陳 琛 王發(fā)秀② 張賽樂(lè) 閆茂倉(cāng) *③ 柴雪良 於俊琦 謝起浪

（①浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 浙江省近岸水域生物資源開(kāi)發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江 溫州 325005 ②溫州醫(yī)科大學(xué)生命科技學(xué)院 浙江 溫州 ③寧波大學(xué)海洋學(xué)院 浙江 寧波）

中草藥具有天然、高效、毒副作用小、抗藥性不顯著、資源豐富以及性能多樣等優(yōu)點(diǎn)，不但能直接抑菌還能提高水產(chǎn)動(dòng)物的抗病力，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用越來(lái)越受到關(guān)注。目前多見(jiàn)中草藥防治魚類疾病的研究報(bào)道，而關(guān)于中草藥防治南美白對(duì)蝦致病菌的應(yīng)用報(bào)道還不多[11]。本研究采用體外抑菌法從23味中草藥中篩選抑制南美白對(duì)蝦致病弧菌的中草藥，旨在為中草藥在防治南美白對(duì)蝦弧菌病中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中草藥 試驗(yàn)用的23種中草藥為艾葉、白術(shù)、黃連、牡丹皮、甘草、訶子、烏梅、五倍子、魚腥草、黃柏、肉蓯蓉、茯苓、連翹、大黃、金銀花、豬苓、板藍(lán)根、黃芪、杜仲、貫眾、黃芩、柴胡和山豆根，均購(gòu)自浙江省溫州市中醫(yī)院。

1.1.2 致病弧菌 4種南美白對(duì)蝦致病菌菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。分別是DX1203(副溶血弧菌)、DX1304(哈氏弧菌)、DX0901(鰻弧菌)和DX0801(需鈉弧菌)。

1.2 方法

1.2.1 藥液的制備 稱取艾葉等23味中草藥各25g，切細(xì)研磨，加250mL蒸餾水，煮沸30min,過(guò)濾，藥渣再加水250ml，煮沸30min，過(guò)濾，合并2次濾液，加熱蒸發(fā)濃縮至25ml，使生藥含量為1g/ml。4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液的制備 將冷藏的四種弧菌(與牛奶混合冷凍)取部分于ZOBELL2216E液體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)24h，移取200μl 加 入ZOBELL2216E 液 體 培 養(yǎng) 基 中 培 養(yǎng)28℃培 養(yǎng)24h，用液體培養(yǎng)基作1:100倍稀釋后備用，供試菌液濃度在1×106CFU/ml。

1.2.3 最小抑菌濃度(mIC)的測(cè)定 首先配置ZOBELL液體培養(yǎng)基，然后每味中草藥組取150×15mm無(wú)菌試管10支，并另取2管做陰陽(yáng)對(duì)照，每支試管加入10ml液體培養(yǎng)基。以10ml移液槍移取已制備好的藥液5ml加入第一管中，混勻后吸取5ml加入第二管中，依次倍比稀釋至第10管，棄去5ml。重復(fù)上述操作做為觀察對(duì)照組。118℃滅菌15min。1～10管以及陽(yáng)性對(duì)照管加入菌液100μl，混勻，28℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果，對(duì)照組和陰性對(duì)照管不加菌，凡是與對(duì)照組比較藥物最高稀釋廣眾清澈透明、無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者，該管的濃度即為該菌mIC。

1.2.4 最小殺菌濃度(mBC)的測(cè)定 在mIC實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，從無(wú)明顯細(xì)菌生長(zhǎng)的各管取材，分別分別涂布于相應(yīng)的TCBS平板培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。瓊脂平板上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)且含藥液最少的一管的藥液濃度，即為該種藥物對(duì)該菌的mBC。

2 結(jié)果與分析

2.1 23種中草藥對(duì)副溶血弧菌DX1203的抑菌效果

23味中草藥對(duì)副溶血弧菌DX1203的抑菌效果如表1所示。各組中草藥均有一定的抑菌效果，以相同量的藥物提取液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，抑菌效果強(qiáng)弱不同；其中五倍子，訶子，黃芩和大黃抑菌效果最好，mIC分別為0.06、0.036、0.98和0.98mg/ml；mBC也以這四味最低，分別為0.12、0.24、0.98和1.95mg/ml。烏梅、艾葉、連翹、黃連、牡丹皮和金銀花等也表現(xiàn)出了較高的抑菌和殺菌能力，但濃度稍高于上述四味中草藥，抑菌濃度為1.95～3.91mg/ml，殺菌濃度為3.91～15.63mg/ml。

表1 23味中草藥對(duì)副溶血弧菌DX1203的mIC、mBC (mg/ml)

2.2 23種中草藥對(duì)哈氏弧菌DX1304的抑菌效果

23味中草藥對(duì)哈氏弧菌DX1304的抑菌效果如表2所示。各組中草藥均有一定的抑菌效果，以相同量的藥物提取液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，抑菌效果強(qiáng)弱不同；其中五倍子，訶子，黃芩和大黃抑菌效果最好，mIC 分別為0.001、0.03、0.49和0.24mg/ml；mBC也以這四味最低，分別為0.008、0.24、0.98和0.98mg/ml。烏梅、艾葉、連翹、黃連、牡丹皮和金銀花等也表現(xiàn)出了較高的抑菌和殺菌能力，但濃度稍高于上述四味中草藥，抑菌濃度為1.95～7.81mg/ml，殺菌濃度為1.95～62.50mg/ml。

表2 23味中草藥對(duì)哈氏弧菌DX1304的mIC、mBC (mg/ml)

2.3 23種中草藥對(duì)鰻弧菌DX0901的抑菌效果

23味中草藥對(duì)鰻弧菌DX0901的抑菌效果如表3所示。各組中草藥均有一定的抑菌效果，以相同量的藥物提取液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，抑菌效果強(qiáng)弱不同；其中五倍子，訶子，黃芩和大黃抑菌效果最好，mIC分別為0.24、0.49、0.98和1.95mg/ml；mBC也以這四味最低，分別為0.24、0.49、0.98和1.95mg/ml。烏梅、艾葉、連翹、黃連、牡丹皮和等也表現(xiàn)出了較高的抑菌和殺菌能力，但濃度稍高于上述四味中草藥，抑菌濃度為3.91～7.81mg/ml，殺菌濃度為1.95～7.81mg/ml。

表3 23味中草藥對(duì)鰻弧菌DX0901的mIC、mBC (mg/ml)

2.4 23種中草藥對(duì)需鈉弧菌DX0801的抑菌效果

23味中草藥對(duì)需鈉弧菌DX0801的抑菌效果如表4所示。各組中草藥均有一定的抑菌效果，以相同量的藥物提取液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，抑菌效果強(qiáng)弱不同；其中五倍子，訶子，黃芩和大黃抑菌效果最好，mIC 分別為0.001、0.004、0.49和1.95mg/ml；mBC也以這四味最低，分別為0.015、0.49、0.98和3.91mg/ml。烏梅、艾葉、連翹、黃連、牡丹皮、金銀花、柴胡、貫眾和黃芪等也表現(xiàn)出了較高的抑菌和殺菌能力，但濃度稍高于上述四味中草藥，抑菌濃度為1.95～7.81mg/ml，殺菌濃度為1.95～ 7.81mg/ml。

表4 23味中草藥對(duì)鈉需弧菌DX0801的mIC、mBC (mg/ml)

3 討論

本研究結(jié)果顯示，在試驗(yàn)條件相同的情況下，五倍子、訶子、黃芩和大黃對(duì)凡納濱對(duì)蝦哈氏弧菌、副溶血弧菌、鰻弧菌和需鈉弧菌等幾種致病弧菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果，說(shuō)明這些中草藥中含有可以抑制甚至殺滅弧菌的有效成分。因此采用中草藥來(lái)預(yù)防上述幾種致病弧菌引起的凡納濱對(duì)蝦細(xì)菌性疾病是確實(shí)可行的。其中以五倍子的抑菌效果最佳，表明五倍子是23味中草藥中最佳的用于防治南美白對(duì)蝦弧菌病的藥物。4種致病菌中需鈉弧菌的藥物敏感性最好，藥物抑菌濃度最低。從抑菌效果可以看出，各組藥物提取液對(duì)弧菌的抑菌效果差別較大，這與各組藥物的成分組成和含量不同有關(guān)。中草藥具有廉價(jià)、來(lái)源廣、低毒、副作用小、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，且藥中某些成分既有抗菌作用，又有免疫作用，能改善機(jī)體的免疫狀態(tài)，提高自身抗菌能力。本研究為進(jìn)行中草藥提升免疫力、篩選出具有研究應(yīng)用價(jià)值的中草藥提供了基礎(chǔ)。

[1]劉紅柏.中草藥免疫增強(qiáng)劑的研究現(xiàn)狀及其在水產(chǎn)上的應(yīng)用[J].水產(chǎn)學(xué)雜志, 2002, 15(2): 91-95.

[2]王亮, 吳立新.中草藥添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用及存在問(wèn)題[J].中國(guó)飼料, 2005(2): 28-29.

[3]Citarasu T.Herbal biomedicines: a new opportunity for aquaculture industry [J].Aquacul Intern, 2009, 18(3): 403-414.

[4]閆茂倉(cāng), 陳少波, 單樂(lè)州等.22 味中草藥對(duì)創(chuàng)傷弧菌和燦爛弧菌體外抑菌作用篩選[J].水生態(tài)學(xué)雜志, 2010, 3(2): 95-98.

[5]Ardó L , Yin GJ , Xu P , et al.Chinese herbs (Astragalus membranaceus and Lonicera japonica) and boron enhance the non-specific immune response of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) and resistance against Aeromonas hydrophila.Aquaculture 2008;275: 26–33.

[6]Wang T, Sun Y, Jin L, et al.Enhancement of non-specific immune response in sea cucumber (Apostichopus japonicus) by Astragalus membranaceus and its polysaccharides[J].Fish Shellfish Immunol, 2009, 27(6): 757-762.

[7]Yin G, Ardó L, Thompson K, et al.Chinese herbs (Astragalus radix and Ganoderma lucidum) enhance immune response of carp, Cyprinus carpio, and protection against Aeromonas hydrophila[J].Fish Shellfish Immunol, 2009, 26(1): 140-145.

[8]Wang X, Ding L, Yan m, et al.Polysaccharides, Saponins and Water decoction of Astragalus membranaceus significantly enhance the nonspecific immune response in Spotted maigre (Nibea albifiora) [J].Israeli J Aquacul, IIC: 63.2012.743.

[9]陳孝煊, 吳志新, 殷居易等.大黃、穿心蓮、板藍(lán)根和金銀花對(duì)異育銀鯽免疫功能的影響[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2003, 10(1): 36-40.

[10]劉紅柏, 張穎, 盧彤巖等.飼料中添加中草藥對(duì)鯉魚免疫功能的影響[J].集美大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 9(4): 317-321.

[11]郭文婷, 李健.中草藥制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)及血淋巴中免疫因子的影響[J].飼料工業(yè), 2005, 26(6): 6-10.

[12]馬建鳳, 劉華鋼, 朱 丹.中藥體外抑菌研究的方法學(xué)進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究, 2010, 33(1): 42-45.

[13]王吉橋, 孫永新, 張劍誠(chéng).金銀花等復(fù)方草藥對(duì)牙鲆生長(zhǎng)、消化和免疫能力的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2006, 30(1): 90-96.

[14]顧雪飛, 陳玉春, 劉敏.中草藥對(duì)鯉血清和免疫器官溶菌酶活性的影響[J].淡水漁業(yè), 2007, 37(2): 30-33.

[15]孫兆峰, 王雷.中國(guó)明對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦血清酚氧化物酶活性的研究[J].高技術(shù)通訊, 2001, 12(11): 24-27.