劉 穎，馮 實(shí)，石彥國(guó)，曲映紅，劉志東，高 飛，馬慶保

(1．哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076;

2．上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306;3．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海200090)

南極磷蝦(Euphausia superba)作為一種生物資源量巨大、潛在的優(yōu)質(zhì)動(dòng)物性蛋白質(zhì)資源，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景［1，2］。近年來(lái)，南極磷蝦已成為食品科學(xué)、醫(yī)學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)和藥學(xué)等學(xué)科的研究熱點(diǎn)之一。國(guó)內(nèi)外圍繞南極磷蝦蛋白質(zhì)開(kāi)展了相關(guān)研究，但關(guān)于南極磷蝦蛋白質(zhì)的功能特性及其改性的研究報(bào)道較少。在前期開(kāi)展南極磷蝦蛋白質(zhì)的功能特性的研究中發(fā)現(xiàn)，提取獲得的南極磷蝦蛋白質(zhì)的功能特性與目前商品化應(yīng)用的其他動(dòng)物性蛋白質(zhì)的功能特性存在較大的差距，限制了其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。糖基化反應(yīng)(Glycosylation)是一種通過(guò)Maillard反應(yīng)的Amadori重排，將蛋白質(zhì)分子氨基酸側(cè)鏈的自由氨基與還原糖分子末端的羥基發(fā)生羰氨反應(yīng)，形成以共價(jià)鍵相連而成的糖－蛋白質(zhì)復(fù)合物，屬于化學(xué)改性范疇。糖基化改性的方法主要有基于固相體系的干熱法和基于水相體系的濕熱法2種。李錚等［3］研究發(fā)現(xiàn)乳清蛋白與低聚異麥芽糖反應(yīng)改性后能夠有效降低α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性。Li Y等［4］研究發(fā)現(xiàn)大米蛋白經(jīng)糖基化改性后，其溶解性和乳化性顯著提升。Liu Yan等［5］研究了美拉德反應(yīng)對(duì)花生蛋白質(zhì)功能特性的改善效果。作為一種新來(lái)源的海洋生物蛋白質(zhì)，盡管南極磷蝦蛋白質(zhì)具有一定的功能性質(zhì)，但其較低的溶解性限制了其在食品工業(yè)的應(yīng)用。因此，需要對(duì)南極磷蝦蛋白質(zhì)進(jìn)行改性，以擴(kuò)大其應(yīng)用領(lǐng)域。目前關(guān)于南極磷蝦蛋白質(zhì)糖基化改性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，在前期研究的基礎(chǔ)上，筆者以反應(yīng)產(chǎn)物溶解性、吸水性、吸油性、乳化性和乳化穩(wěn)定性等作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分析糖基化改性時(shí)間對(duì)南極磷蝦蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的影響，為糖基化改性提高其功能特性提供理論依據(jù)，以期為海洋生物來(lái)源蛋白質(zhì)的改性提供新的思路。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器 南極磷蝦由上海開(kāi)創(chuàng)遠(yuǎn)洋漁業(yè)有限公司開(kāi)裕號(hào)遠(yuǎn)洋捕撈船于南極設(shè)得蘭群島海域捕獲，在－18℃條件下運(yùn)回國(guó)內(nèi);南極磷蝦蛋白質(zhì)提取采用堿溶酸沉法［6］;提取后的南極磷蝦蛋白質(zhì)經(jīng)真空冷凍干燥后于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆?無(wú)水葡萄糖(上海源聚生物科技有限公司)、D-半乳糖(上海源聚生物科技有限公司)、D-木糖(上海源聚生物科技有限公司)、麥芽糖(上海源聚生物科技有限公司)、葡聚糖-10(生工生物工程股份有限公司);其他試劑均為分析純級(jí)及以上級(jí)別。

HWS-24型電熱恒溫水浴鍋，為上海齊欣科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;TGl-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，為湖南湘儀試驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品;721N型可見(jiàn)分光光度計(jì)為上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;LABCONCO FreeZone?真空冷凍干燥機(jī)，為美國(guó)LABCONCO公司產(chǎn)品;Pro-250型勻漿機(jī)，為美國(guó)Pro Scientific公司產(chǎn)品。

1．2 方法

1．2．1 南極磷蝦蛋白質(zhì)的糖基化改性。南極磷蝦蛋白質(zhì)加入一定量的蒸餾水配制成蛋白質(zhì)溶液，并按照1∶1的比例加入不同的糖基供體，室溫下混勻，將一部分上述溶液置于70℃的恒溫環(huán)境中分別反應(yīng)15、30、45和60 min后取出，冷卻至室溫后測(cè)定其功能特性［7］。

1．2．2 蛋白質(zhì)溶解性的測(cè)定。采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。稱取0．50 g南極磷蝦蛋白質(zhì)和0．50 g糖基供體并溶于15．00 ml蒸餾水中，混勻后離心(10 000 r/min、25 ℃)10 min，吸取上清液并稀釋 50 倍后，取1．00 ml蛋白質(zhì)溶液于試管中，并加入5．00 ml考馬斯亮藍(lán)G－250試劑，測(cè)定595 nm 處的吸光度值［8－9］。

1．2．3 蛋白質(zhì)吸水性的測(cè)定。稱取0．50 g南極磷蝦蛋白質(zhì)和0．50 g糖基供體，并與15．00 ml水充分混勻，靜置30 min后離心(10 000 r/min、25℃、10 min)，記錄離心后上清液體積［10］。

1．2．4 蛋白質(zhì)吸油性的測(cè)定。稱取0．25 g南極磷蝦蛋白質(zhì)和0．25 g糖基供體，并與15．00 ml大豆油充分混勻，靜置30 min后離心(10 000 r/min、25℃、10 min)，記錄離心后上清液體積。

1．2．5 蛋白乳化能力的測(cè)定。以乳化活性指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)來(lái)表示南極磷蝦糖基化改性蛋白質(zhì)的乳化能力。稱取0．30 g南極磷蝦蛋白質(zhì)和0．30 g糖基供體與30．00 ml水和10．00 ml大豆油充分混勻，10 000 r/min 勻漿1 min;由乳濁液底部吸取50．00μl液體，振蕩混勻后在第0 min 用0．10%SDS(W/V)稀釋至 5．00 ml，測(cè)定波長(zhǎng) 500 nm處的吸光度A0，10 min后再次測(cè)定吸光度值A(chǔ)10。EAI和ESI分別按照以下公式進(jìn)行計(jì)算［11］:

式中，A為500 nm處的吸光值;φ為油相體積分?jǐn)?shù)(φ=2．303);c為蛋白質(zhì)濃度(g/ml);A0和A10為乳狀液在0和10 min的吸光值。

1．2．6 蛋白質(zhì)起泡能力的測(cè)定。稱取0．60 g南極磷蝦蛋白質(zhì)和0．60 g糖基供體，配成濃度為20．00 mg/ml的蛋白質(zhì)溶液，采用高速勻漿機(jī)勻漿1 min，結(jié)束后將液體快速轉(zhuǎn)移至量筒中，分別測(cè)定勻漿操作停止時(shí)泡沫體積和液體體積之和V0，操作停止10 min后的泡沫和液體總體積V10。分別按照以下公式計(jì)算起泡性(FC)和泡沫穩(wěn)定性(FS):

1．3 數(shù)據(jù)處理 每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013軟件進(jìn)行處理，試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2．1 改性時(shí)間對(duì)南極磷蝦蛋白質(zhì)溶解性的影響 蛋白質(zhì)的溶解性是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)應(yīng)用性的重要指標(biāo)。從圖1可以看出，采用半乳糖、木糖和葡聚糖改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)溶解性隨著改性時(shí)間的延長(zhǎng)，表現(xiàn)出下降的趨勢(shì);采用麥芽糖改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)的溶解性隨著改性時(shí)間的延長(zhǎng)而上升;采用葡萄糖改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)的溶解性隨著改性時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。此外，不同糖基供體與南極磷蝦蛋白質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)物的溶解性隨著反應(yīng)時(shí)間變化的程度和速率也不完全相同。以葡萄糖和乳糖為糖基供體時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物的溶解性在反應(yīng)過(guò)程中隨著反應(yīng)速率的加快而增強(qiáng)，反應(yīng)45 min后葡萄糖與南極磷蝦蛋白質(zhì)的產(chǎn)物溶解性達(dá)到最大值(19．00%)。此后，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)和產(chǎn)物的減少，溶解性降低。因?yàn)殡S著糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，親水性的糖基與蛋白質(zhì)連接，反應(yīng)產(chǎn)物的溶解性也隨之增大;當(dāng)反應(yīng)達(dá)到一定程度后，反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)生達(dá)到“頂點(diǎn)”，其溶解性也隨之降低。以木糖和葡聚糖為大分子的糖基供體的還原性相對(duì)較弱，反應(yīng)產(chǎn)物的溶解性相對(duì)較低。因此，蛋白質(zhì)的糖基化改性必須選擇合適的糖基供體，嚴(yán)格控制反應(yīng)條件和反應(yīng)進(jìn)程。

2．2 改性時(shí)間對(duì)南極磷蝦蛋白質(zhì)吸水性的影響 蛋白質(zhì)的吸水性是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)吸附水能力的一項(xiàng)指標(biāo)。影響蛋白質(zhì)吸水性的因素主要包括氨基酸組成、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和表面極性/疏水性等。從圖2可以看出，采用葡萄糖、半乳糖和葡聚糖改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)的吸水能力呈現(xiàn)上升的趨勢(shì);采用木糖和麥芽糖改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)的吸水性則表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)。葡萄糖、半乳糖和麥芽糖與南極磷蝦蛋白質(zhì)的反應(yīng)較快，吸水性變化波動(dòng)較為明顯。這可能是因?yàn)榉肿恿枯^小的還原糖與南極磷蝦蛋白質(zhì)分子結(jié)合時(shí)，初始階段反應(yīng)速率較快，導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物的吸水能力增強(qiáng);隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)生減少，吸水能力降低。改性南極磷蝦蛋白質(zhì)的吸水性最大值為采用半乳糖為糖基供體、改性時(shí)間 60 min，最大值為 8．20 ml/g。

2．3 改性時(shí)間對(duì)南極磷蝦蛋白質(zhì)吸油性的影響 蛋白質(zhì)的吸油性是表征蛋白質(zhì)對(duì)脂質(zhì)的吸收和保留能力的重要指標(biāo)。從圖3可以看出。采用半乳糖和麥芽糖改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)的吸油性隨著改性時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)為上升的趨勢(shì)。這是由于糖基化改性導(dǎo)致南極磷蝦蛋白質(zhì)原有的構(gòu)象發(fā)生變化，高度規(guī)則、緊密的排列方式轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰?guī)則、松散排列方式，增加了吸油性。葡萄糖、木糖和葡聚糖改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)的吸油性則隨著時(shí)間呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)殡S著改性時(shí)間的延長(zhǎng)，南極磷蝦蛋白質(zhì)變性增強(qiáng)，不溶性蛋白質(zhì)增多，導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物的吸油性降低。采用木糖為糖基供體，改性時(shí)間30 min時(shí)，改性南極磷蝦蛋白質(zhì)的吸油性最大，為16．67 ml/g。

2．4 改性時(shí)間對(duì)南極磷蝦蛋白質(zhì)乳化能力的影響 由于蛋白質(zhì)具有兩親結(jié)構(gòu)，同時(shí)具有親水性和親油性，但是由于未經(jīng)改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)的溶解性較差限制了其乳化性。從圖4可以看出，采用葡萄糖和麥芽糖進(jìn)行糖基化改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)的乳化能力隨著改性時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，采用麥芽糖和葡聚糖進(jìn)行糖基化改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)的乳化性隨著改性時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，采用木糖進(jìn)行糖基化改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)的乳化性隨著改性反應(yīng)的進(jìn)行表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)。采用葡萄糖為糖基供體，改性南極磷蝦蛋白質(zhì)的乳化性最大值出現(xiàn)在改性時(shí)間60 min，最大值達(dá)10．33 m2/g。這是因?yàn)槟蠘O磷蝦蛋白質(zhì)與葡萄糖發(fā)生聚合后，提高了其溶解性;同時(shí)，聚合后的產(chǎn)物側(cè)鏈殘基具有一定的疏水性，使得糖基化改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)能夠快速較好地吸附在油水界面。

從圖5可以看出，采用葡萄糖進(jìn)行糖基化改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性隨著改性時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。這是由于南極磷蝦蛋白質(zhì)與糖的反應(yīng)初始階段，隨著反應(yīng)溫度的升高，南極磷蝦蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分展開(kāi)，糖基供體與南極磷蝦蛋白質(zhì)受熱結(jié)合，促進(jìn)南極磷蝦蛋白質(zhì)的分子伸展，疏水性基團(tuán)暴露，大大提高了溶液的乳化活性。但是，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，一方面導(dǎo)致南極磷蝦蛋白質(zhì)基團(tuán)中的賴氨酸被破壞，另一方面引起南極磷蝦蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的伸展，增加蛋白質(zhì)分子間的相互作用，導(dǎo)致凝聚和沉淀，不利于蛋白質(zhì)與糖基供體發(fā)生相互作用。采用木糖和葡聚糖進(jìn)行糖基化改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)，其乳化穩(wěn)定性隨著改性時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)為先上升再下降的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)檫@2種糖基供體在反應(yīng)后期的產(chǎn)物(褐變產(chǎn)物)影響了其乳化穩(wěn)定性。采用半乳糖和麥芽糖為糖基供體的糖基化產(chǎn)物其乳化穩(wěn)定性隨著改性時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)為先下降再上升的趨勢(shì)。這是由于隨著糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，南極磷蝦蛋白質(zhì)所帶的凈電荷不斷增加，分子間的排斥增加，油水界面所形成的保護(hù)膜增厚，提高了乳化穩(wěn)定性。采用葡萄糖為糖基供體，改性南極磷蝦蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性最高的值出現(xiàn)在改性時(shí)間15 min時(shí)，為89．93%。

2．5 改性時(shí)間對(duì)南極磷蝦蛋白質(zhì)起泡能力的影響 泡沫的形成是由于水分子對(duì)空氣的包裹，空氣是非極性介質(zhì)，而蛋白質(zhì)是兩性分子。因此，它可以作為空氣－水表面的介質(zhì)促成泡沫形成［12］。從圖6可以看出，采用半乳糖進(jìn)行糖基化改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)的起泡性隨著改性時(shí)間的增加而降低，采用葡萄糖和葡聚糖進(jìn)行糖基化改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)的起泡性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì);采用半乳糖和木糖進(jìn)行糖基化改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)，其起泡性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì);采用半乳糖為糖基供體時(shí)，改性南極磷蝦蛋白質(zhì)起泡性的最大值出現(xiàn)在改性時(shí)間為15 min時(shí)，為25．11%。改性南極磷蝦蛋白質(zhì)產(chǎn)物起泡性改善不明顯，可能是由于反應(yīng)產(chǎn)物雖溶解度有所提高，但由于南極磷蝦蛋白質(zhì)是一類結(jié)構(gòu)緊密、剛性強(qiáng)、難于變形的大分子，因而無(wú)法迅速吸附在氣－水界面展開(kāi)形成有序的蛋白質(zhì)分子層，起泡能力差，其泡沫體積保留量也較少。

從圖7可以看出，采用葡萄糖、半乳糖、木糖和麥芽糖改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)泡沫穩(wěn)定性隨著改性時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)。其中，采用葡萄糖、半乳糖和木糖進(jìn)行糖基化改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)，在改性時(shí)間為30～45 min時(shí)，發(fā)生泡沫完全消去的現(xiàn)象;采用葡聚糖進(jìn)行糖基化改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)，其泡沫穩(wěn)定性則隨著改性時(shí)間的增長(zhǎng)表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。結(jié)果表明，采用半乳糖為糖基供體，改性南極磷蝦蛋白質(zhì)的泡沫穩(wěn)定性在試驗(yàn)條件下最好，改性時(shí)間為60 min時(shí)泡沫穩(wěn)定性可達(dá)8．22%。

3 結(jié)論

采用不同的糖基供體對(duì)南極磷蝦蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化改性，其功能特性隨著時(shí)間的改變而存在較大差異。因此，可以根據(jù)應(yīng)用領(lǐng)域不同或目的的不同，選擇最適的糖基供體和改性時(shí)間對(duì)南極磷蝦蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化改性。對(duì)改性時(shí)間而言，采用葡萄糖對(duì)南極磷蝦蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化改性可以獲得較高的溶解性，采用D-木糖對(duì)南極磷蝦蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化改性可以獲得較好的吸水性;采用葡萄糖改性的南極磷蝦蛋白質(zhì)具有較好的乳化性。但是，在該試驗(yàn)條件下糖基化改性南極磷蝦蛋白質(zhì)的起泡性和泡沫穩(wěn)定性還不夠理想，后續(xù)嘗試采用其他的改性方法開(kāi)展南極磷蝦蛋白質(zhì)的改性，以實(shí)現(xiàn)期望的功能特性，為南極磷蝦蛋白質(zhì)的深度開(kāi)發(fā)與利用提供參考。

［1］陳雪忠，徐兆禮，黃洪亮．南極磷蝦資源利用現(xiàn)狀與中國(guó)的開(kāi)發(fā)策略分析［J］．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2009，16(3):451-458．

［2］劉勤，黃洪亮，李勵(lì)年，等．南極磷蝦商業(yè)化開(kāi)發(fā)的戰(zhàn)略性思考［J］．極地研究，2015(1):31-37．

［3］李錚，羅永康，馮力更，等．乳清蛋白-低聚異麥芽糖的制備及其抗原性研究［J］．中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，16(2):133-137．

［4］LI Y，LU F，LUO CR，et al．Functional properties of the Maillard reaction products of rice protein with sugar［J］．Food chemistry，2009，117:69-74．

［5］LIU Y，ZHAO GL，ZHAO M M，et al．Improvement offunctional properties of peanut protein isolate by conjugation withdextran through Maillard reaction［J］．Food chemistry，2012，131:901-906．

［6］張楠，布冠好，朱婷偉，等．糖基化反應(yīng)對(duì)大豆蛋白-乳糖復(fù)合物抗原性及結(jié)構(gòu)的影響［J］．現(xiàn)代食品科技，2015，31(8):117-121．

［7］CROZO-MARTíNEZ M，HERNANDEZ-HERNANDEZ O，VILLAMIEL M，et al．In vitro bifidogenic effect of maillard-type milk protein-galactose conjugates on the human intestinal microbiota［J］．International dairy journal，2013，31(2):127-131．

［8］王軍，王忠合，宋鳳艷，等．糖基化反應(yīng)對(duì)雞蛋清蛋白與低聚麥芽糖交聯(lián)物活性和功能性的影響［J］．現(xiàn)代食品科技，2014，30(10):24-29．

［9］WANGX，ZHANG L S，DONG L L．Inhibitory effect of polysaccharides from pumpkin on advanced glycation end-products formation and aldose reductase activity［J］．Food chemistry，2012，130(4):821-825．

［10］OLIVERCM，MELTONL D，STANLEY RA．Creating proteins with novel functionality via the Maillard reaction:A review［J］．Critical reviews in food science and nutrition，2006，46(4):337-350．

［11］AGYARE K K，ADDO K，XIONG Y L．Emulsifying and foaming properties of transglutaminase-treated wheat gluten hydrolysate as influenced by pH，temperature and salt［J］．Food hydrocolloids，2009，23(1):72-81．

［12］王冠蕾．糖基化改性提高醇法大豆?jié)饪s蛋白凝膠性的研究［J］．現(xiàn)代食品科技，2012，28(11):1478-1483．