李曉筠，史黎黎，李根福，陳兆明，孫成波，2*

(1．廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江524088;

2．廣東高校熱帶海產(chǎn)無脊椎動(dòng)物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，廣東湛江524025)

我國(guó)對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)自20世紀(jì)80年代開始快速發(fā)展，與此同時(shí)養(yǎng)殖環(huán)境受到不同程度污染，各類病害更是層出不窮。白斑綜合癥(White spot syndrome，WSS)和桃拉綜合癥(Taura syndrome，TS)是對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)危害最為嚴(yán)重的病毒性疾病，均具有傳播快、死亡率高的特點(diǎn)。白斑綜合癥病毒(White spot syndromevirus，WSSV)，隸屬線性病毒科 (Nimaviridae)、白斑綜合癥白斑病毒屬(Whispovirus)，最早發(fā)生于20世紀(jì)90年代初期臺(tái)灣的對(duì)蝦養(yǎng)殖地區(qū)［1］，隨后迅速蔓延至世界各養(yǎng)殖區(qū)域，給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成重創(chuàng)［2－3］。WSSV宿主廣泛，致死率高，可使發(fā)病對(duì)蝦3～10 d死亡率可達(dá)100%［4］。桃拉綜合癥病毒(Taura syndrome virus，TSV)，隸屬雙順反子病毒科(Dicistroviridae)、蜜蜂麻痹病毒屬(Aparavirus)，最早在厄瓜多爾地區(qū)出現(xiàn)，可導(dǎo)致仔蝦、稚蝦和幼蝦的累計(jì)死亡率高達(dá)40% ～90%［5］，給對(duì)蝦的生產(chǎn)帶來嚴(yán)重威脅。國(guó)際獸疫局(OIE)將二者列為需要報(bào)告的水生動(dòng)物病毒性疫?。?］。

斑節(jié)對(duì)蝦在我國(guó)東南沿海地區(qū)有較長(zhǎng)的養(yǎng)殖歷史，有良好的養(yǎng)殖基礎(chǔ)，但長(zhǎng)期受到病害的困擾，危害較為嚴(yán)重的主要是病毒病。病毒病的暴發(fā)不是單純病毒的作用，而是蝦、環(huán)境以及病毒相互作用的結(jié)果。溫度、鹽度、pH、氨氮含量等環(huán)境因素變化往往使對(duì)蝦產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)、抵抗力下降，誘使?jié)摲腥镜膶?duì)蝦發(fā)?。?－8］。其中，鹽度直接影響斑節(jié)對(duì)蝦的蛻殼、成活和生長(zhǎng)等生理活動(dòng)，是斑節(jié)對(duì)蝦的生長(zhǎng)環(huán)境中較為重要的影響因子［9－10］。為了檢測(cè)斑節(jié)對(duì)蝦幼蝦在不同鹽度下對(duì)WSSV和TSV敏感性差異，探索在實(shí)際生產(chǎn)過程中如何有效地控制環(huán)境因子，筆者采用投喂感染的方法使斑節(jié)對(duì)蝦幼蝦人工感染W(wǎng)SSV和TSV，研究不同鹽度對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦的抗病力的影響，提高斑節(jié)對(duì)蝦抗病毒力，達(dá)到對(duì)蝦養(yǎng)殖高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的目的。

1 材料與方法

1．1 材料 試驗(yàn)在廣東海洋大學(xué)南三海水試驗(yàn)基地進(jìn)行，試驗(yàn)所用斑節(jié)對(duì)蝦幼蝦來自湛江市浩海蝦苗場(chǎng)，于基地培育暫養(yǎng)10 d。試驗(yàn)器材有150 L白色塑料桶、16 L塑料桶、空氣壓縮機(jī)、JA5003型電子天平(精確到0．001 g)、直尺。投喂人工配合飼料。病原為惠州愛試靈生物科技有限公司病蝦，經(jīng)PCR檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。試驗(yàn)用水為海區(qū)抽取經(jīng)沙濾、沉淀，再用有效氯濃度為20 g/m3的強(qiáng)氯精充氣暴曬處理，確保水體無病源生物。

1．2 方法

1．2．1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)鹽度梯度設(shè)置為5、10、15、20、25、30、35 和40，分別標(biāo)記為 A、B、C、D、E、F、G、H 共 8 個(gè)組，每個(gè)鹽度梯度設(shè)3個(gè)平行組，每個(gè)平行放幼蝦100尾，飼養(yǎng)于150 L的白色塑料桶中，養(yǎng)殖水體為120 L。投喂人工配合飼料，1.5 h后吸污換水，換水量約為水體體積的30%，暫養(yǎng)時(shí)間10 d。從對(duì)應(yīng)的平行中取大小均勻的蝦30尾放于16 L的養(yǎng)殖桶，分別作為對(duì)照組、WSSV攻毒組和TSV攻毒組，每組設(shè)置3個(gè)平行。攻毒前，蝦饑餓空胃24 h。試驗(yàn)組投喂的飼料中混有攜帶相應(yīng)病毒的對(duì)蝦碎屑，對(duì)照組按試驗(yàn)前投喂，試驗(yàn)期10 d。

1．2．2 存活率統(tǒng)計(jì)。攻毒組每天統(tǒng)計(jì)各平行的死亡數(shù)和試驗(yàn)后的存活率。

1．2．3 病毒檢測(cè)。采用半定量IQ2000TMPCR檢測(cè)WSSV和TSV［11－12］，檢測(cè)方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

試劑配制:第1次擴(kuò)增反應(yīng)(First PCR):8μl/reaction、First PCR PreMix 7．5 μl、IQzyme DNA Polymerase 2 U/μl 0．5 μl;第2 次擴(kuò)增反應(yīng)(Nested PCR):15 μl、Nested PCR Polymerase 2 U/μl。

反應(yīng)條件:第1次擴(kuò)增反應(yīng)(First PCR):94℃ 2 min;然后再運(yùn)行94℃ 20 s;72℃ 30 s，15個(gè)循環(huán);最后72℃，再延伸30 s，20℃30 s。第2次擴(kuò)增反應(yīng)(Nested PCR):94℃ 20 s;62℃ 20 s;72℃30 s，30個(gè)循環(huán);最后再延伸72℃ 30 s，20℃30 s。通過瓊脂凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，通過紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照，判斷結(jié)果后保存。

1．2．4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析(ANOVA)和樣本均值多重分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同鹽度下斑節(jié)對(duì)蝦對(duì)WSSV的敏感性 從圖1～2可以看出，感染后第3天開始出現(xiàn)死亡，死亡率隨著時(shí)間的推移而上升，到第8天基本趨于穩(wěn)定。當(dāng)鹽度為25時(shí)的存活率最高(41．11%)，達(dá)到極顯著水平(P＜0．01);當(dāng)鹽度為20和30時(shí)存活率差異不明顯。各組存活率依次為:鹽度20(33.33%)＞鹽度30(28．89%)＞鹽度15(17．78%)＞鹽度35(14．44%)＞鹽度40(6．67%);當(dāng)鹽度為5和10時(shí)，存活率均為0。

2．2 不同鹽度下斑節(jié)對(duì)蝦對(duì)TSV的敏感性 從圖3～4可以看出不同鹽度下斑節(jié)對(duì)蝦幼體的存活率都很高，其中鹽度25時(shí)斑節(jié)對(duì)蝦幼體的存活率最高，為64．44%(P＜0．01)，鹽度為5、10、35及40的試驗(yàn)組之間差異不顯著。各試驗(yàn)組斑節(jié)對(duì)蝦幼體的存活率依次為:鹽度20(53．33%)＞鹽度15(47.78%)＞鹽度30(44．44%)＞鹽度40(35．56%)＞鹽度35(35．56%)＞鹽度10(34．44%)＞鹽度5(30%)，沒有出現(xiàn)死亡率100%。

2．3 PCR病毒檢測(cè)結(jié)果 攻毒試驗(yàn)前隨機(jī)抽取30尾幼蝦作為初始樣本，通過半定量PCR檢測(cè)是否攜帶WSSV和TSV，結(jié)果全部為陰性(陰性率100%)。試驗(yàn)后WSSV和TSV組中死蝦和存活蝦經(jīng)檢測(cè)全部為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為100%。投喂的病蝦經(jīng)PCR檢測(cè)全部為WSSV陽(yáng)性和TSV陽(yáng)性(圖5)。

3 討論

從20世紀(jì)90年代開始，對(duì)蝦的養(yǎng)殖區(qū)域暴發(fā)過多次病毒性疫病，環(huán)境受到污染。養(yǎng)殖區(qū)域存在大量的難以清除的病原體，對(duì)蝦被病毒感染的比率很高。從感染到發(fā)病有一定的潛伏期，處于感染潛伏期的對(duì)蝦在安全的環(huán)境中仍可正生長(zhǎng)。近年來很多研究發(fā)現(xiàn)引起WSS暴發(fā)的原因不僅與蝦體的免疫水平、病毒數(shù)量、感染方式有關(guān)，還與環(huán)境因子密切相關(guān)［13］。何建國(guó)等［14］認(rèn)為WSSV的潛伏期感染具有很大的危害性，一旦氣候和水環(huán)境因子發(fā)生變化極容易導(dǎo)致潛伏期感染轉(zhuǎn)為急性感染。

在對(duì)蝦的生長(zhǎng)環(huán)境中，鹽度是重要的環(huán)境因子之一，它直接作用于對(duì)蝦滲透調(diào)節(jié)、代謝酶活性和免疫等功能，影響了對(duì)蝦的存活、生長(zhǎng)。研究表明，鹽度改變會(huì)引起對(duì)蝦體內(nèi)相關(guān)免疫指標(biāo)變化［15］。葉建生等［16］報(bào)道指出鹽度突變?cè)诙虝r(shí)間內(nèi)引起血液滲透壓變化如對(duì)蝦體內(nèi)的超氧陰離子產(chǎn)量隨著鹽度突變值增加而增加，血清中酚氧化酶活性隨著鹽度突變值增加活性升高越快，血清中SOD活性隨著鹽度突變值增加而降低，血清蛋白含量隨著降低特別是鹽度降低能引起對(duì)蝦血細(xì)胞數(shù)量明顯降低，導(dǎo)致酚氧化酶活性升高。許多甲殼動(dòng)物都具有一定程度的廣鹽適應(yīng)性［17－18］，最佳生長(zhǎng)、存活和生產(chǎn)效率的鹽度水平常常因種類而異［19－23］。斑節(jié)對(duì)蝦幼蝦對(duì)低鹽度的適應(yīng)能力較強(qiáng)。緩慢降低鹽度至1‰，斑節(jié)對(duì)蝦幼蝦沒有死亡;在純淡水中可存活5 d左右。當(dāng)水體鹽度從25突然降至10時(shí)，斑節(jié)對(duì)蝦成活率為93．3%;當(dāng)水體鹽度突然下降至2時(shí)，斑節(jié)對(duì)蝦成活率只有43．3%，可見鹽度突變對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦成活率有很大影響。一般認(rèn)為，25左右的鹽度是斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖最理想的鹽度［9］，在生長(zhǎng)效率最佳的鹽度條件下斑節(jié)對(duì)蝦的免疫能力也是最強(qiáng)的［24］。該試驗(yàn)結(jié)果基本與上述觀點(diǎn)符合，鹽度為25時(shí)斑節(jié)對(duì)蝦對(duì)WSSV與TSV的存活率最高。當(dāng)鹽度為5時(shí)斑節(jié)對(duì)蝦對(duì)WSSV和TSV的存活率最低，各組間差異不明顯。在合適的鹽度條件下，蝦的免疫功能沒有受到損害，對(duì)病害有較強(qiáng)抵抗能力。

該試驗(yàn)采用投喂的方式進(jìn)行攻毒，感染斑節(jié)幼蝦。WSSV攻毒的最有效方法是投喂法和注射法［25－26］，但是人工注射方法對(duì)蝦體的物理傷害作用較大，幼蝦不宜采用。感染3 d后，斑節(jié)對(duì)蝦的頭胸甲上出現(xiàn)白斑，行動(dòng)遲緩所表現(xiàn)的發(fā)病過程符合WSSV的發(fā)病特征。PCR檢測(cè)結(jié)果表明斑節(jié)對(duì)蝦全部感染W(wǎng)SSV。不同鹽度組下斑節(jié)對(duì)蝦對(duì)WSSV的存活率也表現(xiàn)出顯著差異。這可能是因?yàn)椴煌柠}度影響了斑節(jié)對(duì)蝦幼體的抗病力，進(jìn)而造成蝦體對(duì)病害的免疫力不同。斑節(jié)對(duì)蝦幼體從第3天開始出現(xiàn)死亡，第8天基本趨于穩(wěn)定，死亡速度極快，且大量死亡，說明斑節(jié)對(duì)蝦幼體對(duì)WSSV的敏感性很強(qiáng)。

TSV同樣通過人工感染的方法感染斑節(jié)對(duì)蝦。研究發(fā)現(xiàn)，通過人工感染中國(guó)對(duì)蝦、日本對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦以及桃紅對(duì)蝦均能發(fā)病。但是，在自然狀態(tài)下尚未見到對(duì)這幾種蝦類被TSV感染導(dǎo)致較大損失的報(bào)道［27］。在實(shí)驗(yàn)室條件下，注射感染TSV的病蝦的組織勻漿和投喂感染TSV的病蝦均可引起發(fā)?。?8］。不同鹽度下斑節(jié)對(duì)蝦對(duì)TSV的存活率差異不顯著。在實(shí)際養(yǎng)殖過程中，感染TSV后，若能及時(shí)控制好環(huán)境，改良底質(zhì)、改善水質(zhì)、增加溶氧等，可以控制病情，依然獲得很好的收成。試驗(yàn)過程中，放養(yǎng)密度小、連續(xù)充氧、水質(zhì)良好。試驗(yàn)中蝦體都攜帶TSV，但其死亡率很低，可能與試驗(yàn)中的環(huán)境條件有關(guān)。通常感染后的對(duì)蝦在環(huán)境惡化時(shí)，其死亡速度更快，死亡量也加劇。也有部分經(jīng)過發(fā)炎、再生或修復(fù)過程可轉(zhuǎn)危為安，修復(fù)期蝦對(duì)TSV的再感染具有抵抗力，感染后的幸存者一旦表皮脫落，甲殼角質(zhì)層出現(xiàn)黑斑化現(xiàn)象，變成無癥狀的TSV攜帶者［24］。這些是對(duì)蝦被感染后可存活的原因。

綜上所述，鹽度變化會(huì)提高斑節(jié)對(duì)蝦幼蝦對(duì)WSSV的易感性，而其對(duì)TSV的易感性則低于WSSV。鹽度是引起白斑綜合癥暴發(fā)的關(guān)鍵影響因子，在對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中必須謹(jǐn)慎控制。

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