陳俊任 楊定華 孫艷花 韓 慶 張敏杰 (南方醫(yī)科大學(xué)，廣州 510515)

肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見(jiàn)的肝臟原發(fā)惡性腫瘤，是我國(guó)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，因此探索HCC 早期診斷及預(yù)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物成為改善患者預(yù)后的關(guān)鍵［1，2］。具有PDZ 結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄共激活因子(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ)是一個(gè)包含WW 區(qū)域的蛋白，其被Hippo 腫瘤抑制通路負(fù)向調(diào)控［3］。TAZ 在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，其 促 進(jìn) 腫 瘤 細(xì) 胞 增 殖、侵 襲 和 轉(zhuǎn) 移［4-6］。Krüppel 樣因子5(Krüppel-like factor 5，KLF5)是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其通過(guò)下游的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1(Fibroblast growth factor binding protein 1，F(xiàn)GF-BP)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，KLF5 在胃癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等腫瘤組織中高表達(dá)，研究表明TAZ 對(duì)抗WWP1 介導(dǎo)的KLF5 降解，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和腫瘤形成［4，7，8］。本課題擬通過(guò)免疫組化染色技術(shù)檢測(cè)TAZ 和KLF5 在HCC 及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，分析其與HCC 臨床病理參數(shù)的相關(guān)性及兩者表達(dá)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 76 例HCC 及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本來(lái)源于2009 年1 月至2012 年10 月在我院肝膽外科接受手術(shù)的肝癌患者，所有組織標(biāo)本都經(jīng)患者同意后取得?；颊吣行?7 例，女性19 例，年齡32～78 歲，平均(51.6±7.8)歲。所有標(biāo)本經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為HCC。病理分級(jí):Ⅰ+Ⅱ級(jí)35 例，Ⅲ+Ⅳ級(jí)41例;TNM 分期:Ⅰ+Ⅱ期52 例，Ⅲ+Ⅳ期24 例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織 采用標(biāo)準(zhǔn)生物素-鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(SP)法對(duì)4 μmol/L 石蠟切片進(jìn)行染色。切片二甲苯脫蠟及梯度乙醇再水化之后，在10 mmol/L 檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中煮沸20 min 進(jìn)行抗原修復(fù)，3%雙氧水封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，3%牛血清白蛋白封閉1 h 之后，將1 ∶100 稀釋的兔抗人TAZ 多克隆抗體(#2149，Cell Signaling Technology，USA)和鼠抗人KLF5 單克隆抗體(SAB4200338，Sigma，USA)加于標(biāo)本后，置于濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜。滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，37℃溫箱孵育20 min。滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，孵育30 min。滴加DAB 顯色，蘇木素輕度復(fù)染，鹽酸酒精脫色，稀氨水反藍(lán)，梯度脫水至透明。顯微鏡下觀察、成像系統(tǒng)拍照。

1.2.2 免疫組化染色評(píng)估 所有切片由兩位病理科醫(yī)生獨(dú)立進(jìn)行半定量評(píng)分，用染色強(qiáng)度聯(lián)合陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分:染色強(qiáng)度分為4 等級(jí):0 分，陰性;1 分，弱陽(yáng)性;2 分，中度;3 分，強(qiáng)陽(yáng)性;陽(yáng)性細(xì)胞百分比分級(jí)如下:陽(yáng)性細(xì)胞≤5%=0 分，6%～25%=1 分，26%～50%=2 分，51%～75%=3 分，＞75%=4 分。染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分相乘＞4 分則認(rèn)為TAZ 或KLF5 蛋白陽(yáng)性表達(dá)［9］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，分類資料運(yùn)用χ2檢驗(yàn)分析，相關(guān)性分析采用Spearman 等級(jí)相關(guān)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC 及對(duì)應(yīng)癌旁組織中TAZ 和KLF5 的表達(dá)對(duì)收集的76 例HCC 及對(duì)應(yīng)癌旁組織進(jìn)行免疫組化染色，陽(yáng)性染色為棕黃色或棕褐色，TAZ 和KLF5蛋白表達(dá)主要定位在細(xì)胞核(圖1)。TAZ 和KLF5在HCC 組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為61.8% (47/76)和57.9%(44/76)，而在對(duì)應(yīng)癌旁組織中僅為35.5%(27/76)和40.8%(31/76)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.534，P=0.001;χ2=4.448，P=0.035)。

2.2 TAZ 和KLF5 蛋白表達(dá)與HCC 臨床病理參數(shù)的關(guān)系 TAZ 及KLF5 蛋白表達(dá)與HCC 臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表1。TAZ 和KLF5 蛋白表達(dá)與腫瘤組織病理分級(jí)和TNM 分期有關(guān)(P ＜0.05)，與性別、年齡、HBV 感染、AFP 水平、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、肝硬化無(wú)顯著相關(guān)性。

2.3 HCC 組織中TAZ 與KLF5 蛋白表達(dá)的相關(guān)性應(yīng)用免疫組化評(píng)分半定量TAZ 和KLF5 蛋白表達(dá)水平，Spearman 等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示在HCC 組織中的TAZ 與KLF5 蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.651，P=0.003)。

3 討論

圖1 TAZ 和KLF5 蛋白在HCC 及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)(SP，×400，標(biāo)尺:100 μm)Fig.1 Immunohistochemical staining of TAZ and KLF5 in HCC and matched normal tumor-adjacent tissues (SP，×400，Scale bar:100 μm)

Hippo 信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、器官大小控制和腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，YAP 和TAZ 都是被Hippo 通路抑制的轉(zhuǎn)錄輔助因子，Hippo 通路異常失活和/或TAZ 及YAP 過(guò)表達(dá)導(dǎo)致其下游靶基因轉(zhuǎn)錄活化［10］。TAZ作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助因子與多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子相互作用，如TEADs、Smads、PAXs、TBX5、TTF-1/NKX-2、RUNX2 和MyoD［11］。研究表明TAZ 促進(jìn)EMT 介導(dǎo)的腫瘤進(jìn)展，TAZ 通過(guò)調(diào)整RUNX2 和PPARγ 依賴的基因表達(dá)調(diào)控間質(zhì)干細(xì)胞分化，并通過(guò)控制Smad 的定位調(diào)控干細(xì)胞自我更新［12］。TAZ在乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。重要的是，TAZ 陰性表達(dá)的結(jié)腸癌患者具有更好的預(yù)后，提示TAZ 可能作為結(jié)腸癌潛在的治療靶點(diǎn)［13］。本研究通過(guò)免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TAZ 在HCC 組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織，且在高病理分級(jí)和高TNM 分期的腫瘤組織中TAZ 的陽(yáng)性表達(dá)率更高，提示TAZ 可能是一個(gè)潛在的HCC 患者預(yù)后指示分子。

表1 TAZ 和KLF5 蛋白表達(dá)水平與HCC 臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n=76)Tab.1 Correlation between clinicopathological characteristics and protein expression of TAZ and KLF5 in HCC patients(n=76)

KLF5 在乳腺癌和結(jié)腸癌中作為一個(gè)致癌轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能，其很可能被Hippo 腫瘤抑制基因通路抑制［14］。KLF5 參與多個(gè)腫瘤信號(hào)通路，如Ras-MAPK、Wnt-β-catenin、TGF-β 和 Hippo 通 路［15］。KFL5 在干細(xì)胞自我更新和分化中發(fā)揮重要作用，研究表明KLF5 促進(jìn)胚胎干細(xì)胞自我更新并通過(guò)調(diào)控關(guān)鍵多潛能基因如Nanog 和Oct3/4 表達(dá)維持胚胎干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)［16］。本研究中KLF5 在HCC 中的表達(dá)顯著高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，這與KLF5 在其他腫瘤組織中表達(dá)趨勢(shì)一致，HCC 中KLF5 陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)和TNM 分期相關(guān)，提示KLF5 可能與HCC 發(fā)生發(fā)展有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)KLF5 被WWP1 和SCFFbw7 E3 連接酶泛素化，進(jìn)一步被蛋白酶體降解，WWP1 通過(guò)其WW 區(qū)域與KLF5 的PY 修飾結(jié)合，從而泛素化蛋白酶解KLF5蛋白［4］。乳腺癌中TAZ 通過(guò)對(duì)抗WWP1 介導(dǎo)的KLF5 降解和增強(qiáng)KLF5 活性促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和腫瘤形成［4］。本研究在HCC 中分析兩種蛋白表達(dá)相關(guān)性證實(shí)TAZ 與KLF5 蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)，提示HCC 中TAZ 可能通過(guò)保護(hù)KLF5 不被WWP1 泛素化蛋白酶解促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TAZ 和KLF5 在HCC 組織中高表達(dá)且與惡性臨床病理特征相關(guān)，HCC 組織中TAZ 與KLF5 蛋白表達(dá)正相關(guān)，初步推測(cè)在HCC中TAZ 可能是一個(gè)癌基因，通過(guò)抑制WWP1 介導(dǎo)的泛素化作用避免KLF5 被泛素化蛋白酶解，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，但具體的功能及精確的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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