段春巧 楊雯雯 雷玲彥 郭惠芳 張明峰 高麗霞 孫 超

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院免疫風濕科，石家莊 050017)

Bcl-6(B cell lymphoma 6)屬于抗細胞凋亡的原癌基因，表達于T、B 淋巴細胞中。當T、B 細胞受到抗原及細胞因子刺激后，促進Bcl-6 的表達，從而加速生發(fā)中心的形成［1］，轉(zhuǎn)錄因子Blimp-1 (B lymphocyte induced maturation protein 1，Blimp-1)與Bcl-6 是一對相互拮抗的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，而細胞因子IL-21 與Bcl-6 對生發(fā)中心的形成具有協(xié)同作用。原發(fā)性干燥綜合征(Primary Sj?gren's syndrome，PSS)是以唇腺組織過量的淋巴細胞浸潤形成生發(fā)中心為主要病理特征，這些過量的淋巴細胞不僅包括CD4+T 細胞，而且包括CD8+T 細胞、B 細胞、漿細胞和巨噬細胞。從而出現(xiàn)口干、眼干為主要特征的全身性慢性炎性自身免疫性疾病。其病因、發(fā)病機制目前尚不明確，目前普遍認為過度活化的濾泡型輔助性T 淋巴細胞(Follicular helper T lymphocytes，Tfh)是原發(fā)性干燥綜合征免疫病理進程中的中心環(huán)節(jié)。本文就Bcl-6/Blimp-1/IL-21 在PSS 中的發(fā)病機制做一初步研究。

1 對象與方法

1.1 實驗組 均來自2012 年3 月至2013 年12 月在河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院免疫風濕科住院治療的原發(fā)性干燥綜合征患者55 例，其中15 例行唇腺活檢同時留取標本，符合2002 年P(guān)SS 國際分類標準［3］。所有患者均知情同意。其中30 例(繼發(fā)腎小管酸中毒患者2 例，血液系統(tǒng)受損患者8 例，周圍神經(jīng)病變患者2 例，肺間質(zhì)纖維化患者5 例，無系統(tǒng)損害的患者13 例)接受唇腺活檢，年齡14～78 歲，中位年齡54.5 歲;40 例(其中15 例同意唇腺活檢)留取晨起空腹血清，年齡14～78 歲，中位年齡54 歲。同時選擇我院口腔外科黏液腺囊腫、下唇外傷等非自身免疫性疾病11 例，行唇腺活檢，年齡30～60 歲，中位年齡50.0 歲;30 例體檢部1 周內(nèi)參加體檢的健康人群，留取外周血，年齡22～56 歲，中位年齡34 歲。

1.2 臨床指標記錄 血常規(guī)、尿常規(guī)、生化全項、免疫球蛋白IgG、自身抗體、胸部CT、病理檢查。

1.3 主要試劑 Anti-Bcl-6 antibody 購自BD Biosciences，Blimp-1 Antibody 購自EterLife，人白介素21 ELISA 試劑盒(96tests)購自上海巧伊生物技術(shù)有限公司，SP 免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 ELISA 雙抗體夾心法檢測 于清晨6:00～7:00 之間于肘前靜脈采集pSS 患者新鮮空腹靜脈血標本，1 h 內(nèi)完成標本離心，轉(zhuǎn)數(shù)選為3 000 r/min，離心時間為10 min。完全分離后的血清迅速分置于若干PC 管內(nèi)，編號，放置于-80℃冰箱中長期保存;人白介素21 ELISA 試劑盒(96tests)靈敏度可達15 pg/ml，板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。按說明書操作，標準品與待測樣本均作復孔，取平均值。

1.5 免疫組化檢測 將石蠟包埋的組織切成厚度4 μm 切片，脫蠟;3%甲醛-H2O2溶液，避光封閉15 min，PBS 液洗3 次×5 min;抗原修復即將切片完全浸泡在枸櫞酸鹽修復液微波修復 80℃× 5 min，40℃×10 min，待自然冷卻后，PBS 液洗3 次×5 min;正常山羊血清封閉液封閉，37℃冰箱孵育30 min，甩去多余液體;滴加一抗(抗Bcl-6/Blimp-1)于濕盒中4℃過夜，PBS 液洗4 次×10 min;滴加生物素化第二抗體，37℃冰箱孵育30 min，PBS 液洗3 次×5 min;滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃冰箱孵育30 min，PBS 液洗3 次×5 min;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，鏡下觀察及時終止顯色。蘇木素復染，脫水，清洗，中性樹膠封片。

1.6 免疫組化結(jié)果判定標準 計數(shù)5 個高倍鏡視野中的陽性細胞數(shù)目(檢測Bcl-6 時，胞核為淡黃色至棕褐色者為陽性標志，檢測Blimp-1 時，胞核為淡黃色至棕褐色者為陽性標志)，并按照陽性細胞數(shù)目比例＜1%、1%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%分為5 個等級，計為0 分、1 分、2 分、3 分、4分;據(jù)染色強度分為染色強度弱(淡黃色)、中(棕黃色)、強(棕褐色)三個等級，記為1 分、2 分、3 分，陰性不著色，記為0 分;陽性細胞數(shù)目比例評分×染色強度評分做為每例標本最后綜合計分，綜合記分≥1為表達陽性，＜1 則為陰性［4］。

1.7 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學處理采用軟件SPSS13.0，非正態(tài)、方差齊性采用秩合檢驗;正態(tài)、方差齊性采用t 檢驗。兩等級資料間相關(guān)性分析采用spearman 相關(guān)系數(shù)。統(tǒng)計描述采用中位數(shù)(Medican，M)、上四分位(Interquartile up，QU)、下四分位(Interquartile low，QL)、均數(shù)加減標準差(±s)。以檢驗水準α=0.05，P＜0.05 為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 唇腺組織形態(tài)學改變 光鏡下觀察，正常對照組唇腺組織腺泡大小均勻，導管排列整齊，無擴張，間質(zhì)無或少量炎性細胞浸潤(見圖1A);疾病組腺泡大小不等，部分腺體萎縮，以導管周圍為明顯，間質(zhì)有1 個或多個灶性淋巴細胞浸潤(見圖1B)。

2.2 唇腺組織Bcl-6 蛋白的表達 對照組唇腺組織中導管上皮細胞、腺泡上皮細胞的細胞核中未見或極少量Bcl-6 蛋白的表達(見圖2A);疾病組Bcl-6蛋白主要表達于淋巴細胞灶中，分布于部分導管上皮細胞及其周圍淋巴細胞的細胞核上，多數(shù)呈棕褐色強陽性反應，極少數(shù)呈淡黃色弱陽性反應;少數(shù)間質(zhì)散在浸潤的淋巴細胞亦呈弱陽性反應，腺泡上皮細胞偶爾可檢測到陽性細胞(見圖2B)，二者差異具有統(tǒng)計學意義(見表1);將疾病組按淋巴細胞浸潤情況分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4 個等級(見圖3)，統(tǒng)計學分析4 個等級間Bcl-6 蛋白的表達差異有統(tǒng)計學意義(見表2)，Bcl-6 蛋白的表達與病理分級呈顯著正相關(guān)(rs=0.644，P＜0.001)。

2.3 唇腺組織Blimp-1 蛋白的表達 對照組唇腺組織導管上皮細胞、腺泡上皮細胞的細胞核中未見或偶有Blimp-1 蛋白的表達(見圖4A);疾病組Blimp-1 蛋白主要表達在異位生發(fā)中心，分布于部分導管上皮細胞的胞核中，偶見分布于腺泡上皮細胞的胞核，多數(shù)呈棕褐色陽性反應(見圖4B);二者差異有統(tǒng)計學意義(見表1);將疾病組按淋巴細胞浸潤情況分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個等級(見圖5)，統(tǒng)計學分析4 個等級間差異有統(tǒng)計學意義(見表2)，Blimp-1 蛋白的表達與病理分級呈正相關(guān)(rs=0.637，P＜0.001)。

2.4 Bcl-6/Blimp-1 在不同臟器損害的PSS 患者唇腺組織中的表達 腎小管酸中毒、血液系統(tǒng)受累、周圍神經(jīng)病變、肺間質(zhì)纖維化及無系統(tǒng)損害五組間Bcl-6/Blimp-1 蛋白表達，差異無統(tǒng)計學意義(見表3)。

圖1 疾病組與對照組唇腺組織病理活檢(HE，×400)Fig.1 Pathological biopsy of labial salivary glands(LSG)tissues in disease and control group(HE，×400)

圖2 兩組唇腺組織中Bcl-6 蛋白的表達(IHC，×400)Fig.2 Expression of Bcl-6 in LSG tissues of two groups(IHC，× 400)

圖3 四個病理等級中Bcl-6 的表達(IHC，×400)Fig.3 Bcl-6 expression of four pathological grades(IHC，×400)

表1 疾病組與對照組Bcl-6/Blimp-1 的比較Tab.1 Comparison of Bcl-6，Blimp-1 protein between disease group and control group

圖4 兩組唇腺組織中Blimp-1 蛋白的表達(IHC，×400)Fig.4 Expression of Blimp-1 in LSG tissues of two groups(IHC，× 400)

圖5 四個病理等級中Blimp-1 的表達(IHC，×400)Fig.5 Blimp-1 expression of four pathological grades(IHC，×400)

表2 Bcl-6/Blimp-1 在疾病組不同病理級別中的表達Tab.2 Bcl-6/Blimp-1 expression in different pathological grades

表3 Bcl-6/Blimp-1 在不同臟器損害的疾病組唇腺組織中的表達Tab.3 Comparison of Bcl-6/Blimp-1 protein levels among system involvement of disease groups

表4 IgG 升高組與正常組Bcl-6/Blimp-1 表達水平Tab.4 Comparison of Bcl-6/Blimp-1 level between IgG rise group and normal group

表5 疾病組與對照組血清IL-21 的表達水平(±s)Tab.5 Serum IL-21 levels of two groups(±s)

表5 疾病組與對照組血清IL-21 的表達水平(±s)Tab.5 Serum IL-21 levels of two groups(±s)

Note:Inspection level，α=0.05.

表6 IL-21 在疾病組不同病理級別中表達水平的比較Tab.6 IL-21 expression level in different pathological grades

圖6 Bcl-6 與Blimp-1、Bcl-6 與IL-21、IL-21 與IgG 之間的線性關(guān)系Fig.6 Correlation between Bcl-6 and Blimp-1，serum levels of IL-21;correlation between serum levels of IL-21 and IgG

2.5 Bcl-6/Blimp-1 與免疫學指標的關(guān)系 免疫球蛋白(IgG)升高組、正常組Bcl-6/Blimp-1 蛋白表達，差異無統(tǒng)計學意義(見表4)。

2.6 疾病組與對照組血清IL-21 表達水平的比較兩組血清IL-21 表達水平比較經(jīng)統(tǒng)計學分析具有統(tǒng)計學意義，疾病組高于對照組，見表5。

2.7 疾病組血清IL-21 的表達與唇腺組織病理等級的關(guān)系 唇腺活檢HE 染色淋巴細胞浸潤情況分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4 個病理等級，4 個病理等級中IL-21 表達水平具有統(tǒng)計學意義(見表6)。相關(guān)性分析，疾病組IL-21 表達水平與唇腺活檢病理等級呈正相關(guān)，(rs=0.769，P=0.001)。

2.8 Bcl-6/Blimp-1、IL-21/IgG、Bcl-6/IL-21 之間的線性關(guān)系 30 例行唇腺活檢PSS 唇腺組織中Bcl-6與Blimp-1 的表達成正相關(guān)(rs=0.566，P=0.001);留取靜脈血的40 例PSS 血清IL-21 的表達水平與IgG 表達水平呈正相關(guān)(rs=0.871，P＜0.01);15 例唇腺活檢同時留取靜脈血的PSS 唇腺組織Bcl-6 的表達與血清IL-21 的表達呈正相關(guān)(rs=0.652，P=0.008)。見圖6。

3 討論

干燥綜合征是彌漫性結(jié)締組織病中的一種，以侵犯淚腺、唾液腺等外分泌腺體，具有高度淋巴細胞浸潤為主要特征。病理上主要表現(xiàn)為外分泌腺體間質(zhì)大量淋巴細胞浸潤形成生發(fā)中心(其內(nèi)大多數(shù)為CD4+T 細胞、也有CD8+T 細胞、B 細胞、漿細胞以及巨噬細胞)，其中CD4+T 細胞主要為濾泡型輔助性T 淋巴細胞(Follicular helper T lymphocytes，Tfh)，最近證實Tfh 細胞是生發(fā)中心B 細胞分化和生存的重要信號［5］。

Bcl-6 是Tfh 細胞的轉(zhuǎn)錄因子，表達于生發(fā)中心CD4+T 細胞、B 細胞的細胞核中，促進Tfh 細胞增殖、分化，進一步促進Tfh 細胞表達細胞因子如IL-21，趨化因子CXCR5，共刺激分子ICOS，進而與B細胞相互作用，在CXCL13 的趨化作用下，歸巢，最終在唇腺組織中形成淋巴細胞灶，導致腺泡萎縮，導管擴張或狹窄，纖維組織形成。Davis 研究小組于1994 年在實驗中發(fā)現(xiàn)Blimp-1 是由prdm1(positive regulatory domain zinc finger protein 1)基因表達，在成熟B 細胞終極分化為記憶性B 細胞、漿細胞的過程中起關(guān)鍵的作用［6］，其最顯著的特點是促使成熟B 細胞發(fā)育為能夠分泌抗體的具有漿細胞表型的B細胞。研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T 細胞中的非Tfh 細胞的細胞核中高表達Blimp-1，與Tfh 細胞的轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6具有相互拮抗的作用，同時B 細胞中Blimp-1 做為Bcl-6 的拮抗劑可抑制Tfh 細胞分化，反之，Bcl-6 也抑制Blimp-1 表達，促進Tfh 細胞分化［7］。Tfh 細胞數(shù)量和功能的異常使自身免疫失衡，對誘發(fā)自身免疫性疾病具有重要作用。原發(fā)性干燥綜合征與類風濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡都屬于常見的自身免疫性疾病，雖然它們的病因和發(fā)病機制尚不明確，但都與體內(nèi)的免疫失衡、免疫破壞有關(guān)。本課題前期研究顯示［13］，在pSS 患者的唇腺組織中，可見大量CXCR5 及IL-21 陽性細胞浸潤，提示Tfh 細胞在SS中具有致病作用。本課題研究發(fā)現(xiàn)唇腺組織中，疾病組Bcl-6/Blimp-1 蛋白的表達水平明顯高于對照組;疾病組血清IL-21 的表達水平亦明顯高于對照組。疾病組唇腺組織Bcl-6 蛋白的表達與唇腺組織Blimp-1 蛋白的表達水平成正相關(guān)、與血清IL-21 的表達亦成正相關(guān);疾病組血清IL-21 的表達水平與IgG 水平高低成正相關(guān)。Bcl-6/IL-21 在原發(fā)性干燥綜合征發(fā)病機制中的作用:①Bcl-6 的過表達在體內(nèi)和體外實驗中均能導致Tfh 細胞中CXCR5、CXCR4、PD-1、ICOS、IL-21R 和IL-6R 等標記物的上調(diào)及CCR7 的下調(diào)，并驅(qū)動Tfh 細胞的分化［8-10］。②Ettinger 等［11］指出，IL-21 的重要作用之一是促進B細胞的活化，并在體液免疫應答過程中調(diào)控B 細胞的分化或凋亡，血清IL-21 水平的增高是大多自身免疫疾病患者的病理性特征表現(xiàn)。在自身免疫病的致病過程中，由于IL-21 對體液免疫的關(guān)鍵性促進作用，機體產(chǎn)生了過量的致病性自身抗體，因此如何以阻斷IL-21 的形成為靶點對自身免疫病進行干預治療，成為新近的研究焦點。

根據(jù)Chisholm 唇腺病理分級標準，疾病組按淋巴細胞浸潤程度，將唇腺組織分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個等級，實驗結(jié)果顯示，隨著浸潤淋巴細胞數(shù)的增多，Bcl-6/Blimp-1/IL-21 的表達均為增高趨勢，說明在唇腺組織中存在大量的Tfh 細胞，而且Tfh 細胞處于活化狀態(tài)，并與唾液腺受累嚴重程度密切相關(guān)。本實驗中，在某些疾病組病例中，雖未達到病理分級診斷標準，但其實驗室指標、臨床指標均支持，說明Tfh 細胞在PSS 患者早期既存在，進一步說明Tfh 細胞的表達，在誘發(fā)及維持生發(fā)中心的形成中發(fā)揮著重要作用，因此需在下一步的治療中密切隨訪、觀察患者的臨床癥狀及病理變化。將疾病組按系統(tǒng)損壞分組，經(jīng)統(tǒng)計學分析顯示Bcl-6/Blimp-1/IL-21 的表達水平無統(tǒng)計學差異，因分組后各組樣本含量較少，各組間樣本量分布不均勻，尚不能說明Bcl-6/Blimp-1/IL-21 參與了Pss 系統(tǒng)損害的發(fā)病機制，所以此統(tǒng)計結(jié)果的臨床價值有待于進一步收集樣本、實驗、探討和研究。免疫球蛋白IgG 與Bcl-6/Blimp-1 蛋白的表達水平作統(tǒng)計學研究發(fā)現(xiàn)，升高組與正常組間并無統(tǒng)計學差異。原因可能為:①體液免疫反應是復雜免疫過程，漿細胞分化受眾多T、B 淋巴細胞刺激，在PSS 患者發(fā)病過程中，除Tfh 細胞對B細胞、漿細胞發(fā)揮調(diào)節(jié)作用外，可能還受輔助性T細胞(T help cell，Th)17 等其他T 細胞亞群的影響，下一步可進行其他T 細胞亞群在pSS 患者致病作用的研究;②研究對象樣本含量少，故增大實驗誤差;③由于標本取得的可行性限制，所選研究對象并不都具備代表性的抗體陽性;但免疫球蛋白IgG 與血清IL-21 的表達水平作統(tǒng)計學研究發(fā)現(xiàn)，升高組與正常組組間差異有統(tǒng)計學差異，提示外周循環(huán)中高水平的IL-21 與pSS 患者體內(nèi)免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換存在一定聯(lián)系［12］，間接體現(xiàn)了IL-21 是pSS 發(fā)病時重要的促B 細胞效應因子，可調(diào)控B 細胞活化增殖，并調(diào)節(jié)免疫球蛋白的產(chǎn)生與Ig 的類型，推測血清IL-21 水平異常升高的pSS 患者發(fā)生高球蛋白血癥時，Ig 的類型更傾向于以IgG 為主的單克隆性球蛋白，一定程度上加重了pSS 的病情活動。

綜上所述，pSS 患者唇腺組織生發(fā)中心Bcl-6/Blimp-1 蛋白的表達增高、血清IL-21 表達水平增高，且與唇腺組織中淋巴細胞的浸潤程度有關(guān)，提示Bcl-6/Blimp-1/IL-21 可能參與了原發(fā)性干燥綜合征的發(fā)病機制，換言之，Tfh 細胞在pSS 患者唾液腺功能損傷中發(fā)揮重要作用。通過本實驗的研究希望能為原發(fā)性干燥綜合征病人的治療提供新的思路，研制出新的生物治療藥物。

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