郭永霞，王麗艷，孫 強(qiáng)，荊瑞勇，殷奎德

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶163319)

亞麻(Linum usitatissimumL．)為雙子葉植物，是亞麻科(Linaceae)亞麻屬(Linum)的一年生草本植物，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，油用亞麻是一種重要的油料作物，纖用亞麻是重要天然纖維的來(lái)源。我國(guó)的亞麻產(chǎn)量和質(zhì)量水平與發(fā)達(dá)國(guó)家相比有很大的差距，其原因是多方面的，而主要原因之一還是亞麻品種相對(duì)比較落后。干旱、鹽堿、低溫等是限制作物生產(chǎn)的主要外界環(huán)境條件。目前隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人口急劇增加，以及全球氣候的變化，這些環(huán)境問(wèn)題在持續(xù)加重。其中干旱對(duì)作物產(chǎn)量的影響，在各種自然逆境中占據(jù)首位，其危害僅次于生物脅迫病蟲害造成的損失，相當(dāng)于其他自然災(zāi)害之和。NDPK2基因編碼植物核苷二磷酸激酶2(NDPK2)，Moon H等人發(fā)現(xiàn)NDPK2可參與促分裂原蛋白激酶(MAPK)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，結(jié)合MAPK6和MAPK3［1］，進(jìn)而上調(diào)POD、硫氧還蛋白、CAT、過(guò)氧化物還原酶和硫氧還蛋白還原酶等多種抗氧化酶基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)［2］。擬南芥核苷二磷酸激酶2基因(At－NDPK2)通過(guò)對(duì)馬鈴薯［3］、大麥［4］、苜蓿［5］的遺傳轉(zhuǎn)化研究也表明:AtNDPK2基因的過(guò)量表達(dá)可增強(qiáng)作物對(duì)干旱、鹽漬或極端溫度的忍耐性。迄今為止，未見(jiàn)有關(guān)AtNDPK2基因在亞麻中遺傳轉(zhuǎn)化的報(bào)道。本研究旨在以雙亞7號(hào)下胚軸為外植體，通過(guò)對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化來(lái)建立穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。具體是采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子SWPA2與AtNDPK2基因構(gòu)建共表達(dá)載體導(dǎo)入雙亞7號(hào)，以期獲得耐性更強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因亞麻，為亞麻抗逆品種的培育奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為亞麻基因工程操作技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

供試亞麻品種雙亞7號(hào)由黑龍江省科學(xué)院亞麻研究所夏尊民研究員惠贈(zèng)。培養(yǎng)5 d的亞麻下胚軸外植體做為轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化和基因轉(zhuǎn)化的材料。

根癌農(nóng)桿菌(Agrobacferium tumefaciens)菌株EHA105和質(zhì)粒pCAMBIA2300由韓國(guó)生命工學(xué)研究院環(huán)境生命工學(xué)研究中心的郭尚珠教授惠贈(zèng)。

含有目的基因AtNDPK2的重組質(zhì)粒載體也由郭尚珠教授惠贈(zèng)，包含脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子SWPA2，并攜帶目的基因AtNDPK2，npt－Ⅱ?yàn)楹Y選標(biāo)記基因。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 選擇培養(yǎng)基中抗生素的種類和篩選濃度的確定 選取雙亞7號(hào)5 d的無(wú)菌苗下胚軸，分別接種到含不同濃度Kan和G418的下胚軸分化增殖培養(yǎng)基上，15 d繼代一次，30 d后統(tǒng)計(jì)下胚軸的分化增殖情況。Kan和G418濃度均設(shè)置為0，50，100，150，200 mg·L-1，每個(gè)處理接種10個(gè)下胚軸，5次重復(fù)，總計(jì)接種50個(gè)下胚軸，取5次重復(fù)的平均值。

1．2．2 最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的確定 選取雙亞7號(hào)培養(yǎng)5 d的無(wú)菌苗下胚軸，轉(zhuǎn)化前在分化增殖培養(yǎng)基上設(shè)置0、1、2、3、4、5 d時(shí)間進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，經(jīng)相同的農(nóng)桿菌處理濃度、相同共培養(yǎng)時(shí)間和相同篩選條件，每個(gè)處理接種10個(gè)下胚軸，5次重復(fù)，總計(jì)接種50個(gè)下胚軸，取5次重復(fù)的平均值。培養(yǎng)30 d后，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，比較不同處理的抗性再生率，以確定最適的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間。

1．2．3 最佳共培養(yǎng)時(shí)間的確定 以雙亞7號(hào)為材料，切取下胚軸并侵染后，置于共培養(yǎng)基上，分別共培養(yǎng)0，1，2，3，4，5 d，然后轉(zhuǎn)入含有一定濃度篩選抗生素的培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種10個(gè)下胚軸，5次重復(fù)，總計(jì)接種50個(gè)下胚軸，取5次重復(fù)的平均值。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)抗性芽誘導(dǎo)率。

1．2．4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)AtNDPK2基因的轉(zhuǎn)化及植株再生 將雙亞7號(hào)和晉亞7號(hào)培養(yǎng)5 d苗齡的無(wú)菌苗下胚軸在切成0．5 cm左右，搖動(dòng)10-15 min。然后用滅過(guò)菌的濾紙吸干下胚軸表面的農(nóng)桿菌，置于不含抗生素的共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3 d，共培養(yǎng)結(jié)束后將下胚軸轉(zhuǎn)入含50 mg·L-1G418和250 mg·L-1Cef的下胚軸分化增殖的篩選培養(yǎng)基中，在(25±2)℃，14 h/10 h光周期條件下培養(yǎng)45 d，每15 d繼代一次。當(dāng)分化出抗性小芽后，將抗性小芽轉(zhuǎn)接到加有篩選抗生素G418的加有Cef的分化增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行分化增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)一定量的抗性小芽后，將抗性小芽轉(zhuǎn)入芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。待小苗長(zhǎng)至3-4 cm左右時(shí)，從基部切成單株，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基中同樣加有G418。

1．2．5 再生植株的PCR檢測(cè) 用目的基因特異性引物進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物在含EB的1．2%的瓊脂糖凝膠上電泳25-30 min，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。根據(jù)AtNDPK2基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物1:5'-CACCATGGTGGGAGCGACT-3';引物2:5'-TCTGTCTAGACAAGGATCA-3'，擴(kuò)增的目的片段大小為540 bp，擴(kuò)增時(shí)以未轉(zhuǎn)化植株葉片DNA作為陰性對(duì)照，質(zhì)粒DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2．1 選擇培養(yǎng)基中抗生素的種類和篩選濃度的確定

選取雙亞7號(hào)培養(yǎng)5 d的無(wú)菌苗下胚軸，分別接種到含不同濃度Kan和G418的下胚軸分化增殖培養(yǎng)基上，15 d繼代一次，30 d后統(tǒng)計(jì)下胚軸的分化增殖情況，結(jié)果如圖1所示。

圖1 選擇培養(yǎng)基中抗生素的種類和濃度對(duì)增殖系數(shù)的影響Fig．1 Effect of type and concentration of antibiotic in selective media on proliferation coefficient

由圖中可以看出，兩種抗生素對(duì)亞麻下胚軸分化增殖的影響差異很大，其中G418濃度為50 mg·L-1時(shí)，培養(yǎng)30 d后，下胚軸已經(jīng)枯死;而對(duì)Kan來(lái)說(shuō)，隨著濃度的增加，增殖系數(shù)略有下降，但從方差分析來(lái)看，從0、50、100、150 mg·L-1之間，增殖系數(shù)沒(méi)有顯著性差異，0、50、100 mg·L-1與200 mg·L-1之間有顯著性差異，150與200 mg·L-1之間無(wú)顯著性差異。當(dāng)Kan濃度增加到200 mg·L-1時(shí)，增殖系數(shù)仍為6．35，因此Kan不適合做為亞麻篩選的抗生素，選擇G418做為篩選抗生素，篩選濃度為50 mg·L-1。

2．2 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)亞麻遺傳轉(zhuǎn)化的影響

轉(zhuǎn)化前的預(yù)培養(yǎng)對(duì)于植物遺傳轉(zhuǎn)化具有重要意義，本試驗(yàn)對(duì)亞麻下胚軸分別進(jìn)行了0、1、2、3、4、5 d的預(yù)培養(yǎng)，45 d后統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化率(轉(zhuǎn)化率=產(chǎn)生抗性芽的個(gè)數(shù)/接種的下胚軸總數(shù))結(jié)果如圖2。

從圖中可以看出，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率有一定的影響，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中培養(yǎng)2 d時(shí)下胚軸轉(zhuǎn)化率最高為7%，其次是培養(yǎng)3d時(shí)的轉(zhuǎn)化效率為6%，但從方差分析可以看出，培養(yǎng)2 d和培養(yǎng)3 d轉(zhuǎn)化率沒(méi)有顯著性差異，但與其它的培養(yǎng)時(shí)間0，1，4，5 d均存在顯著性差異。因此本試驗(yàn)選擇預(yù)培養(yǎng)2 d進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

圖2 不同的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)亞麻下胚軸轉(zhuǎn)化率的影響Fig．2 Effect of different pretreatment time on conversion percent of flax hypocotyl

2．3 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)在整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程中是非常重要的環(huán)節(jié)，因?yàn)檗r(nóng)桿菌的附著、T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合都在這個(gè)時(shí)期內(nèi)完成，因此確定共培養(yǎng)條件是轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵。最佳共培養(yǎng)時(shí)間的確定，一方面使農(nóng)桿菌附著外植體表面后在創(chuàng)傷部位生存一定時(shí)間后能夠誘發(fā)腫瘤，因此共培養(yǎng)時(shí)間不能太短，但也不宜太長(zhǎng)，否則，可能會(huì)由于農(nóng)桿菌的過(guò)度生長(zhǎng)而使植物細(xì)胞受到毒害而死亡，不死亡也會(huì)在后續(xù)培養(yǎng)中難以抑制。因此確定一個(gè)適宜的共培養(yǎng)時(shí)間是一個(gè)好的轉(zhuǎn)化體系所必須的。試驗(yàn)結(jié)果圖3所示。

圖3 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)亞麻下胚軸轉(zhuǎn)化率的影響Fig．3 Effect of co-culture time on conversion percent of flax hypocotyl

從圖中可以看出，外植體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率有較大的影響，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的增加轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)共培養(yǎng)3 d時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高達(dá)20．45%，不進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)化的率為0，原因是因?yàn)檗r(nóng)桿菌附著在外植體表面并不能立刻轉(zhuǎn)化，只有在創(chuàng)傷部位生存8-16 h之后的菌株才能誘發(fā)腫瘤。超過(guò)3 d后轉(zhuǎn)化率下降，是因?yàn)楣才囵B(yǎng)后在篩選培養(yǎng)基中有的外植體死亡，有的長(zhǎng)出農(nóng)桿菌，因此導(dǎo)致總的轉(zhuǎn)化率降低。從方差分析可以看出，共培養(yǎng)3 d與其它共培養(yǎng)時(shí)間的轉(zhuǎn)化率之間存在顯著性差異，因此選擇3d做為共培養(yǎng)的最佳時(shí)間。

2．4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)AtNDPK2基因的轉(zhuǎn)化及植株再生

將雙亞7號(hào)培養(yǎng)5 d苗齡的亞麻，下胚軸切成0．5 cm左右，放在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后，取出放于OD0．6-0．8的農(nóng)桿菌菌液中搖動(dòng)10-15 min。然后用滅過(guò)菌的濾紙吸干下胚軸表面的農(nóng)桿菌，置于不含抗生素的共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3 d，共培養(yǎng)結(jié)束后將下胚軸轉(zhuǎn)入含50 mg·L-1G418和300 mg·L-1Cef的下胚軸分化增殖的篩選培養(yǎng)基中。當(dāng)培養(yǎng)30 d左右，下胚軸大部分形成的愈傷組織及分化的小芽死亡，只有少數(shù)的小芽能夠繼續(xù)存活(圖4A)，存活率能達(dá)到23．5%。將抗性小芽轉(zhuǎn)接到芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抗性小芽長(zhǎng)高(圖4B)，將其分成單株接種到加有50 mg·L-1的G418生根培養(yǎng)基中，10 d左右能長(zhǎng)出大約15條/株的根，形成抗性植株(圖4C)。

圖4 G418抗性植株的生長(zhǎng)過(guò)程Fig．4 Growth process of Resistance plant G418

2．5 亞麻抗性植株的PCR檢測(cè)

對(duì)獲得的抗性植株，經(jīng)過(guò)繼代增殖培養(yǎng)及伸長(zhǎng)生長(zhǎng)培養(yǎng)后，對(duì)獲得的6個(gè)株系的組培苗進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因檢測(cè)。使用無(wú)菌苗的葉片提取基因組DNA，用AtNDPK2的特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，來(lái)擴(kuò)增目的基因特異性片段。結(jié)果有4個(gè)株系擴(kuò)增出了目的條帶，陽(yáng)性率為66．67%。檢測(cè)的圖片見(jiàn)圖5。

圖5 亞麻轉(zhuǎn)AtNDPK2基因抗性植株P(guān)CR電泳圖Fig．5 PCR profile of transgenetic resistance plant withAtNDPK2

從圖2可知，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶，lane 1～6是抗性植株的擴(kuò)增情況，其中1，4，5，6與陽(yáng)性質(zhì)粒DNA擴(kuò)增出的帶與AtNDPK2基因大小相符，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1，4，5，6株系A(chǔ)tNDPK2基因已轉(zhuǎn)入亞麻基因組中。而2，3株系未擴(kuò)增出目的條帶，AtNDPK2基因未轉(zhuǎn)化成功。

3 討論

本研究中植物表達(dá)載體上攜帶有目前植物基因工程中使用最廣泛的篩選基因nptⅡ基因，nptⅡ基因編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，若該基因整合進(jìn)亞麻基因組中，它能使Kan(卡那霉素)、geneticin(G418)、Neo(新霉素)等氨基糖苷類抗生素磷酸化，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞以及再生植株具有抗這三種抗生素的能力［6］。Jin-Zhuo Dong等對(duì)亞麻的兩種篩選抗生素進(jìn)行了比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，亞麻下胚軸對(duì)Kan和G418顯示出兩種不同的反應(yīng)，Kan是一個(gè)比G418溫和的篩選劑［7］。這一結(jié)果在桃的遺傳轉(zhuǎn)化中也有類似的報(bào)告［8］。但國(guó)內(nèi)研究者的報(bào)道與以上結(jié)果有所不同，李學(xué)寶等人在對(duì)亞麻下胚軸進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究時(shí)發(fā)現(xiàn)在含Kan50 mg·L-1的選擇培養(yǎng)基上篩選獲得Kan抗性苗，并檢測(cè)到GUS基因活性表達(dá)［9］。王玉富等在利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行亞麻轉(zhuǎn)基因研究時(shí)，在篩選培養(yǎng)基中加入了50 mg·L-1的Kan和1 000 mg·L-1的頭孢霉素［10］。本試驗(yàn)中對(duì)兩種篩選抗生素Kan和G418也進(jìn)行了比較研究，當(dāng)Kan濃度增加到200 mg·L-1時(shí)，亞麻的增殖系數(shù)仍為6．35，因此Kan不適合做為亞麻篩選的抗生素。G418濃度為50 mg·L-1時(shí)，培養(yǎng)30d后，下胚軸已經(jīng)枯死，因此選擇G418做為篩選抗生素，篩選濃度為50 mg·L-1，此結(jié)果與前人報(bào)道在濃度上有所差異，這應(yīng)該與不同的亞麻基因型、外植體，甚至不同的試劑有關(guān)。

一般認(rèn)為預(yù)培養(yǎng)對(duì)外植體的轉(zhuǎn)化是有利的，它可以促進(jìn)外植體細(xì)胞分裂，分裂狀態(tài)的細(xì)胞會(huì)更容易整合外源DNA，從而提高外源基因的轉(zhuǎn)化率［11］。姬妍茹等的研究發(fā)現(xiàn)，是否進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)直接影響著受體的一周成活率，外植體子葉和下胚軸的GUS瞬時(shí)表達(dá)率在預(yù)培養(yǎng)2 d后開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，雖然不進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)有100%的GUS瞬時(shí)表達(dá)，但外植體生長(zhǎng)狀態(tài)不佳，成活率低，難于進(jìn)行再分化［12］。Bretagne-Sagnard等人在GUS染色試驗(yàn)的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，預(yù)培養(yǎng)和剝皮同樣能夠使瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率提高［13］。Dong等人在試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)未經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的下胚軸切口兩端有較強(qiáng)的染色效果，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)6天的染色強(qiáng)度反而降低［14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)培養(yǎng)對(duì)轉(zhuǎn)化率是有影響的，預(yù)培養(yǎng)2-3d為最佳時(shí)間，當(dāng)?shù)陀诨蚋哂谶@一時(shí)間時(shí)，轉(zhuǎn)化率都會(huì)有所下降，這與前人的研究結(jié)果稍有差異。

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