余波+周思旋+譚詩(shī)文+徐景峨+史開志+楊莉

摘要：根據(jù)GenBank中豬細(xì)小病毒VP2基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物，PCR擴(kuò)增獲得豬細(xì)小病毒VP2基因片段，并克隆到pMD-18T載體上作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。通過對(duì)SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了豬細(xì)小病毒的SYBR Green I熒光定量PCR診斷方法，以此為基礎(chǔ)研制出試劑盒。試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析只出現(xiàn)1個(gè)單特異峰，無(wú)引物二聚體，對(duì)PRV、PCV-2、E.coli、CSFV、PRRSV均無(wú)陽(yáng)性信號(hào)擴(kuò)增，可重復(fù)性好，測(cè)靈敏度可達(dá)1.0×101拷貝/μL。結(jié)果表明，研制的豬細(xì)小病毒SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒具有特異、靈敏、快速、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，適合于豬細(xì)小病毒臨床樣品的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：豬細(xì)小病毒；VP2基因；SYBR Green I熒光定量

中圖分類號(hào)：S852.65+9.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）01-0126-04

豬細(xì)小病毒（Poreine parvovirus，PPV）是引起母豬繁殖障礙性疾病的主要病原體之一，可導(dǎo)致母豬流產(chǎn)、死胎，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。目前，對(duì)該病的診斷方法包括傳統(tǒng)的病毒分離鑒定，以及血清學(xué)診斷方法，如ELISA、膠體金等。常規(guī)的PCR主要用于病死豬組織樣本的檢測(cè)，然而PPV常呈長(zhǎng)期低劑量隱性感染，常規(guī)的PCR不僅無(wú)法對(duì)血清樣本中的病毒進(jìn)行定量檢測(cè)，而且擴(kuò)增反應(yīng)后需要電泳檢測(cè)，操作繁瑣。熒光定量PCR是與常規(guī)PCR比較，具有重復(fù)性好、靈敏度高、能夠定量等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種疾病病原的檢測(cè)[4，5]。本研究根據(jù)GenBank中豬細(xì)小病毒VP2基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得豬細(xì)小病毒VP2基因片段，并克隆到pMD-18T載體上作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。通過對(duì)SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，研制出豬細(xì)小病毒的SYBR Green I熒光定量PCR診斷試劑盒，為豬細(xì)小病毒臨床樣品的檢測(cè)提供科學(xué)的診斷方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株：PPV強(qiáng)毒株7909、PRV閩-1株、PCV-2、CSFV、PRRSV、豬源大腸桿菌由貴州省畜禽疫病研究實(shí)驗(yàn)室保存。

主要試劑及儀器：Goldview、Tris、EDTA、DL2000、Taq DNA Polymerase（5U/μL）及相應(yīng)10×Taq Buffer、dNTP、DH5α，pMD-18T、SYBR Green I熒光定量PCR酶等購(gòu)自寶生物（大連）工程有限公司；TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。熒光定量PCR儀為Eppendorf Mastercycler ep realplex 4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中豬細(xì)小病毒VP2基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，上游引物：5′-GGGAGGGCTTGG

TTAGAATC-3′，下游引物：5′-TTGTTTGCCATGAGTGAGTT-3′，引物由寶生物（大連）工程有限公司合成。

1.2.2 病毒核酸的提取

1）組織樣品：取待檢樣品淋巴結(jié)組織樣品共約0.5 g，加入500 μL PBS緩沖液，待檢樣品研磨后 -70 ℃反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心取上清液用于核酸的提取。病毒DNA/RNA的提取參照TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，將提取的DNA/RNA于-70 ℃保存。豬大腸桿菌參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，將提取的DNA-20 ℃保存。

2）血清樣品：取50 μL血清加入等體積的血清裂解緩沖液[50 μmol/L Tris-HCl（pH 8.0），150 μmol/L NaCl，2 μmol/L EDTA，1%Triton×100，5% SDS]，混勻后煮沸5 min，12 000 r/min離心取上清液2 μL用于熒光定量PCR和普通PCR。

1.2.3 pMD-18T-PPV-VP2陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備 用“1.2.1”中的引物，對(duì)PPV DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，退火溫度55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增的108 bp PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收DNA片段，與pMD-18T-克隆載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，重組體命名為pMD-18T-PPV-VP2，同時(shí)送寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pMD-18T-PPV-VP2在D260 nm/D280 nm處的吸光度，得到重組質(zhì)粒的濃度和純度，進(jìn)行10倍梯度倍比稀釋，作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.4 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 熒光定量PCR反應(yīng)在25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行，對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)條件，包括退火溫度（50、55、60 ℃），引物濃度（5、10、20 μmol/L），進(jìn)行優(yōu)化以確定最佳反應(yīng)條件。上下游引物（5、10、20 μmol/L）各1 μL，Premix Ex-Taq 12.5 μL，ROX Reference Dye 0.5 μL，模板1 μL，用超純水補(bǔ)足至25 μL，同時(shí)以超純水作為空白對(duì)照。反應(yīng)條件為：94 ℃ 10 s；94 ℃ 5 s，退火溫度（50 ℃、55 ℃、60 ℃）10 s，72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.5 熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用紫外分光光度計(jì)測(cè)定測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pMD-18T-PPV-VP2，計(jì)算出重組質(zhì)粒的濃度和純度，計(jì)算DNA拷貝數(shù)，隨后將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣本進(jìn)行連續(xù)10倍系列稀釋，以“1.2.4”的條件進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)稀釋倍數(shù)3個(gè)重復(fù)，以拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。endprint

1.2.6 敏感性試驗(yàn) 將重組質(zhì)粒pMD-18T-PPV-VP2計(jì)算DNA拷貝數(shù)后，進(jìn)行10倍比稀釋后分別進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)稀釋倍數(shù)3個(gè)重復(fù)，以確定建立的熒光定量PCR診斷的敏感性。

1.2.7 特異性試驗(yàn) 以PPV、PCV-2、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，以確定建立的熒光定量PCR診斷方法的特異性。

1.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法重復(fù)檢測(cè)PPV DNA樣品3次，以檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

1.2.9 試劑盒的組裝與保存期檢測(cè) 應(yīng)用建立的熒光定量PCR組裝成試劑盒。試劑盒組成：①熒光定量PCR反應(yīng)混合液；②ROX Reference Dye；③引物；④陰性對(duì)照；⑤陽(yáng)性對(duì)照；⑥去離子水；⑦裂解液。將試劑盒各組份分別保存于室溫、4 ℃和-20 ℃，設(shè)置1周、6個(gè)月、1年3個(gè)時(shí)間梯度，對(duì)陽(yáng)性菌株進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.10 熒光定量PCR試劑盒對(duì)臨床樣品的檢測(cè) 對(duì)2012～2013年貴州省貴陽(yáng)市、黔西南、遵義、黔南州、銅仁地區(qū)幾個(gè)生豬養(yǎng)殖場(chǎng)和養(yǎng)殖專業(yè)戶采集的69份疑似病料，181頭份發(fā)病豬場(chǎng)未發(fā)病豬血清，應(yīng)用研制的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)應(yīng)用文獻(xiàn)[6]中的方法進(jìn)行普通PCR。

2 結(jié)果與分析

2.1 pMD-18T-PPV-VP2陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

用“1.2.1”中的引物，對(duì)PPV DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能有效擴(kuò)增出了目的片段，片段大小為108 bp，無(wú)非特異性片段產(chǎn)生（圖1）。將寶生物（大連）工程有限公司測(cè)序結(jié)果與GenBank中的PPV-VP2基因序列比對(duì)，核苷酸相似度為98.9%～100%。

2.2 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

熒光定量PCR反應(yīng)在25 μL反應(yīng)體系中最佳反應(yīng)條件為：退火溫度55 ℃，引物濃度10 μmol/L，能出現(xiàn)最高的熒光值、最小的Ct值，且在熔解曲線分析中不出現(xiàn)非特異性峰。

2.3 熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將標(biāo)準(zhǔn)樣品10倍倍比稀釋，取1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷貝/μL 6種不同濃度重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到擴(kuò)增反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），線性回歸方程為Ct=-3.141×lg拷貝數(shù)+26.7（R2=0.996）。

2.4 熔解曲線分析

在SYBR Green I熒光定量PCR結(jié)束后對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行熔解曲線分析，結(jié)果見圖3。擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度Tm為78.6～79.0 ℃，沒有引物二聚體和非特異性產(chǎn)物等其他峰值出現(xiàn)。

2.5 敏感性試驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)樣品10倍倍比稀釋，取1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100 拷貝/μL 7種不同濃度重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。由圖4可知，結(jié)果顯示其靈敏度為1.0×101拷貝/μL。

2.6 特異性試驗(yàn)

由圖5可知，以PPV、PCV-2、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，以確定建立的熒光定量PCR診斷方法的特異性，結(jié)果PPV為陽(yáng)性，而PCV-2、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA為陰性。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法重復(fù)檢測(cè)PPV DNA樣品3次，以檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，結(jié)果均一致。

2.8 試劑盒的組裝與保存期檢測(cè)

應(yīng)用建立的熒光定量PCR組裝成試劑盒。試劑盒組成：①熒光定量PCR反應(yīng)混合液（Premix Ex Taq）250 μL；② ROX Reference Dye 20 μL；③引物 40 μL；④陰性對(duì)照 20 μL；⑤陽(yáng)性對(duì)照 20 μL，⑥去離子水500 μL；⑦裂解液 800 μL。將試劑盒保存在4 ℃、-20 ℃分別于1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行檢測(cè)，4 ℃保存1年陽(yáng)性拷貝數(shù)降低99%，-20 ℃保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年對(duì)陽(yáng)性拷貝數(shù)無(wú)影響。

2.9 試劑盒對(duì)臨床樣品的檢測(cè)

對(duì)2012～2013年貴州省貴陽(yáng)市、黔西南、遵義、黔南州、銅仁地區(qū)幾個(gè)生豬養(yǎng)殖場(chǎng)和養(yǎng)殖專業(yè)戶69份疑似病料（組織）的熒光定量PCR陽(yáng)性率為36.2%（25/69），普通PCR陽(yáng)性率為33.3%（23/69）。181頭份發(fā)病豬場(chǎng)未發(fā)病豬血清熒光定量PCR陽(yáng)性率為10.0%（18/181），普通PCR陽(yáng)性率為0%（0/181）。

3 小結(jié)與討論

豬細(xì)小病毒VP2基因是其主要免疫原性蛋白，在決定毒株的組織嗜性和致病性上起重要作用[7-9]。王金良等[10]應(yīng)用豬細(xì)小病毒VP2全基因進(jìn)行原核表達(dá)建立了間接ELISA檢測(cè)方法。趙俊龍等[11]根據(jù)豬細(xì)小病毒VP2基因，建立的豬細(xì)小病毒PCR方法能檢測(cè)出10-4×TCID50的病毒含量。但普通PCR檢測(cè)的靈敏度相對(duì)較低，主要用于組織病料的檢測(cè)，不能有效檢出豬群血清中PPV的隱形感染。李小康等[12]建立基于TaqMan探針的豬細(xì)小病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法的敏感性為100拷貝/μL，可有效檢測(cè)出淋巴結(jié)、肺臟等組織中的PPV，但其未對(duì)感染豬場(chǎng)未發(fā)病豬血清進(jìn)行檢測(cè)。

基于SYBR GreenⅠ的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)則無(wú)需探針，且價(jià)格較TaqMan探針低廉，但熒光染料能和任何雙鏈DNA結(jié)合。因此，它也能與非特異的雙鏈DNA（如引物二聚體）結(jié)合，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)，但可以通過融解曲線分析克服這一缺陷[13]。本研究根據(jù)豬細(xì)小病毒VP2基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得豬細(xì)小病毒VP2基因片段，并克隆到pMD-18T載體上作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。通過對(duì)SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了豬細(xì)小病毒的SYBR Green I熒光定量PCR診斷方法，靈敏度可達(dá)1.0×101拷貝/μL，擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度Tm為78.6～79.0 ℃，沒有引物二聚體和非特異性產(chǎn)物等其他峰值出現(xiàn)，適合于臨床樣品的檢測(cè)。endprint

本研究中69份疑似病死豬病料（組織）中病毒含量量較高，因此熒光定量PCR和普通PCR符合率為92.0%，而發(fā)病豬場(chǎng)未發(fā)病豬血清PPV病毒含量較低，普通PCR未檢測(cè)到血清中的病毒，而研制的試劑盒能檢測(cè)到隱性感染的PPV。因此，本試劑盒可應(yīng)用于PPV早期感染和隱性感染檢測(cè)，有利于豬場(chǎng)PPV的凈化。

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