何泳志，李大文，黃悅悅，肖 鑫，毛獻(xiàn)寶，龔國通

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧530001；2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)與遺傳中心，南寧530021）

據(jù)統(tǒng)計，有10%～15%的夫婦不孕不育，其中梗阻性無精子癥是男性不育癥的一個難題。近年來發(fā)展起來的經(jīng)皮附睪穿刺抽吸術(shù)（percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA）及睪丸穿刺抽吸術(shù)（testicular sperm aspiration，TESA）獲取精子行卵胞漿內(nèi)單精子注射術(shù)（ICSI）助孕為梗阻性無精子癥患者帶來了福音。本文對比分析睪丸與附睪精子行ICSI的結(jié)局及精子DNA完整率（用精子DNA斷裂指數(shù)DFI表示）的差異，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究回顧性分析2012年6月至2013年12月183例梗阻性無精子癥患者，其中行TESA取精80例，行PESA取精103例。梗阻性無精子癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)3次或3次以上精液常規(guī)檢查并經(jīng)過離心后確認(rèn)，精子數(shù)為0；（2）血漿促卵泡激素（FSH）正常；（3）睪丸活檢中存在精子；（4）睪丸體積大于30mL或單側(cè)體積大于15mL；（5）排除其他診斷。B超和性激素示女方卵巢功能正常。兩組患者男方年齡、女方年齡、男方睪丸體積、睪酮及FSH值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

1.2 方法

1.2.1 PESA 患者取仰臥位，常規(guī)消毒、鋪巾，固定附睪頭，4.5mL注射器吸入少量COOK精子洗滌液后直視下經(jīng)皮穿刺附睪，負(fù)壓抽吸同時緩慢后退，至有淡黃渾濁附睪液體抽出。若未見液體抽出，可改變穿刺方向重復(fù)抽吸。將抽吸出的附睪液注入小培養(yǎng)皿，在倒置顯微鏡下尋找活動的成熟精子。若提取液中無精子或無活動精子，則行對側(cè)附睪穿刺。如仍無精子，考慮行TESA。

1.2.2 TESA 術(shù)前準(zhǔn)備同PESA，術(shù)者用左手緊握固定一側(cè)睪丸，在穿刺點(diǎn)用1%利多卡因局部麻醉，右手握12號針經(jīng)皮穿刺睪丸，由助手用60.0mL注射器吸取2mL COOK精子洗滌液，接上針頭，抽吸，保持負(fù)壓，直至吸取睪丸組織液和少量曲細(xì)精管，注入含COOK精子洗滌液的培養(yǎng)皿中。如找不到精子，可改變頭皮針方向多點(diǎn)穿刺術(shù)。磨碎取出組織，于倒置顯微鏡下觀察精子。

1.2.3 精子DNA完整性檢測 精子DNA的檢測采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗。主要染色試劑為瑞氏－姬姆薩（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）。1×400倍顯微鏡下觀察，每個高倍鏡視野大于或等于1條精子可以觀察精子光暈大小（每個視野精子數(shù)小于1條則不檢測）。根據(jù)光暈與精子頭部橫徑的比例，粗分為大、中、小和無光暈4個等級，大和中光暈表示精子DNA完整無碎片，小和無光暈表示精子DNA斷裂為碎片。小光暈以精子頭直徑小于或等于1/4為判斷標(biāo)準(zhǔn)；中光暈精子頭直徑：＞1/4～2/3；大光暈精子直徑大于2/3。

表1 兩組患者一般情況比較（±s）

表1 兩組患者一般情況比較（±s）

（ ）（ ）（mL）（n/dL） FSH（IU/組別 周期數(shù)（n） 男方年齡 歲 女方年齡 歲 睪丸體積 睪酮gL）94.15 7.15±2.54 PESA組 103 28.30±2.23 25.48±1.40 29.75±2.02 516.76±89.12 7.17±2.10 t 1.195 0.414 0.214 0.416 －0.760 P TESA組 80 28.70±2.25 25.56±1.41 29.81±2.06 522.42±0.234 0.679 0.831 0.678 0.940

1.2.4 促排卵方案 采用促性腺激素激動劑（Diphereline，益普生公司）/促卵泡生成素（Gonal－F，瑞士雪蘭諾）和（或）人絕經(jīng)期促性腺激素（HMG，麗珠制藥）/絨毛膜促性腺激素（Profasi，瑞士雪蘭諾）長方案超促排卵。自用促性腺激素4d后開始B超監(jiān)測卵泡發(fā)育；當(dāng)有2個卵泡直徑大于18mm時，當(dāng)晚21：00左右予絨毛膜促性腺激素10 000IU肌內(nèi)注射，36h后取卵。

1.2.5 ICSI操作 取卵后4～6h進(jìn)行去卵丘結(jié)構(gòu)處理，選擇見到極體的MⅡ卵進(jìn)行顯微注射。16～18h后觀察受精情況，48h后觀察卵裂情況，48～72h后選取優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植。

1.2.6 受精、卵裂、胚胎移植及妊娠情況 常規(guī)行ICSI，ICSI后第1天觀察卵子受精情況，以雙原核（2PN）卵子作為正常受精卵。第3天按照Peter分級標(biāo)準(zhǔn)選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植，移植胚胎數(shù)小于或等于3個，剩余Ⅲ級以上胚胎冷凍保存，并同時給予黃體支持。移植術(shù)后第14、18天若測血β－絨毛膜促性腺激素陽性，則第35天B超觀察宮腔內(nèi)孕囊數(shù)目和心管搏動以確立臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料采用±s表示。兩組患者一般情況（包括男女雙方年齡、睪丸體積、睪酮值、FSH值）及受精率、D3卵裂率、優(yōu)胚率采用t檢驗比較，臨床妊娠率采用χ2檢驗比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者精子DNA完整率比較 TESA組DNA完整率（34.52±20.36）%與PESA組完整率（33.95±24.97）%比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 兩組患者行ICSI結(jié)局比較 兩組患者行ICSI助孕受精率、卵裂率和優(yōu)胚率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組患者行ICSI結(jié)局比較（±s）

表2 兩組患者行ICSI結(jié)局比較（±s）

組別 周期數(shù)（n） 受精率（%） 卵裂率（%） 優(yōu)胚率（%）80 78.91±20.53 95.12±10.98 44.92±26.03 PESA組 103 76.50±24.16 96.51±12.53 38.16±29.84 t 0.714 －0.781 1.617 P TESA組0.476 0.436 0.108

2.3 兩組患者行ICSI臨床妊娠率比較 TESA組80個周期，其中39個周期臨床妊娠，臨床妊娠率為48.75%；PESA組103個周期，其中57個周期臨床妊娠，臨床妊娠率為55.34%，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝0.784，P＞0.05）。

3 討 論

3.1 睪丸精子和附睪精子DNA完整率的對比分析 精子DNA完整性對男性不育是一個有價值的評價指標(biāo)。8%精液常規(guī)檢查正常的患者中，精子DNA是有損傷的；精子DNA和染色質(zhì)的損傷與男性不育和女性自然受孕率降低有明顯的關(guān)聯(lián)。大量研究表明，精子DNA和染色質(zhì)的損傷與男性不育和女性自然受孕率降低有明顯的關(guān)聯(lián)［1－2］。DFI水平對行ICSI助孕時繼續(xù)妊娠率呈負(fù)相關(guān)，且高水平DFI與ICSI植入率顯著相關(guān)，精子DNA的損傷是多種因素造成的［3］。其主要原因是睪丸自身的因素，如魚精蛋白不足，過多的活性氧（ROS）含量等；外界環(huán)境因素包括陰囊溫度過高、吸煙、生殖道的感染等［4］。精索靜脈曲張能夠造成精子DNA完整性的損傷，其損傷程度與精索靜脈曲張嚴(yán)重程度有密切關(guān)系［5］。本研究對比分析睪丸及附睪精子DNA完整率，即睪丸及附睪精子DNA完整率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2 睪丸精子和附睪精子行ICSI結(jié)局的對比分析 ICSI技術(shù)的應(yīng)用開啟了男科領(lǐng)域的新篇章，為嚴(yán)重少精、死精甚至無精患者帶來了福音，是男性不育癥患者治療的最后保障。PESA/ICSI和TESA/ICSI治療部分無精子癥患者可獲得與重度少和（或）弱精子癥患者甚至非男方因素不育患者同等的臨床妊娠率和種植率，是治療梗阻性和非梗阻性無精子不育癥的有效手段［6］?？梢栽趯?shí)驗室去除污染物、細(xì)胞碎片、有害微生物和紅細(xì)胞，處理后的精子可以行ICSI或凍存［7］。有關(guān)不同來源精子行ICSI后的妊娠結(jié)局的報道卻不盡相同。有研究顯示睪丸精子與附睪精子相比DNA損傷程度更低，應(yīng)用附睪精子治療失敗的患者改用睪丸精子治療可獲得更高的臨床妊娠率［8－9］。劉雅峰等［10］研究發(fā)現(xiàn)附睪精子和睪丸精子，臨床妊娠率分別為52.43%、40.21%，附睪是精子獲能、成熟的重要部位，為此附睪精子優(yōu)于睪丸精子，對無精子癥患者行ICSI之前盡可能首先選取附睪精子；也有學(xué)者認(rèn)為經(jīng)附睪精子受精率高于睪丸精子，但優(yōu)胚率、胚胎植入率及妊娠率無差異［11］。有文獻(xiàn)報道精液、附睪、睪丸精子ICSI的助孕結(jié)局相近，精子的成熟度可能并不影響ICSI的結(jié)局［12－13］。盡管睪丸精子行ICSI可能影響受精及早期胚胎發(fā)育，但與嚴(yán)重少弱精患者射出的精子及附睪來源的精子行ICSI的妊娠結(jié)局沒有顯著差異［14］。本研究發(fā)現(xiàn)睪丸精子與附睪精子行ICSI受精率、卵裂率、優(yōu)胚率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），睪丸精子和附睪精子組的臨床妊娠率分別為48.75%和55.34%，睪丸與附睪精子行ICSI臨床妊娠率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。兩組患者精子DNA完整率和行ICSI結(jié)局差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），經(jīng)TESA取精對術(shù)者經(jīng)驗要求不高，經(jīng)PESA取精則無需麻醉，建議術(shù)者對于梗阻性無精子癥患者慎重選擇取精方式行ICSI助孕。

隨著ICSI后代的增多，ICSI后代潛在的危險越來越受到人們的關(guān)注。ICSI所用的精子正常情況下無法自然受精，可能存在某些遺傳異常，并可能傳給子代從而造成子代后代也患有同樣的疾??；ICSI技術(shù)本身可能對卵子產(chǎn)生機(jī)械性損害等。有學(xué)者對比經(jīng)睪丸、附睪取精和射出精子行ICSI助孕出生后的孩子進(jìn)行評估，認(rèn)為睪丸、附睪精子行ICSI后孩子不會導(dǎo)致過多的病死率或先天畸形，且兩者早產(chǎn)率、病死率、孕齡、畸形率無差別［15］。但是目前尚沒有確切結(jié)論，還有待于進(jìn)一步深入研究，需對ICSI后代作長期隨訪［16］。

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