武彥芳，路玉潔，鞠 境

（1.陜西省第四人民醫(yī)院消化內(nèi)科，西安710043；2.南京醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系 210029）

胃癌是目前全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一。據(jù)WHO統(tǒng)計，在2012年，全球有72.3萬人由于罹患胃癌而死亡。我國作為胃癌的高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率占全球發(fā)病的40%，居惡性腫瘤的第3位，僅次于肺癌和肝癌。目前胃癌的治療，多采用多種干預(yù)措施，如外科手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療等，其中化學(xué)治療以治愈疾病或顯著延長生命并改善患者生活質(zhì)量的效果而受到廣泛關(guān)注。但是化學(xué)治療藥物本身具有較大的毒副作用，易對患者產(chǎn)生較大生理、心理負擔［1］，因此尋找高效低毒的化學(xué)治療藥物對胃癌的治療具有重要意義。

藤茶（vine tea）又名“莓茶”，已鑒定出藤茶中含有19種人體必須的營養(yǎng)成分和微量元素。從藤茶的莖葉中可提取的一種二氫黃酮醇類化合物命名為二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）［2］，它具有抗菌、抗氧化、保肝、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖血脂等多種生物活性，但其抗癌作用機制尚不明確。既往研究報道，DMY可聯(lián)合絲裂霉素抑制胃癌細胞的生長［3］，但是從藤茶中直接提取的DMY對胃癌細胞的作用未見報道。

本研究通過超聲中性水浸提法提取藤茶中的活性成分DMY，經(jīng)過反相高效液相色譜（RP－HPLC）分離純化后的DMY的純度達到99%以上；以人胃癌細胞SGC7901為研究對象，使用CCK－8比色法檢測提取出來的DMY對胃癌細胞活性的抑制效應(yīng)，并使用流式細胞術(shù)檢測DMY促進細胞凋亡的能力，為將來進一步研發(fā)DMY作為胃癌化學(xué)治療藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料 人胃癌細胞SGC7901購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。細胞SGC7901培養(yǎng)于RPMI1640（添加碳酸氫鈉1.5g/L，葡萄糖2.5g/L，丙酮酸鈉0.11g/L）。培養(yǎng)基含10%胎牛血清，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3d傳代。

1.1.2 試劑與儀器 野生藤茶購自湖南張家界旺盛商貿(mào)有限公司；DMY標準品購自成都曼斯特生物科技公司（純度為98%），改良型RPMI1640（GIBCO公司，美國），胎牛血清（Hy－Clone公司，美國），CCK－8試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），凋亡試劑盒（上海貝博生物）。ALPAAI－4LSC真空冷凍干燥機（Chris公司，德國），LC－20AD 高效液相色譜儀（HPLC，Shimadzu公司，日本），多功能酶標儀（Tecan公司，infinite M200）。

1.2 方法

1.2.1 提取與純化 將藤茶樣品放入粉碎機進行粉碎混勻，采用超聲中性水浸提法提取藤茶中的DMY，其工藝參數(shù)為：超聲功率100W，超聲時間60min，液料比50∶1，提取溫度90℃。將提取液真空冷凍干燥進行下一步純化，將提取物的粉末配成25mg/mL的上樣濃度，采用RP－HPLC分離純化方法，HPLC系統(tǒng)：Shimadzu LC－6AD；色譜柱：Chromstar AQC18 250mm×10mm，5μm；檢測器：SPD－M6A；檢測波長：290 nm；進樣量：5mL；洗脫液流速：5mL/min；洗脫條件如下：0～2min，0～15%甲醇；＞2～4min，＞15%～20%甲醇；＞4～10 min，＞20%～50%甲醇；＞10～30min，＞50%～80%甲醇；＞30～50min，＞80%～90%乙腈。將純化后的提取物真空冷凍干燥，檢測純度，為細胞實驗提供原材料。采用優(yōu)化后的超聲中性水浸提法提取藤茶中的活性成分DMY，DMY的提取率達72%，由于粗提物的純度不能達到做細胞實驗的要求，故在此基礎(chǔ)上經(jīng)過反向HPLC（RP－HPLC）進一步分離純化。純化后DMY的純度達99%以上，可進行下一步的實驗。

1.2.2 CCK－8比色法檢測細胞活率將密度為（4～5）×103/mL的對數(shù)生長期細胞SGC7901接種在96孔板中，每孔90μL，于孵箱培養(yǎng)24h后，加入DMY（濃度分別為0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0mmoL）繼續(xù)培養(yǎng)。干燥后的DMY用DMSO溶解，同時用1.000 0mmoL DMSO處理作為對照組。處理后每孔體積100μL，每個濃度設(shè)3個平行孔。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)72h后，每孔分別加入10μL CCK－8試劑溶液，孵箱培養(yǎng)1h液體變黃后取出。用多功能酶標儀在490nm處記錄吸光度（A490）。每次實驗均重復(fù)3次。細胞存活率＝［處理組（A490）/對照組（A490）］×100%

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的細胞SGC7901，以2×105個/孔的密度接種在6孔板中，加入DMY進行處理，每組2個平行，加入DMSO作為對照組，48h后收集各組細胞和上清液，2 000r/min離心5min，棄上清液，加入PBS洗滌1次，以400μL 1×結(jié)合液重懸細胞，加入5μL Annexin V－FITC染色液，混勻后避光15min，再加入10μL PI，2～8℃避光孵育5min。流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度DMY對胃癌細胞的殺傷效應(yīng) 不同濃度的DMY處理胃癌細胞72h后，CCK－8比色法檢測結(jié)果顯示，DMY具有顯著的體外抗腫瘤作用，并且隨著處理濃度的增加，0.062 5mmoL及以上劑量實驗組相對于對照組出現(xiàn)顯著性差異。見圖1。

圖1 DMY對細胞SGC7901的殺傷效應(yīng)

2.2 DMY促進細胞SGC7901凋亡 運用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡時，可將細胞劃分為4個細胞亞群，分別為正常細胞、壞死細胞、早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞。不同濃度的DMY處理48h后，由于在顯微鏡下觀察到1.000 0mmoL DMY處理組的細胞呈懸浮碎片狀，無法完成細胞的收集，其余濃度處理的細胞，均可觀察到早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡細胞百分比顯著增加（P＜0.05），見圖2及表1。

圖2 DMY對SGC7901細胞凋亡的影響

表1 DMY對SGC7901細胞凋亡的影響（±s，%）

表1 DMY對SGC7901細胞凋亡的影響（±s，%）

a：P＜0.05，與對照組比較。

1.45±0.26 1.22±0.15 2.67±0.41 0.34±0.04 DMY處理組（mmol）0.062 5 3.36±0.46a 2.53±0.15a 4.95±0.2a 0.73±0.05 0.125 0 5.53±0.38a 3.75±0.13a 8.99±0.84a 1.23±0.11 0.250 0 7.72±0.25a 5.43±0.42a 12.59±0.39a 1.71±0.16 0.500 0 32.96±0.5a 13.01±0.48a 43.90±1.19a 1.95±0.12組別 早期凋亡細胞 晚期凋亡細胞 總凋亡細胞 壞死細胞對照組a

3 討 論

細胞凋亡又叫做“程序性細胞死亡”，是細胞的一種生理性、主動性的“自覺自殺行為”，而非病理性死亡；并且凋亡作為機體清除損傷細胞的一種機制，有效保持機體自身發(fā)育、組織和器官的動態(tài)穩(wěn)定。既往研究表明，腫瘤的發(fā)生與細胞凋亡的調(diào)節(jié)紊亂有密切關(guān)系［4］。細胞凋亡參與了癌癥的起始過程，并對癌癥的發(fā)生起負調(diào)控作用。癌前期細胞對細胞凋亡更為敏感，更易被清除，這是機體自我保護功能的表現(xiàn)［5］。實驗證明，細胞凋亡與肝癌生長呈負相關(guān)。肝癌細胞組織培養(yǎng)顯示，廣泛輕微損傷或刺激可誘導(dǎo)試管內(nèi)肝癌細胞的凋亡。Kelner等［6］指出，TGFβ－1可促進體外培養(yǎng)的肝癌細胞中DNA降解，并可通過受體連接使肝癌細胞發(fā)生凋亡，從而達到殺傷癌細胞的目的。

越來越多的證據(jù)表明，植物提取化合物通過細胞凋亡機制發(fā)揮抗腫瘤作用已經(jīng)成為癌癥治療研究的一個新熱點［7］。體外實驗證明，DMY對多種癌細胞如白血病、肝癌、乳腺癌和黑色素瘤等 有 明 顯 的 增 殖 抑 制 作 用［8－12］。Lin 等［13］報 道，DMY可通過激活 Cyt c、caspase－9and PARP誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡。線粒體釋放 Cyt c從而活化了caspase－9，而 PARP作為caspase－9的底物，在DNA損傷的修復(fù)、細胞死亡中起重要作用，它的活化是DNA損傷早期應(yīng)答的指標。此外，有研究報道，DMY可顯著上調(diào)P53的表達，在P53的介導(dǎo)下下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl－2的表達水平，誘導(dǎo)細胞凋亡［14］。但是，關(guān)于DMY誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡的研究尚未見報道。有研究顯示，白藜蘆醇可以通過對Survivin蛋白表達的調(diào)控從而誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，達到抑制腫瘤細胞生長的目的［15］。因此，推測與白藜蘆醇均有相似生物活性的DMY可能也有類似的抗癌作用機制。

本研究首先使用超聲中性水浸提法提取藤茶中的DMY，并將其純化并且進行真空干燥使其可直接參與細胞實驗。以胃癌SGC7901細胞為研究對象，用不同濃度的DMY進行處理，觀察DMY對SGC7901細胞的存活率的影響，結(jié)果表明0.062 5～1.000 0mmol的 DMY均能不同程度地抑制腫瘤細胞增殖，并呈明顯的濃度－效應(yīng)關(guān)系。進一步用流式細胞術(shù)檢測DMY處理過的細胞SGC7901，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡細胞百分比都成明顯上升趨勢。由于腫瘤細胞中的細胞增殖與凋亡的平衡失調(diào)，細胞凋亡程序被擾亂，導(dǎo)致腫瘤細胞中這一機制失去作用，所以它能夠肆意增殖［16］。促使腫瘤細胞凋亡已經(jīng)作為一種治療癌癥的主要措施之一［17］。大量對腫瘤細胞凋亡的研究提供了一個令人信服的解釋，即腫瘤并非死于DNA損傷而是重新誘發(fā)了凋亡程序，DNA損傷在凋亡誘導(dǎo)中也許十分重要，但是不可能直接殺死細胞，因此凋亡可能是誘導(dǎo)腫瘤死亡的機制［18］。既往研究表明，DMY能有效促進乳腺癌細胞 MDA－MB－231、肝癌細胞HepG2的凋亡，有助于細胞凋亡程序的修復(fù)和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，細胞增殖和凋亡間的平衡對抑制腫瘤的持續(xù)發(fā)展可能具有重要意義。因此，本研究結(jié)果提示DMY促進腫瘤細胞凋亡的發(fā)生可能是其防治胃癌發(fā)生發(fā)展的重要機制之一。

綜上所述，本實驗以人胃癌細胞SGC7901為研究對象，利用超聲中性水浸提法提取藤茶中的DMY，并觀察DMY對腫瘤細胞生長活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DMY能夠呈濃度依賴性地抑制腫瘤細胞的增殖能力，促進細胞凋亡。本研究明確了DMY促進胃癌細胞凋亡的作用，為進一步研究DMY抑制胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制提供了依據(jù)。

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