程愛(ài)芳　鄧政東　黃芳一　陳文　周念波

摘要：采用DNS比色法，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)多黏芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）HD-1產(chǎn)β-甘露聚糖酶的培養(yǎng)基主要成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，該菌種產(chǎn)β-甘露聚糖酶的最適培養(yǎng)基為魔芋粉0.75%、酵母膏1.00%、磷酸二氫鉀0.04%、硫酸鎂0.05%，培養(yǎng)基初始pH 9.0；最適培養(yǎng)條件為接種量6%，培養(yǎng)溫度31 ℃，培養(yǎng)時(shí)間27 h。在此優(yōu)化條件下，多黏芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶活性可達(dá)72.6 U/mL。

關(guān)鍵詞：多黏芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）；β-甘露聚糖酶；發(fā)酵條件；優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.97 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）01-0164-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.01.042

β-甘露聚糖酶是一種半纖維素水解酶，降解產(chǎn)物的非還原末端為甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等[1-3]。β-甘露聚糖酶可以用于飼料工業(yè)，能消除甘露聚糖對(duì)單胃動(dòng)物各種營(yíng)養(yǎng)素的抗?fàn)I養(yǎng)作用[4-6]，還可用于糖鏈結(jié)構(gòu)的分析、造紙業(yè)、紡織業(yè)、石油業(yè)等。微生物是產(chǎn)生β-甘露聚糖酶的主要來(lái)源，且具有活力高、成本低、來(lái)源穩(wěn)定、提取方便等明顯優(yōu)點(diǎn)[7，8]。本試驗(yàn)以多黏芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）為生產(chǎn)菌株，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)[9，10]對(duì)多黏芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高其產(chǎn)酶活力，為后續(xù)的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 多黏芽孢桿菌突變菌株HD-1，由武漢生物工程學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面活化培養(yǎng)基：3 g/L牛肉膏、10 g/L蛋白胨、5 g/L氯化鈉、20 g/L瓊脂，pH 7.4；液體種子培養(yǎng)基：5 g/L魔芋粉、10 g/L酵母膏、1g/L硫酸鎂、0.5 g/L磷酸二氫鉀、1 g/L硫酸銨，pH 7.5；基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：5 g/L魔芋粉、10 g/L蛋白胨、0.2 g/L磷酸二氫鉀、0.5 g/L硫酸鎂，pH 8.0。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制備 將保存的多黏芽孢桿菌HD-1接種于斜面活化培養(yǎng)基上，35 ℃活化培養(yǎng)24 h。取一環(huán)活化后的菌種HD-1，接入裝有50 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，200 r/min、35 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。以4 %接種量將液體種子接入盛有50 mL基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，200 r/min、35 ℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)了24 h的發(fā)酵液5 000 r/min冷凍離心5 min，取上清液即為粗酶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 甘露聚糖酶活性的測(cè)定 以酶活為指標(biāo)，以魔芋膠為底物，采用DNS比色法測(cè)定發(fā)酵液中甘露聚糖酶的活性[7]。在上述條件下，每分鐘由底物釋放出相當(dāng)于1 μmol D-甘露糖的還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.3 菌種產(chǎn)酶條件的單因素試驗(yàn) 以基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，研究不同碳源、氮源、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量、發(fā)酵時(shí)間對(duì)多黏芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，取對(duì)培養(yǎng)基影響較大的4個(gè)因素魔芋粉、酵母膏、磷酸二氫鉀、硫酸鎂，每因素取3個(gè)水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基。試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

1.2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)條件 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，取對(duì)培養(yǎng)條件影響較大的4個(gè)因素培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH、接種量、發(fā)酵時(shí)間，每因素取3個(gè)水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)條件。試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 選取6種碳源進(jìn)行多黏芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的培養(yǎng)，結(jié)果如圖1所示，多黏芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的最適碳源為魔芋粉。在確定魔芋粉為最適碳源后，對(duì)其用量進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示，魔芋粉的用量在0.25%至1.00%時(shí)，β-甘露聚糖酶活力較高，0.75%時(shí)達(dá)到最高，超過(guò)1.00%后，酶活力迅速下降，因?yàn)槟в竽z為粘多糖，濃度太高影響培養(yǎng)基的流動(dòng)性和溶氧量，不利于產(chǎn)酶。

2.1.2 不同氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 選取6種氮源進(jìn)行多黏芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的培養(yǎng)，結(jié)果如圖3所示，多黏芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的最適氮源為酵母膏。在確定酵母膏為最適氮源后，對(duì)其用量進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示，酵母膏用量在0.25%至1.00%時(shí)，β-甘露聚糖酶活力不斷升高，1.00%時(shí)達(dá)到最高，超過(guò)1.00%后，酶活迅速下降。

2.1.3 培養(yǎng)基初始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 不同菌株發(fā)酵的最適培養(yǎng)基初始pH相差較大，本試驗(yàn)設(shè)定8個(gè)pH梯度進(jìn)行多黏芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的培養(yǎng)，結(jié)果如圖5所示，多黏芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的最適初始pH為9.0。

2.1.4 裝液量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 裝液量的多少影響發(fā)酵過(guò)程中的通氣及溶氧情況從而影響產(chǎn)酶。不同裝液量對(duì)多黏芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，多黏芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的搖瓶發(fā)酵最適裝液量為50 mL/250 mL。

2.1.5 接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果如圖7所示，多黏芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的最適接種量為6%，因?yàn)檫^(guò)大的接種量引起短時(shí)間內(nèi)菌體大量生長(zhǎng)繁殖，從而使溶氧不足，不利于產(chǎn)酶。

2.1.6 培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 溫度對(duì)多黏芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響結(jié)果如圖8所示，多黏芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的最適培養(yǎng)溫度為33 ℃，超過(guò)33 ℃菌體提前衰老，酶活迅速下降。endprint

2.1.7 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)多黏芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響結(jié)果如圖9所示，多黏芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的最適搖床轉(zhuǎn)速為240 r/min。轉(zhuǎn)速太小，影響通氣量，不利于產(chǎn)酶；轉(zhuǎn)速太大，氣體停留時(shí)間縮短從而使得溶氧量減低，同時(shí)剪切力過(guò)大，不利于產(chǎn)酶。

2.1.8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多黏芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響結(jié)果如圖10所示，多黏芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的最適發(fā)酵時(shí)間為30～48 h。發(fā)酵時(shí)間過(guò)短，微生物沒(méi)有充分生長(zhǎng)，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，微生物發(fā)生自溶，均不利于產(chǎn)酶。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)基成分正交試驗(yàn)結(jié)果 由表3可知，影響多黏芽孢桿菌HD-1產(chǎn)β-甘露聚糖酶的培養(yǎng)基成分因素由大到小順序?yàn)锳、B、C、D，優(yōu)化組合為A2B2C3D1，即魔芋粉0.75%、酵母膏1.00%、磷酸二氫鉀0.04%、硫酸鎂0.05%。

2.2.2 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果 由表4可知，影響多黏芽孢桿菌HD-1產(chǎn)β-甘露聚糖酶的培養(yǎng)條件因素由大到小順序?yàn)镠、E、G、F，最優(yōu)組合為E1F3G2H2，即培養(yǎng)溫度31 ℃、初始pH 9.0、接種量6%、發(fā)酵時(shí)間27 h。

3 小結(jié)

通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)多黏芽孢桿菌HD-1的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到其產(chǎn)β-甘露聚糖酶的最優(yōu)發(fā)酵條件為魔芋粉0.75%、酵母膏1.00%、磷酸二氫鉀0.04%、硫酸鎂0.05%、培養(yǎng)基初始pH 9.0，培養(yǎng)溫度31 ℃、接種量6%、發(fā)酵時(shí)間27 h。在此條件下，β-甘露聚糖酶活力可達(dá)72.6 U/mL。另外，從2個(gè)正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，魔芋粉用量、酵母膏用量、培養(yǎng)溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶影響較大，嚴(yán)格控制有利于產(chǎn)酶。

參考文獻(xiàn)：

[1] 殷瑩瑩，謝達(dá)平，戴曉陽(yáng).β-甘露聚糖酶高產(chǎn)基因工程菌株發(fā)酵條件優(yōu)化[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（4）：5-10.

[2] 段 蕾，高潤(rùn)池，許 波.β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌的分離、鑒定及酶學(xué)特性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（24）：10311-10314.

[3] 崔福綿，石家驥，魯茁壯.枯草芽孢桿菌中性β-甘露聚糖酶的產(chǎn)生及性質(zhì)[J].微生物學(xué)報(bào)，1999，39（1）：60-63.

[4] 喬欣君，鄒曉庭.β-甘露聚糖酶的營(yíng)養(yǎng)功能及在動(dòng)植物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].飼料研究，2006（2）：53-55.

[5] 徐紅蕊.β-甘露聚糖酶之國(guó)內(nèi)外最新研究概況[J].湖南飼料，2008（2）：30-32.

[6] 趙德立.多粘芽孢桿菌JW2725抗菌活性物質(zhì)及其發(fā)酵條件的初步研究[J].植物保護(hù)，2006，32（1）：47-50.

[7] 李桂伶.芽孢桿菌所產(chǎn)β-甘露聚糖酶性質(zhì)研究[J].飼料廣角，2009（1）：28-30.

[8] 張道敬.多粘類(lèi)芽孢桿菌HY9622的化學(xué)成分[J].華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，34（1）：71-73.

[9] 王旭愿，張 敏，李成濤，等.洋蔥假單胞菌產(chǎn)脂肪酶條件的優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（1）：184-187.

[10] 馬 勇，陳秀莉，劉曉光.一株產(chǎn)油酵母菌搖瓶產(chǎn)油發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（1）：25-27.endprint