鐘雪梅，陳 敏△，鄧世山，謝少利

（川北醫(yī)學(xué)院：1.附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科；2.解剖教研究；3.附屬醫(yī)院乳腺外科，四川南充637000）

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見惡性腫瘤，近年來甲狀腺癌的發(fā)病率逐年增高，2010年男性和女性發(fā)病率分別為4/10萬和12/10萬，是第8個最常見腫瘤，第5位女性最常見腫瘤［1－3］。他的病理分型有甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyoid carcinoma，PTC）、髓樣癌、濾泡型癌和未分化癌，而PTC是最常見的一型。由于甲狀腺結(jié)節(jié)構(gòu)成復(fù)雜、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移早、具有多灶性及發(fā)病率較年輕等特點，所以甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性很難鑒別，需要更敏感可靠的腫瘤標(biāo)記物用于早期診斷的研究。甲狀腺癌發(fā)病機制方面的研究，在基因和轉(zhuǎn)錄水平上的研究報道較多。Annexin家族是鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，他廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)，約占細(xì)胞總蛋白的0.2%～5.0%，Annexin A1是其中第一個被發(fā)現(xiàn)的成員［4－5］。目前，已有 Annexin A2與甲狀腺癌和PTC之間關(guān)系研究的報道，但Annexin A1在人體PTC組織中表達(dá)的研究，國內(nèi)外報道極少，因此，本實驗通過觀察Annexin A1在PTC組織和癌旁正常組織的表達(dá)情況，探討其與PTC的關(guān)系，為進(jìn)一步的功能研究提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2010年1月至2013年1月的PTC組織病理標(biāo)本。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者臨床病例資料完整，經(jīng)病理確診的PTC標(biāo)本69例，術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療和放射性碘治療，在此基礎(chǔ)上選擇同一患者癌旁組織的標(biāo)本69例（距癌組織大于1cm）。排除標(biāo)準(zhǔn)：甲狀腺良性病變、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎等。納入的69例患者中，男14例，女55例，年齡14～81歲，中位年齡40歲。其中，＜45歲38例，占55.07%；≥45歲31例，占44.92%；TNM分期中的T分期：T138例，T224例，T36例 ，T41例。69例PTC組織中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，占39.13%。

1.2 方法 根據(jù)HE切片選取具有代表性的部位，找到存檔組織蠟塊及冰凍組織，包括癌組織、癌旁正常組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，選取對應(yīng)蠟塊，進(jìn)行切片，厚度為4μm，烘干，備用。免疫組織化學(xué)：免疫組織化學(xué)采用二步法。Ⅰ抗為小鼠抗人Annexin A1單克隆抗體（美國ORIGENE公司），Ⅱ抗免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋公司。按試劑盒說明書方法進(jìn)行，組織經(jīng)過脫蠟、水化后用枸櫞酸對組織進(jìn)行抗原修復(fù)。3%的過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，加Ⅰ抗Annexin A1單克隆抗體50μL，濃度為（1∶50），4℃ 冰箱過夜。PBS洗滌后，加聚合物增強劑，37℃孵育30min；加Ⅱ抗（山羊抗小鼠），37℃ 孵育30min。加新配制的DAB溶液5min，水洗，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水干燥，中性樹膠封片。

1.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 染色結(jié)果判定采用二級計分法［5］。染色強度分級計分標(biāo)準(zhǔn)：無顯色為0分；淡黃色為1分；黃或深黃色為2分；褐或棕褐色為3分。陽性細(xì)胞計分標(biāo)準(zhǔn)：≤5%為0分；＞5%～25%為1分；＞25%～50%為2分；＞50%～75%為3分；＞75%為4分。兩者計分的乘積作為判斷標(biāo)準(zhǔn)：0分為陰性（－）；1～4分為弱陽性（＋）；5～8分為陽性（＋＋）；9～12分為強陽性（＋＋＋）。將－和＋定為陰性，＋＋和＋＋＋定為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 癌組織和癌旁正常組織中Annexin A1表達(dá)情況 69例PTC中，Annexin A1蛋白表達(dá)陽性率（88.41%，61/69）高于癌旁正常組織（8.69%，5/69），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。Annexin A1蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈毛玻璃狀、彌散狀分布，著色深淺不一，細(xì)胞核及膜中有少量表達(dá)，見圖1。

圖1 Annexin A1陽性表達(dá)情況（DAB顯色×200）

2.2 Annexin A1蛋白表達(dá)與PTC臨床病理特征間的關(guān)系PTC組織中Annexin A1陽性表達(dá)與性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者Annexin A1陽性表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。腫瘤大于或等于1cm的患者AnnexinA1在PTC中的陽性表達(dá)率高于腫瘤小于1cm的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 69例Annexin A1蛋白表達(dá)與PTC臨床病理特征間的關(guān)系（n）

2.3 Annexin A1在69例癌組織TMN分期中的陽性表達(dá)情況 TNM分期中由于PTC分期較細(xì)，故將TNM分期大致分為2個范圍，且在臨床分期中，45歲以下都是Ⅰ期。因此，TNM分期的影響并不顯著，總體趨勢顯示出分期越晚，PTC癌組織中Annexin A1陽性表達(dá)率越高，T1N0M0～T2N1M0期陰性6例，陽性56例，T3N0M0～T4N1M0期陰性2例，陽性5例，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝0.735，P＝0.391）。

3 討 論

PTC的發(fā)病機制不僅與甲狀腺自身免疫性病變、碘攝取異常、電離輻射等有關(guān)，更與一系列遺傳和BRAF基因點突變等有關(guān)［6－7］，這就需要基因水平的分子診斷和靶向治療。Annexin A家族在脊柱細(xì)胞動物中有13個成員，即Annexin A1～A13［8］，已有研究顯示 Annexin A2在甲狀腺癌中表達(dá)上調(diào)［9］。Annexin A1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也有著密切聯(lián)系，在一些腫瘤中Annexin A1表達(dá)顯著降低甚至缺失。Wang等［10］發(fā)現(xiàn)在正常乳腺組織和乳腺良性病變組織中，Annexin A1在上皮細(xì)胞中呈現(xiàn)出強陽性表達(dá)。認(rèn)為其表達(dá)程度與乳腺癌的進(jìn)展呈反比關(guān)系。在口腔鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌表達(dá)也顯著降低［11－13］。但在另外一些腫瘤細(xì)胞中表達(dá)卻有所增加，如結(jié)直腸癌、胰腺癌［14－15］。燕貞等［16］發(fā)現(xiàn) Annexin A1在肺鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。

研究表明，甲狀腺癌的發(fā)生是多基因、多蛋白參與的結(jié)果［17］。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測了 Annexin A1在PTC的原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶及癌旁正常組織的表達(dá)，為探討PTC組織中Annexin A1蛋白表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系，本研究將性別、年齡、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑等因素納入進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Annexin A1蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小相關(guān)，這也與文獻(xiàn)報道Annexin A2在PTC中的高表達(dá)相似［9］。但Annexin A1在PTC中的表達(dá)與患者的性別、年齡無相關(guān)性，TNM分期的影響并不顯著，總體趨勢顯示出分期越晚，PTC組織中Annexin A1陽性表達(dá)率越高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.391），這可能與本研究樣本量少、地域等因素有關(guān)。Annexin A1在PTC中的高表達(dá)為腫瘤的早期診斷提供新的標(biāo)志物的可能性。Annexin A1在PTC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的分子機制的進(jìn)一步研究將對人PTC的診治及預(yù)后起到重要作用。

由于受研究人群的地域、環(huán)境、樣本量較少等的影響，對于Annexin A1在PTC的進(jìn)展作用需進(jìn)一步研究證實，相信隨著Annexin A1基礎(chǔ)研究的深入，以Annexin A1為靶點的治療可為PTC的治療提供更多的新思路。

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