鄭琳，高世偉

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所，湖北武漢430064)

茶多酚是一類存在于茶樹中的多羥基酚類化合物，具有抗氧化、抗突變、抗癌變［1］、抗衰老等功效，常被用作天然無毒的食品添加劑［2］，安全性好。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)作為茶多酚的一種主要單體成分，具有防突變、抗癌、抗病毒、抗氧化、抑制生物膜、神經(jīng)保護、調(diào)節(jié)代謝、抑菌消炎等功能特性［3］。目前，茶多酚和EGCG都被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、醫(yī)藥、日化等領(lǐng)域。

“道泉雅女茶”產(chǎn)自四川省唯一一個國家級生態(tài)建設(shè)先進縣——洪雅，茶區(qū)山青水碧、峽幽林茂、雅自天成，平均森林覆蓋率達62．7%，空氣中負氧離子的含量更是高達18 000個/cm3，享有“綠海明珠”的美譽。茶葉在呼吸之間納取空氣中的“長壽因子”，積淀為翠潤的色澤和幽雅的香氣。

筆者以道泉雅女茶為原料，研究浸提條件對茶多酚和EGCG浸出量的影響，擬為道泉雅女茶下盤茶的利用提供依據(jù)，同時為茶多酚等茶葉深加工產(chǎn)品的生產(chǎn)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 茶葉原料。四川尚林生物資源開發(fā)有限公司“道泉雅女茶”下盤茶。

1．1．2 主要試劑。硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、乙醇、檸檬酸、異位酸鈉(VC-Na)，均為分析純;冰醋酸、N，N-二甲基甲酰胺、甲醇，均為色譜純;水為重蒸餾水。

1．2 方法

1．2．1 茶多酚的提取。稱取2．0 g茶粉，置于100 ml的錐形瓶中，加入40 ml溫水，80℃水浴80 min，浸提液趁熱過濾并洗滌茶渣數(shù)次，濾液冷卻后定容至250 ml，搖勻后得供試樣品。

1．2．2 浸提溶劑的選擇試驗。同等環(huán)境條件下稱取“道泉雅女茶”下盤茶5份，每份20 g，分別加入熱水、乙醇、檸檬酸和VC-Na，各成分比例見表1。

浸提溫度80℃，浸提時間80 min，獲得浸提液后，研究浸提溶劑對浸提液中茶多酚含量的影響。由于VC-Na對樹脂的影響，故選取檸檬酸、乙醇及水浸提得到的浸提液分別裝聚酰胺樹脂做柱色譜分離試驗，浸提液溫度降為30～40℃后，上柱吸附1 h，先后用500 ml 25%乙醇和520 ml 80%乙醇洗脫，收集變色(清亮的黃色變成酒紅色)0．5 min以后的洗脫液，做HPLC分析，研究浸提溶劑對成品中EGCG含量的影響。

1．2．3 浸提溫度、時間、料液比的單因素試驗。按照茶多酚提取方法，溫度條件依次為 40、50、60、70、80、90 ℃，浸提時間依次為 40、50、60、70、80、90 min，料液比依次為 1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶25 g/ml，以此研究各因素的影響作用。

1．2．4 正交試驗。通過單因素試驗，分析各因素對有效成分得率的影響，確定較佳的單因素試驗條件范圍，在此基礎(chǔ)上，以浸提溫度、浸提時間、料液比為主要影響因素，各選出3個水平，安排L9(33)正交試驗分析(表2)。

表2 正交試驗L 9(33)因素和水平

1．2．5 浸提液中茶多酚含量的測定。參照GB/T8313－2002(酒石酸亞鐵比色法)，用紫外分光光度計測定浸提液中茶多酚的總量。

1．2．6 浸提液中EGCG含量的測定。取一定量茶多酚供試液，過0．22μm微孔濾膜，HPLC分析。HPLC測定條件:色譜柱選用 LunaC18柱(4．6 mm ×150 mm，5 μm)，L-2420 型 UV紫外檢測器，流動相A為N，N-二甲基甲酰胺∶甲醇∶冰醋酸=40∶2∶1．5 ，流動相 B 為重蒸餾水，流速1 ml/min，柱溫40℃，檢測波長278 nm，采用線性梯度洗脫，梯度見表3。兒茶素組分標(biāo)準樣液相色譜圖見圖1。

表3 線性梯度洗脫

2 結(jié)果與分析

2．1 浸提溶劑的選擇試驗結(jié)果 圖2顯示了浸提液中茶多酚含量與浸提溶劑的關(guān)系，由此可知，添加有檸檬酸和VCNa的浸提液對茶多酚的浸提效果最好，然后依次為添加檸檬酸的浸提液、乙醇浸提液、添加VC-Na的浸提液、水。

表4顯示了不同浸提溶劑同等環(huán)境下得到的兒茶素成品HPLC分析結(jié)果。由表4可知，水作為浸提溶劑，經(jīng)柱色譜分離得到的兒茶素成品咖啡因含量較低，總兒茶素含量較高。分析其原因為:添加檸檬酸的浸提液pH較低，不利于兒茶素成分的吸附和洗脫;乙醇在浸提過程和柱層析過程中不能夠很有效地控制其揮發(fā)，同時嚴重影響了EGC對聚酰胺樹脂的有效吸附。綜合考慮溶劑的溶解選擇性、容易回收性、適當(dāng)?shù)拿芏?、表面張力、安全性、化學(xué)穩(wěn)定性和生產(chǎn)成本等因素，以及HPLC分析結(jié)果，選擇最佳浸提溶劑為水。

表4 兒茶素成品的HPLC分析

2．2 浸提溫度對浸提液中茶多酚和EGCG含量的影響 圖3表明，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，浸提液中茶多酚的含量隨之升高，當(dāng)溫度超過80℃，茶多酚含量隨溫度升高而下降，而且90℃溫度下浸提出的茶湯顏色偏黑。

圖4表明，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，浸提液中EGCG的含量隨之升高，當(dāng)溫度為80℃時，EGCG含量達到最大為6．0427%，溫度接著升高，EGCG的含量反而下降。

綜合考量浸提液中茶多酚和EGCG含量與溫度的關(guān)系，分析其原因為:浸提以擴散原理為基礎(chǔ)，隨溫度升高，擴散速度加快，浸提液中茶多酚和EGCG含量均有所增加，但當(dāng)溫度到達一定值后，茶多酚和EGCG的氧化速度也加快，含量反而有所下降。

2．3 浸提時間對浸提液中茶多酚和EGCG含量的影響 圖5表明，在一定溫度范圍內(nèi)，浸提液中茶多酚的含量與浸提時間成正比關(guān)系，浸提時間越長，茶多酚含量越高，當(dāng)浸提時間為80 min時，茶多酚含量達到最大，超過這個點，時間延長茶多酚含量反而降低。

圖6表明，在一定溫度范圍內(nèi)，浸提液中EGCG含量與時間成正比關(guān)系，時間越長，EGCG含量越高，當(dāng)浸提時間超過60 min，含量明顯提高，當(dāng)浸提時間為80 min時，EGCG含量為最大，超過這個點，時間延長浸提液中EGCG含量反而降低。

綜合考量浸提液中茶多酚和EGCG含量與浸提時間的關(guān)系，分析其原因為固－液浸提過程為3步:①溶劑進入固體內(nèi)部，溶質(zhì)溶解。②溶質(zhì)從固體內(nèi)部到表面。③溶質(zhì)溶解液從固體表面到溶劑中。這個過程需要一定的時間，在這個時間范圍內(nèi)，隨浸提時間的延長，茶多酚和EGCG浸出量增加，但當(dāng)浸提時間到達一定值后，茶多酚和EGCG因溫度原因加快其氧化速度，含量反而有所下降。

2．4 料液比對浸提液中茶多酚和EGCG含量的影響 圖7表明，隨著浸提用水量的增加，浸提液中茶多酚含量呈上升趨勢，當(dāng)料液比達到1∶20 g/ml時，再增加浸提溶劑的量對茶多酚的浸出影響不大。

圖8表明，隨著浸提用水量的增加，浸提液中EGCG含量基本呈上升趨勢，當(dāng)料液比達到1∶20 g/ml時，再增加浸提溶劑對EGCG的浸出影響不大，甚至有略微下降趨勢。綜合考量浸提液中茶多酚和EGCG含量與料液比的關(guān)系，分析其原因為:茶粉中所含的水溶性有效成分是一定的，隨著浸提用水量的增加，茶多酚和EGCG的浸出含量基本呈上升趨勢，當(dāng)浸提用水量到達一定值后，茶粉中水溶性成分已全部浸提出，再增加用水量也沒有明顯增加，反而會因溫度等原因加快茶多酚和EGCG的氧化，同時給后續(xù)吸附、洗脫和濃縮處理增加能耗，提高生產(chǎn)成本。

2．5 正交試驗確定浸提茶多酚和EGCG的最佳條件 由直觀分析表5可以看出，3個因素對浸提液中茶多酚含量的影響的主次關(guān)系依次為:浸提溫度、浸提時間、料液比;對浸提液中EGCG含量的影響的主次關(guān)系同樣依次為:浸提溫度、浸提時間、料液比。方差分析顯示，各因素對浸提液中茶多酚含量的影響，F(xiàn)A=469．824＊＊，F(xiàn)B=17．382，F(xiàn)C=5．353，F(xiàn)0．05=19．00，F(xiàn)0．01=99．00;各因素對浸提液中 EGCG 含量的影響，F(xiàn)A=1 251．500＊＊，F(xiàn)B=194．000＊＊，F(xiàn)C=5．500，F(xiàn)0．05=19．00，F(xiàn)0．01=99．00。由此可以看出，浸提時間對浸提液中茶多酚含量的影響不顯著，但對浸提液中EGCG含量的影響極為顯著;料液比對浸提液中茶多酚和EGCG含量的影響都不顯著。

由直觀分析表5可見，于茶多酚的浸提效果而言，最佳工藝組合為A2B2C2，于EGCG的浸提效果而言，最佳工藝組合為 A2B2C1，但料液比1∶18 g/ml和 1∶20 g/ml對浸提液中EGCG含量的影響差別極小，料液比的影響本身又不顯著，故選擇浸提的最佳工藝組合為A2B2C2即浸提溫度80℃，浸提時間80 min，料液比1∶20 g/ml，經(jīng)驗證試驗，該最優(yōu)條件下，浸提液中茶多酚含量為20．16%，EGCG含量為6．108%。

表5 正交試驗L 9(33)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L9(33)正交試驗確定道泉雅女茶中茶多酚和EGCG的最佳浸提工藝參數(shù)為:浸提溫度80℃，浸提時間80 min，料液比1∶20 g/ml。此工藝條件下，以水為浸提溶劑，得到的浸提液中茶多酚含量為20．16%，EGCG含量為6．108%。該方法綠色無污染，對提高道泉雅女茶下盤茶的利用率具有重要意義，同時為工業(yè)化制取茶多酚、分離純化EGCG單體提供研究基礎(chǔ)。

［1］YANGCS，LI G X，YANG Z H，et al．Cancer prevention bytocopherols and tea polyphenols［J］．Cancer letters，2013，334(1):79 －85．

［2］蔣麗，王雪梅，全學(xué)軍，等．不同提取方法對茶多酚理化性質(zhì)的影響［J］．食品科學(xué)，2010，31(14):136 －139．

［3］SINGH B N，SHANKAR S，SRIVASTAVA R K．Green-tea-catechin，epigallocatechin-3-gallate(EGCG):Mechanisms，perspectivesand clinical applications［J］．Biochem pharmacol，2011，82:1807－1821．