張紅賓，羅紅春，曾愛中，辛小娟

（1.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院：1.血液科；2.感染科 400016）

肝衰竭患者病死率高，積極深入研究促肝細胞的再生機制，探索新的治療方法是征服這一嚴重疾病的關鍵措施。近年來，學者們發(fā)現(xiàn)一種新的細胞因子IL－22，其在調(diào)節(jié)細胞增生、分化、凋亡的過程中發(fā)揮重要的作用，并且具有抗感染，誘導急性炎癥介質(zhì)反應，抵御及修復損傷等作用［1－5］。研究發(fā)現(xiàn)IL－22受體由2個跨膜的異二聚體IL－22R1和IL－10R2組成。IL－10R2分布廣泛，幾乎在所有細胞表面均有表達，而IL－22R1的分布具有一定選擇性，主要分布于尿路黏膜上皮細胞、消化道和呼吸道黏膜上皮細胞［6－7］。Brand等［8］報道，在肝細胞中IL－22R1和IL－10R2均有分布。為進一步證實IL－22對肝細胞的作用，本課題組擬采用IL－22重組慢病毒感染人正常肝細胞L02，同時設置感染空慢病毒及未感染對照。進行體外培養(yǎng)后，RT－PCT檢測L02細胞中結合珠蛋白 mRNA的表達，MMT法檢測L02細胞增殖活性，免疫細胞化學法檢測L02細胞增殖核抗原（PCNA）的表達。以此評估IL－22重組慢病毒對肝細胞再生的影響，為后續(xù)進行的體內(nèi)實驗研究IL－22/REG生物軸與肝臟再生的關系提供細胞實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 IL－22重組慢病毒由本院血液科實驗室構建并保存。L02細胞由重慶醫(yī)科大學病毒性肝炎研究所提供。DNA maker DL2000和PrimerStar PCR試劑盒購自大連寶生物Takara公司。胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司。MTT購自美國Sigma公司。鼠抗PCNA單克隆抗體和免疫細胞化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 IL－22重組慢病毒感染LD2細胞感染效率及IL－22表達測定 調(diào)整正常人肝細胞L02密度為2×105個/mL，加入24孔板中培養(yǎng)，待細胞生長至60%融合時進行感染。感染后1、3、5d，熒光顯微鏡下觀察感染效率，并采用ELISA檢測感染IL－22重組慢病毒后L02細胞中IL－22的表達情況。

1.2.2 IL－22重組慢病毒對人正常肝細胞L02中結合珠蛋白mRNA表達的影響 將L02細胞接種于24孔板中，接種細胞數(shù)為5×105個/孔。設3個實驗組：感染IL－22重組慢病毒組（A組）、感染空慢病毒組（B組）、未感染組（C組）。每組設3個復孔，加入DMED細胞培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）進行培養(yǎng)。待細胞生長至70%融合時，將IL－22重組慢病毒及空慢病毒儲存液稀釋100倍后，分別感染A組、B組。C組仍然使用DMED細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。在37℃，5%CO2的孵箱中培養(yǎng)48h后，收集各組細胞提取總RNA。

采用RT－PCR檢測結合珠蛋白mRNA的表達。設計引物分別為：結合珠蛋白上游引物：5′－TGG CTG CTG ACC ACG GCT AA－3′，下游 引物：5′－CGC ATC GCC ATA GCA GGT GT－3′；內(nèi)參β－actin上游引物：5′－CAA AGA CCT GTA CGC CAA CA－3′；下游引物：5′－GAA GCA TTT GCG GTG GAC－3′。反應條件：95℃5min；95℃ 1min，55℃ 45s，72℃ 45 s，共30個反應體系；72℃7min。取PCR擴增產(chǎn)物5μL，加6×Buffer 1μL，行1%瓊脂糖凝膠電泳。在凝膠成像儀中電泳結果進行分析。

1.2.3 MTT法檢測IL－22重組慢病毒對L02細胞增殖的影響 實驗分組同前。L02細胞以5×103/孔的密度接種于96孔板，每組設定3個復孔。將96孔板放入37℃，5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，分別于感染后2、3、4d后棄上清液，加入MTT溶液20μL，無酚紅DMED細胞培養(yǎng)液180μL，繼續(xù)孵箱中培養(yǎng)4h后檢測各孔吸光度值。

1.2.4 免疫細胞化學法檢測IL－22重組慢病毒對L02細胞PCNA的影響 L02細胞以5×105個/孔的密度接種于6孔板，放入37℃，5%CO2的孵箱中培養(yǎng)24h。實驗分組同前，感染重組慢病毒1d后，進行免疫細胞化學檢測。棄上清液后，用0.01mol PBS漂洗3次，每次5min。4%多聚甲醛固定30min，再用0.01mol PBS漂洗3次，每次5min。3%H2O2封閉30min，0.01mol PBS漂洗3次。山羊血清室溫孵育10 min。去血清，加鼠抗增殖細胞核抗原PCNA單克隆抗體1∶500（一抗），置濕盒內(nèi)4℃過夜。MPBS漂洗3次，每次5min。加羊抗小鼠抗體（二抗）。置濕盒內(nèi)37℃孵育15min。加辣根過氧化物酶標記鏈酶卵白素（S－A/HRP）。置濕盒內(nèi)37℃，15 min。再用0.01mol PBS漂洗3次，DAB鏡下顯色5min，光鏡下觀察圖像。每個孔隨機計數(shù)5個視野，每個高倍鏡視野（×400）計數(shù)100個細胞，計算呈陽性染色的細胞百分比。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，采用單因素方差分析及兩因素析因設計資料的方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 IL－22重組慢病毒感染L02細胞的效率及IL－22表達情況 熒光顯微鏡下觀測，IL－22重組慢病毒感染L02細胞1、3、5d的效率分別是（26.21±2.73）%、（90.12±3.45）%、（61.21±2.48）%，見圖1。感染后第3天的感染效率明顯高于第1天和第5天（P＜0.05）。同時ELISA檢測感染后第3天，IL－22在L02細胞中的表達（7.81±0.22）μg/mL顯著高于感染后第1天（1.01±0.18）μg/mL和第5天（4.29±0.14）μg/mL（P＜0.05）。

圖1 熒光顯微鏡下觀察IL－22重組慢病毒對L02細胞的感染效率

2.2 IL－22重組慢病毒促進正常人肝細胞L02結合珠蛋白mRNA的表達 L02細胞感染重組慢病毒2d后提取總RNA，行RT－PCR擴增后，1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，3個實驗組的L02細胞均有β－actin及結合珠蛋白的表達，其條帶大小分別為255、480bp，和實驗預期結果一致，見圖2。L02細胞結合珠蛋白mRNA的半定量分析以結合珠蛋白條帶/βactin條帶的光密度值表示，見圖3。經(jīng)統(tǒng)計學分析，A組L02細胞結合珠蛋白mRNA的表達明顯高于B組及C組（P＜0.01），B組和C組之間，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 MTT法檢測出IL－22重組慢病毒對L02細胞有明顯的促再生作用 MTT法檢測各孔吸光度值顯示，A組L02細胞各時間點的再生活性均明顯高于B組及C組（P＜0.05）。而B組和C組L02細胞各時間點的再生活性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。IL－22重組慢病毒對L02細胞的促再生作用于感染3d最強，感染4d后有所減弱。見圖4。

圖2 結合珠蛋白凝膠電泳分析結果

2.4 免疫細胞學檢測出IL－22重組慢病毒能促L02細胞PCNA表達 光鏡下，細胞質(zhì)著色，而細胞核無色或細胞質(zhì)細胞核均無色記為PCNA陰性細胞，細胞核染為棕黃色記為PC－NA陽性細胞。A組有較多PCNA陽性細胞，細胞核染色深，可見呈雙核或分葉狀，且細胞體積大，為再生肝細胞。B組僅有少數(shù)幾個PCNA陽性細胞。C組幾乎無PCNA陽性細胞，見圖5。計算各組標記指數(shù)（%），經(jīng)統(tǒng)計分析后結果示：與B組及C組相比，A組顯著促進PCNA的表達（P＜0.01）。B組和C組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖6。

圖3 結合珠蛋白條帶與β－actin條帶的光密度比值

圖4 MTT法檢測IL－22重組慢病毒對L02細胞促再生作用

圖5 免疫細胞化學檢測各處理組L02細胞PCNA表達情況（×400）

圖6 各處理組中PCNA陽性細胞指數(shù)

3 討 論

目前肝衰竭的治療，是臨床上非常棘手的問題。因為該病肝細胞壞死多，再生能力差，缺乏特效治療方法，以致病死率高。因此，積極深入研究促肝細胞再生的相關機制，探索新的促肝細胞再生的有效治療方法勢在必行。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，人和哺乳動物的肝臟具有強大的再生功能，2/3肝切除后的動物在10～15d左右殘存肝臟可恢復到術前體積。肝細胞再生涉及到復雜的網(wǎng)絡信號通路：一是細胞因子通路，與肝細胞再生啟動有關；二是生長因子通路，與細胞周期進程有關［9］?，F(xiàn)在已經(jīng)證實的能促進肝細胞再生的相關因子包括IL－6、腫瘤壞死因子α（TNF－α）、肝細胞生長因子（HGF）、轉化生長因子α（TGF－α）、表皮細胞生長因子（EGF）、干細胞因子等［9－11］。2000年，有研究者發(fā)現(xiàn)了一種新的細胞因子IL－22，屬于IL－10家族成員，由6個螺旋構成，反平行排列形成束狀單體蛋白，分子量為16.7～17.0×103［12］。其在調(diào)節(jié)細胞再生、分化、凋亡、抗感染、誘導急性炎性介質(zhì)反應、抵御及修復損傷等方面起重要作用。研究者們發(fā)現(xiàn)在肝臟有IL－22受體分布，并對IL－22在肝臟損傷修復中的作用進行了初步研究［13－14］，認為IL－22有利于肝臟的再生。為進一步證實IL－22與肝臟再生修復的關系，本課題組進行了上述實驗。

將IL－22重組慢病毒感染正常肝細胞L02后，采用RTPCR檢測結合珠蛋白mRNA的表達量。結合珠蛋白絕大部分在肝臟中合成，是一種急性時相蛋白，具有重要的抗炎作用。實驗結果發(fā)現(xiàn)IL－22重組慢病毒能大幅度刺激結合珠蛋白mRNA的表達，而感染空慢病毒組和未感染組中結合珠蛋白mRNA的表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。MTT法檢測發(fā)現(xiàn)感染IL－22重組慢病毒組在感染后2、3、4d，L02細胞的再生活性均明顯高于感染空慢病毒組及未感染組。但IL－22對L02細胞的促再生活性在感染后3d最強，之后有所減弱。這可能與細胞本身的老化有關。還采用細胞免疫化學方法，以L02細胞為對象，研究IL－22重組慢病毒對L02細胞的PCNA表達的影響，從另一個方面探討IL－22對肝細胞再生的促進作用。PCNA是存在于細胞核內(nèi)的一種蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量約為36KD。其表達的高峰在細胞周期的G/S期，是細胞DNA合成所必需的蛋白質(zhì)，是判斷再生細胞生物活性及所處生長狀態(tài)的重要指標。本研究結果顯示，感染IL－22重組慢病毒組有較多PCNA陽性細胞，經(jīng)統(tǒng)計分析該組PCNA陽性細胞顯著高于感染空慢病毒組及未感染組。雖然感染空慢病毒組也有少數(shù)PCNA陽性細胞，但與未感染組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），故認為慢病毒本身不會引起PCNA大量表達。

綜上所述，IL－22可以促進L02細胞結合珠蛋白mRNA及PCNA的表達，并能增強L02細胞的再生活性，故認為IL－22可能對肝細胞再生有促進作用。這一實驗結果為本課題組后續(xù)進行的體內(nèi)實驗研究IL－22/REG生物軸與肝臟再生的關系提供了細胞實驗數(shù)據(jù)。

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