胡海星，張仕超，朱 旋，范雄偉*

(1．長(zhǎng)沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410004;2．湖南師范大學(xué) 蛋白質(zhì)化學(xué)及魚(yú)類發(fā)育生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 心臟發(fā)育研究中心，湖南 長(zhǎng)沙410081)

我國(guó)結(jié)直腸癌死亡率位于惡性腫瘤死亡率的第四位，且發(fā)病率一直呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類健康。結(jié)直腸癌的發(fā)生與飲食、環(huán)境、遺傳等因素密切相關(guān)，其發(fā)病機(jī)理一直以來(lái)是腫瘤研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，Tgfβ信號(hào)通路在結(jié)直腸癌中發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用以被人所熟知，但在人類結(jié)直腸癌發(fā)生中具體分子機(jī)制和貢獻(xiàn)大小還遠(yuǎn)未闡明。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factor)超家族是一類包含了相似結(jié)構(gòu)、功能的多肽生長(zhǎng)因子，其中包括TGF－βs、生長(zhǎng)分化因子(Growth and differentiation factor，GDFs)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)等30多個(gè)成員［1，2］。這些配體分子總是先結(jié)合并激活膜上的二型受體(TgfβRⅡ，BmpRⅡ)，二型受體招募一型受體(TgfβRI，BmpRI)二聚化而磷酸化下游的R－Smads(Smad1，2，3，5，8)，進(jìn)而與co－Smad(Smad4)結(jié)合，以異源多聚體的形式，共同入核調(diào)節(jié)下游如P27、P21、BIM等靶基因，對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、免疫和炎癥發(fā)揮重要作用。而I－Smads(Smad6、Smad7)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合一型受體而抑制R－Smads的活化，由于多數(shù)CKI與抑癌基因均為T(mén)gfβ下游靶點(diǎn)。所以Tgfβ信號(hào)被廣泛的認(rèn)為是抗癌信號(hào)。誠(chéng)然，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，腸的組織或者細(xì)胞中 缺 失Smad4［3－6］、Smad3［7］、BMPR1［8］、TgfβRI［9］由于逃避了Tgfβ信號(hào)的控制，均能發(fā)展為癌，而TgfβRII［10－12］與GDF15［13，14］缺失的小鼠，雖然不能直接發(fā)展成癌，但對(duì)結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移與耐藥方面產(chǎn)生重要貢獻(xiàn)。在以往的報(bào)道中，幾乎所有的經(jīng)典Tgfβ信號(hào)超家族的成員均無(wú)一例外的呈現(xiàn)出其抑癌作用，并且，具有抑制經(jīng)典信號(hào)的Smad7在結(jié)直腸癌發(fā)生恰好表現(xiàn)為促癌作用。盡管這樣，這并不能證明在人類結(jié)直腸癌發(fā)生就是源自于Tgfβ信號(hào)喪失。Abadie C［15］等表明，TgfβRI與直腸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)并無(wú)關(guān)系，F(xiàn)ukushima T［16］等在人類直腸癌突變分析中也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Smad2，Smad3，Smad6，Smad7的改變。此外，在腸癌的發(fā)生當(dāng)中Tgfβ信號(hào)成員也并不是表現(xiàn)為一致性的下調(diào)，比如Tgfβ1、Tgfβ2在腸癌中就呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，且表達(dá)水平與惡性程度相關(guān)。顯而易見(jiàn)，基于基因敲除或者轉(zhuǎn)基因技術(shù)，雖然可以逐一的分揀出Tgfβ信號(hào)通路各個(gè)成員對(duì)腫瘤發(fā)生的功能。但是反向遺傳學(xué)的手段卻人為的改變的發(fā)病的始動(dòng)因素，無(wú)法真實(shí)吻合發(fā)病的分子事件。所以并不能解決腫瘤的發(fā)病機(jī)制從而也很難尋找到干預(yù)疾病的真實(shí)方法。除此以外，同一信號(hào)通路中的各個(gè)成員，在發(fā)揮功能的同時(shí)存在上下游的相互依存關(guān)系。當(dāng)某些下游的分子發(fā)生改變時(shí)，上游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)將極有可能重新建立新的傳導(dǎo)通路。在Tgfβ信號(hào)通路中，有報(bào)道經(jīng)典的信號(hào)通道在受體環(huán)節(jié)受阻將激活非經(jīng)典信號(hào)通道，其間涉及到RAS、MAPK、AKT等，而這些信號(hào)恰好與經(jīng)典的Tgfβ信號(hào)通路相反，他們經(jīng)常作為癌基因和促癌因子被報(bào)道。所以真實(shí)病理情況下，Tgfβ信號(hào)在腸癌的發(fā)生發(fā)展中作用比人想象的要復(fù)雜的多。為了了解Tgfβ信號(hào)在腸癌的發(fā)生中的真實(shí)作用，需要有一種系統(tǒng)的方法，首先在腸癌的發(fā)生早期病理標(biāo)本中，全面檢測(cè)所有Tgfβ信號(hào)成員的變化，然后依據(jù)各自不同功能，才可能推測(cè)Tgfβ信號(hào)通路在腸癌的發(fā)生中真實(shí)的作用機(jī)制。

本文通過(guò)生物信息學(xué)的方法，獲取已經(jīng)報(bào)道的腸癌早期芯片結(jié)果，在轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)了27個(gè)Tgfβ經(jīng)典信號(hào)成員的表達(dá)變化關(guān)系。發(fā)現(xiàn)在腸癌的發(fā)生早期，Smad2 Smad4的下調(diào)阻斷經(jīng)典的Tgfβ信號(hào)的抗腫瘤作用，同時(shí)配體分子GDF2 GDF3和受體分子Tgfbr2、Tgfbr3的廣泛上調(diào)可能刺激旁路分子的激活導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

1 材料與方法

1．1 材料

所有結(jié)直腸癌有關(guān)的全基因組表達(dá)芯片數(shù)據(jù)均來(lái)源于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www．ncbi．nlm．gov/geo/)。本研究中設(shè)定搜索關(guān)鍵詞為“colorectal cancer”，限制研究類型為“expression profiling by array”

1．2 方法

1．2．1 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn) 符合以下標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)集將納入研究對(duì)象①數(shù)據(jù)集必須是有文獻(xiàn)支持的全基因組mRNA表達(dá)芯片數(shù)據(jù);②每套數(shù)據(jù)均有腸癌疾病組織和正常組織對(duì)照;③本次均考慮原始或者經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)集;④每套數(shù)據(jù)集必須包括3個(gè)以上樣本;⑤數(shù)據(jù)集采用的樣本必須是人體活檢腸癌組織。根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，總共篩選到12組符合標(biāo)準(zhǔn)的基因芯片數(shù)據(jù)。

1．2．2 數(shù)據(jù)處理 在GEO的supplementary file中下載基因芯片的CEL數(shù)據(jù)壓縮包，并解壓至一個(gè)文件夾中待用，同時(shí)下載TXT格式的樣本原始數(shù)據(jù);若下載數(shù)據(jù)處沒(méi)有顯示CEL數(shù)據(jù)壓縮包，則在scope、format、amount中分別選擇samples、soft、full下載該樣本TXT格式的原始數(shù)據(jù)，通過(guò)UltralEdit軟件處理的soft文件顯示基因的名稱，每套樣本數(shù)據(jù)的基本信息記錄在提供的excel里。采用每一個(gè)數(shù)據(jù)組跟正常組平均值進(jìn)行比較對(duì)樣本進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1．2．3 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)KEGG中Tgfβ信號(hào)通路成員的信息，在24組基因芯片結(jié)果中篩選出共同研究基因，使用T－TEST函數(shù)計(jì)算每一個(gè)基因表達(dá)差異的顯著性，P＜0．05，則表示差異具有顯著性意義。最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后的平均數(shù)值統(tǒng)計(jì)其上下調(diào)基因。

2 結(jié)果

2．1 利用生物信息學(xué)在芯片中獲取待測(cè)Tgfβ信號(hào)通路成員的表達(dá)數(shù)據(jù)

根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)，最終篩選出12組基因芯片結(jié)果。利用KEGG選擇Tgfβ信號(hào)通路共27經(jīng)典通路的成員，在12組釣取所有成員基因芯片結(jié)果數(shù)據(jù)，與12個(gè)正常組芯片的平均值，獲得每一組芯片該成員分子相對(duì)表達(dá)量信息，羅列于表1。

表1 Tgfβ信號(hào)通路分子在早期結(jié)直腸癌芯片中表達(dá)變化Tab．1 The changes of Tgfβsignaling pathway factor in the microarray of early colorectal cancer

2．2 Tgfβ信號(hào)通路中成員在人類早期結(jié)直腸癌的表達(dá)差異分析

對(duì)篩選27個(gè)基因進(jìn)行差異性分析，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比在心臟疾病中，顯著性上調(diào)基因包括TGFβR2、TGFβR3、GDF3(P＜0．05)，GDF2也有上調(diào)的趨勢(shì)(P=0．051)顯著性下調(diào)基因有Smad2、GDF15(P＜0．05)，Smad4也有下調(diào)的趨勢(shì)(P=0．057)，其他成員均有下調(diào)或者上調(diào)現(xiàn)象但均未達(dá)到顯著性意義，(圖1)

圖1 統(tǒng)計(jì)分析基因的表達(dá)水平(*P＜0．05#P＜0．06)Fig．1 Statistical Analysis determined the levels of gene expression

3 討論

Tgfβ信號(hào)通路的經(jīng)典成員具有抑制結(jié)腸癌的功能，但在人類結(jié)腸癌的發(fā)生過(guò)程當(dāng)中Tgfβ信號(hào)通路是否真正參與其中，這需要系統(tǒng)性對(duì)整個(gè)信號(hào)通路成員在結(jié)腸癌的發(fā)生早期病理標(biāo)本中，檢測(cè)所有各成員的表達(dá)變化關(guān)系，才能找到Tgfβ信號(hào)通路調(diào)節(jié)結(jié)腸癌發(fā)生的線索為臨床早期診斷、干預(yù)帶來(lái)積極效應(yīng)。廣泛的收集人類早期結(jié)腸癌標(biāo)本，并通過(guò)常規(guī)的分子生物學(xué)檢測(cè)所有成員的表達(dá)變化并不是一件容易的事。但是生物信息學(xué)的發(fā)展，使我們能在數(shù)據(jù)庫(kù)中直接看到一個(gè)標(biāo)本在全轉(zhuǎn)錄本中的表達(dá)變化，而這些已發(fā)表的芯片數(shù)據(jù)結(jié)果其一致性和可靠性已經(jīng)過(guò)了同行的審驗(yàn)與認(rèn)可，但是提供芯片數(shù)據(jù)的作者往往只關(guān)注其自身的科學(xué)問(wèn)題，而芯片內(nèi)含的其他方面數(shù)據(jù)價(jià)值卻被擱置。所以從以往的數(shù)據(jù)中提出新問(wèn)題，得到新結(jié)論，是一種值得去做的工作。且從別人的數(shù)據(jù)中得到支持自己的證據(jù)，由于排除了主觀的傾向性，二度利用的數(shù)據(jù)比首次利用更為客觀?；诖耍覀冋业?2組符合納入標(biāo)準(zhǔn)的早期結(jié)腸癌芯片，并發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌早期Tgfβ信號(hào)通路的經(jīng)典成員的Smad2 Smad4表達(dá)下降，而Tgfbr 2 Tgfbr 3 GDF3 GDF2上調(diào)。研究表明，Smad4存在明顯的抗癌作用［3］，缺失了Smad4的小鼠，導(dǎo)致嚴(yán)重的腸癌［4］，結(jié)腸癌細(xì)胞中喪失了Smad4將容易發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移［5］。當(dāng)Smad4表達(dá)下降時(shí)，有可能導(dǎo)致經(jīng)典的Tgfβ信號(hào)喪失效應(yīng)，而與此同時(shí)Tgfbr 2 Tgfbr 3 GDF3 GDF2上調(diào)也有可能不再轉(zhuǎn)導(dǎo)經(jīng)典的信號(hào)，而激活旁路。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Smad4缺失時(shí)，BMP信號(hào)將會(huì)激活Rho AKT信號(hào)［17－19］，而促進(jìn)腫瘤形成。由此根據(jù)我們結(jié)果，我們推測(cè)在結(jié)腸癌早期，一方面，Smad2 Smad4的下調(diào)阻斷經(jīng)典的Tgfβ信號(hào)的抗腫瘤作用，另一方面，配體分子GDF2 GDF3和受體分子Tgfbr2、Tgfbr3的廣泛上調(diào)可能刺激旁路分子的激活從在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用(圖2)。提示旁路的抑制與經(jīng)典通路的重新激活的聯(lián)合策略有可能在干預(yù)早期結(jié)腸癌帶來(lái)貢獻(xiàn)。

圖2 Tgfβ信號(hào)通路在結(jié)腸癌發(fā)生中的作用機(jī)制Fig．2 The roles of Tgfβsignaling pathway in the occurrence of colorectal cancer

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