李 立，曹玉文，吳何興，王其昆，楚 嘯，楊 林，唐景霞，彭心宇，張示杰，楊宏強，2△

（1.石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，新疆石河子832008；2.徐州中心醫(yī)院腫瘤外科，江蘇徐州221009）

瞬時受體電位離子通道（transient receptor potential melastatin 7，TRPM7）是近年來發(fā)現的一種具有離子通道和蛋白激酶雙重結構的雙功能蛋白，也是新近發(fā)現的與腫瘤細胞增殖、凋亡和侵襲轉移相關的基因蛋白，但目前有關TRPM7在膽管癌中的表達及其與膽管癌生物學行為的關系國內外尚未見報道。本研究采用免疫組織化學染色方法檢測TRPM7在膽管癌、膽管良性病變組織及癌旁正常膽管組織中的表達情況，探討它與膽管癌臨床病理因素和臨床預后之間的關系，并對其臨床意義進行分析討論。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院2007年11月至2014年3月手術切除并經病理證實的行膽管癌根治術后的石蠟標本49例及膽管良性病變石蠟標本7例，并取其中36例患者的腫瘤癌旁正常膽管組織作對照，所有病例均通過本院倫理委員會批準同意。49例膽管癌患者中男25例，女24例；年齡24～80歲，中位年齡61歲；按WHO病理分級標準，高分化9例，中分化33例，低分化7例；按照國際抗癌聯盟（UICC）TNM 分期系統(tǒng)Ⅰ＋Ⅱ期16例，Ⅲ＋Ⅳ期33例；切除標本中伴有淋巴結轉移24例，無淋巴結轉移者25例；伴有肝臟、胰十二指腸和網膜等其他臟器轉移33例，無臟器轉移者16例；有肝炎病毒攜帶者9例（全為乙型肝炎），無肝炎病毒攜帶者40例?；颊咝g前均未行放射、化學治療。所有病例全部切片均由2位高年資病理醫(yī)師嚴格進行明確診斷復核。所有標本均經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片。

1.2 方法

1.2.1 實驗材料 山羊抗人TRPM7多克隆抗體（稀釋度1∶25）購自美國abcam公司（ab729）；SP試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.2 免疫組織化學方法 所有標本均行4μm連續(xù)切片，制備成石蠟切片，該步驟由本院病理科醫(yī)生及技師完成。然后切片常規(guī)烤片、脫蠟脫水，PBS沖洗，用10mmol pH的檸檬酸鹽抗原修復液進行高壓加熱抗原修復，室溫下自然冷卻，3%H2O2溶液浸泡10min，PBS沖洗，滴加一抗，4℃冰箱孵育過夜，第2天于室溫放置30min，PBS沖洗，先滴加二抗試劑1，37℃溫箱孵育30min，PBS沖洗，再加二抗試劑1，37℃溫箱孵育30min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素襯染，脫水透明封片。用已知的膽管癌陽性切片作為陽性對照，用PBS液替代一抗作為陰性對照。

1.2.3 結果判斷標準 TRPM7蛋白陽性產物主要定位于細胞質和（或）細胞膜，表現為棕黃色顆粒。評分標準采用雙評分半定量法［1］，依據著色強度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，褐黃色為3分；依據顯示細胞率評分：無著色為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。兩者相加得綜合評分：0分為（－），2～3分為（±），4～5分為（＋），6～7分為（＋＋）。最后（－）和（±）判為陰性，（＋）和（＋＋）判為陽性。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，對各種分組間表達陽性率的比較采用χ2檢驗（或Fisher確切概率法）。生存分析采用Kaplan－Meier曲線分析法。單因素分析采用Log Rank檢驗。多因素分析采用Cox多元回歸法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 TRPM7在不同膽管組織中的表達 TRPM7在膽管癌組織、癌旁正常膽管組織及膽管良性病變組織中表達陽性率分別為是77.6%（38/49）、2.8%（1/36）及0（0/7），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 TRPM7在膽管癌組織及正常膽管組織中的表達（SP，×200）

2.2 TRPM7在膽管癌中的表達與臨床病理特征之間的關系

TRPM7蛋白的表達與患者性別、年齡、部位、分化程度和肝炎無相關性（P＞0.05）；而與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移、臟器轉移等因素呈正相關（P＜0.05）。見表1。

表1 TRPM7蛋白與臨床病理因素的相關性

續(xù)表1 TRPM7蛋白與臨床病理因素的相關性

2.3 TRPM7與膽管癌預后的關系 膽管癌患者及膽管良性病變患者的隨訪從術后開始，隨訪率100.0%，截止2014年8月31日，隨訪時間為1～81個月，其中膽管癌中位生存時間為20.0個月，膽管良性病變患者中位生存時間80.0個月。隨訪期間膽管癌患者死亡35例，膽管良性病變患者無死亡病例。膽管癌患者術后復發(fā)40例，其中發(fā)生遠處轉移31例。Kaplan－Meier單因素生存分析TRPM7陽性表達與陰性表達患者的平均生存期分別為15.7個月和42.5個月，總生存率分別為21.1%和45.5%，TRPM7陽性表達患者的生存時間明顯低于陰性表達患者，經Log Rank檢驗，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝8.396，P＜0.01），見圖2。Cox多元回歸分析顯示 TRPM7蛋白表達陽性與膽管癌低生存率呈正相關，與病死率呈正相關，是膽管癌預后差的獨立危險因素，術前TNM分期和術后復發(fā)也是膽管癌患者死亡的獨立預后因素，見表2。

圖2 膽管癌患者TRPM7陽性及陰性表達的生存曲線

表2 膽管癌生存預后的Cox多元回歸分析

3 討 論

膽管癌是來源于膽管上皮細胞的高度惡性腫瘤，其有起病隱匿、診斷困難、惡性程度高、病死率高等特征，近年來，其發(fā)病率亦有逐年上升的趨勢。膽管癌臨床早期診斷困難，外科手術切除率低并易術后復發(fā)轉移，對放射化學治療不敏感，治療效果不佳，預后較差，所有膽管癌患者的平均中位生存期不到24.0個月［1－2］，因此，研究膽管癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉移等分子機制，尋找有效抗腫瘤的新途徑已成為提高膽管癌患者生存率的重要手段。

隨著對腫瘤研究的深入，發(fā)現TRPM7的表達在腫瘤侵襲和轉移中發(fā)揮重要作用。TRPM7蛋白是TRPs家族成員之一，廣泛存在于機體組織中，是具有陽離子通道和蛋白激酶雙重結構的雙功能膜蛋白，同時可使自身或底物磷酸化，因此也被稱為“通道酶”［3－4］，參與細胞的生長、增殖、遷移、凋亡甚至腫瘤的發(fā)生、轉移等多種生理病理過程［5－7］。近年來，隨著研究的不斷深入，越來越多的證據表明TRPM7與腫瘤的生長、增殖、凋亡和侵襲轉移有著密切的關系，在許多腫瘤中均有特異性表達，如在人頭頸癌［8］、人喉鱗癌和甲狀腺癌［9］、人下咽鱗狀細胞癌［10］、人鼻 咽癌［11］、前列 腺癌［12］、肺癌［13］、肝 癌［14］、胃 癌［15］、胰腺癌［16］等，但在癌前病變或癌旁正常組織中表達較低或不表達，一旦腫瘤形成，TRPM7便在某些誘因的作用下開始表達，再通過其他各種途徑參與腫瘤的進展。此外，Guilber等［17］證明乳腺腫瘤組織與相鄰的非腫瘤組織相比時，TRPM7是明顯過度表達的，同時發(fā)現TRPM7參與乳腺癌細胞的增殖與轉移。因為各種腫瘤的癌旁組織中幾乎不表達TRPM7，因此TRPM7可作為一個較為特異的腫瘤標志物雖不能用于早期診斷，但還是可以成為臨床上對腫瘤最后確診的一個有意義的輔助手段。這表明TRPM7可作為治療癌癥的一個潛在的有價值的作用靶點，與各種腫瘤的關系有待進一步研究，這在膽管癌中的研究國內外尚未見報道。

本研究結果顯示，TRPM7在膽管癌組織中高度表達，而在膽管良性病變組織及癌旁正常膽管組織中幾乎不表達，且與膽管癌TNM分期、淋巴結轉移、臟器轉移有關，提示TRPM7可能在膽管癌的發(fā)生、發(fā)展及轉移中起重要作用，這與Guilbert等［17］在乳腺癌中的研究結果都是相一致的。有研究表明，TRPM7和m－鈣激活蛋白酶（m－calpain）共存于細胞黏附復合體中，m－calpain可被鈣離子通過TRPM7通道時激活使細胞黏附復合物解離，從而抑制細胞黏附［18］，而增加鈣蛋白酶活性又進一步降低E－cadherin的表達［19］，從而導致細胞增殖、遷移和癌癥的發(fā)展。E－cadherin主要作用為介導同型細胞之間的黏附，同時作為黏附連接的一部分在很多惡性腫瘤的侵襲及轉移中都有研究［20］。而TRPM7通過直接或間接調節(jié)m－cal－pain及E－cadherin相關基因的表達促進癌癥的侵襲及轉移。TRPM7是否亦通過這一機制在膽管癌進展及轉移中起作用，還有待于進一步研究證實。

通過對49例膽管癌患者1～81個月的隨訪發(fā)現，TRPM7高表達的膽管癌患者累計生存率顯著低于其低表達的患者。經過分析發(fā)現TRPM7蛋白不僅是膽管癌預后的一個危險因素，而且是獨立的危險因素，可作為預后的不良評估因子，提示TRPM7在膽管癌預后的判斷中具有重要的參考價值，這與Wang等［21］在卵巢癌中的報道結果相一致；Middelbeek等［22］用小鼠移植瘤模型也證實高水平表達的TRPM7是乳腺癌預后較差的獨立危險因素。因此TRPM7的異常表達，可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉移過程中起到十分重要的作用，檢測TRPM7的表達對膽管癌的預后判斷具有重要價值，有望成為一個預測預后風險的獨立指標。本研究初步說明TRPM7與膽管癌發(fā)生、發(fā)展、臨床病理及預后有密切關系，有望成為膽管癌治療的潛在靶點，通過抑制TRPM7的活性或沉默TRPM7的表達，干預其相關作用進而達到抑制膽管癌細胞侵襲轉移的目的。TRPM7可作為一種新的特異腫瘤標志物和判斷預后的指標之一，為膽管癌的靶向治療提供全新的研究思路。

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