、后腦、神經(jīng)管和松果體中表達，在受精后24h 可在發(fā)育腸管中檢測到。在發(fā)育最后階段在神經(jīng)管中的表達缺失，而仍可在大腦、視網(wǎng)膜和咽腔中檢測到。腺苷高半胱氨酸水解酶(AHCY)是已知唯一的催化腺苷高半胱氨酸(SAH)分解為同型半胱氨酸(高半胱氨酸，Hey)和腺苷的酶。具有調(diào)節(jié)細胞內(nèi)甲基循環(huán)代謝的重要作用，其酶的活性功能與細胞中磷脂、蛋白質(zhì)、DNA、RNA 和其他小分子的甲基化作用密切相關(guān)，一旦酶活性下降或者被抑制，細胞本身的磷脂、蛋白質(zhì)和核酸等的代謝就會受到影響，進而影響細胞生命的正常代謝［17］。陳寧［18］曾研究發(fā)現(xiàn)VAT-1 在高轉(zhuǎn)移肝癌細胞中表達上調(diào)。這兩種蛋白質(zhì)目前國內(nèi)研究報道較少，本研究結(jié)果顯示他們在空白對照組細胞中表達上調(diào)，而在GXZY 藥物血清組表達下調(diào)，提示它們可能是肝癌新的標記蛋白及GXZY 的作用靶點。

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