王 健 韓忠燕 周 娜 (安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原學(xué)與免疫學(xué)教研室，淮南 232001)

中性粒細(xì)胞(Polymorphonuclear neutrophils，PMNs)是人體最主要的一種白細(xì)胞，在介導(dǎo)抗病原微生物感染的非特異性免疫反應(yīng)中起重要作用［1］。目前研究表明，PMNs 可表達(dá)CXCR1、CXCR2，其與CXCL8 相互作用可募集更多的中性粒細(xì)胞，從血管趨向炎癥或損傷部位遷移，參與局部和全身的炎癥反應(yīng)［2-4］。為了解慢性乙肝患者外周血PMNs 上CXCL8 其受體CXCR1、CXCR2 表達(dá)，本文選擇42例慢性乙肝患者外周血PMNs，以鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(Streptavidin-biotin complex，SABC)細(xì)胞免疫化學(xué)染色法檢測其表達(dá)，并探討其臨床意義。

1 對象與方法

1.1 對象 所選病例均為我校附屬醫(yī)院和教學(xué)醫(yī)院2011 年12 月至2012 年12 月收治的門診及住院的慢性乙肝患者42 例，其中，男28 例，女14 例，年齡21～52 歲，平均(43.6±8.4)歲。HBeAg(+)患者17 例，HBeAg(-)患者25 例;PMNs 內(nèi)HBV DNA(+)患者13 例，HBV DNA(-)患者29 例。入選患者均符合2010 年中華醫(yī)學(xué)會推薦的慢性乙型肝炎防治指南診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。

1.2 試劑與儀器 中性粒細(xì)胞分離液購自灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司;乙型肝炎標(biāo)志物(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb)診斷試劑盒購自上?？迫A生物股份有限公司;SuperReal PreMix(SYBR Green)試劑盒購自天根生化科技北京有限公司;鼠抗人CXCL8、CXCR1 及CXCR2 單克隆抗體購自LifeSpan BioSciences 公司;二抗、SABC試劑盒、顯色試劑盒及蘇木素等均購自武漢博士德生物工程有限公司;黏附載玻片及蓋玻片均購自江蘇世泰實驗器材有限公司。5415D 高速離心機(德國Eppendorf 公司);EXL808 型酶標(biāo)分析儀(美國Bio-Tek 公司);梯度PCR 儀TP600 購自日本TaKaRa 公司;MDF-135 型CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司);iCycle?熒光實時定量PCR 儀購自美國Bio-Rad 公司;Hema-2000 凝膠掃描分析系統(tǒng)購自珠海Hema 公司;Nikon-E400 熒光顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 PMNs 提取 取患者晨起新鮮外周抗凝血3 ml，小心置含3 ml 中性粒細(xì)胞分離液表面，室溫2 000 r/min 常規(guī)離心35 min，見全血分為血漿、PBMCs 層、中性粒細(xì)胞分離液與PMNs 混合層、紅細(xì)胞(Red blood cells，RBCs)層。棄血漿層和PBMCs 層，小心吸取中性粒細(xì)胞分離液和PMNs 混合層，以無Ca2+、Mg2+HBSS 稀釋至5 ml，混勻，重懸浮細(xì)胞;2 000 r/min 離心10 min，管底呈現(xiàn)紅色團(tuán)塊，含PMNs 和殘余RBCs。棄上清;加1 ml RBC 裂解液以裂解殘余的RBCs，渦旋振蕩數(shù)秒;1 500 r/min 離心5 min;棄上清;重復(fù)上述步驟，進(jìn)一步清除殘余的RBCs，加入250 μl 濃度為20 ml/L 的HBSS/HSA 重懸細(xì)胞，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至(1～2)×106ml［6］。

1.3.2 PMNs 純度、活度檢測 取新分離、純化的PMNs 以瑞氏染色鏡檢。鏡下計數(shù)100 個細(xì)胞，中性粒細(xì)胞活度=中性粒細(xì)胞數(shù)/100 ×100%。用新鮮配制的0.4%臺盼藍(lán)染液和細(xì)胞懸液以1 ∶9 的比例混勻后3 min 內(nèi)在顯微鏡下計數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞，活細(xì)胞率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。所提PMNs 純度＞95%，PMNs 活度＞95%。

1.3.3 血清HBeAg 及PMNs 內(nèi)HBV-DNA 檢測取患者血清及陰、陽對照樣品各50 μl 分別與50 μl酶結(jié)合物加至各自檢測孔中，封板，37℃孵育30 min后甩去液體，每孔加1 ∶20 稀釋的洗滌液200 μl，靜置30 s 后甩干，重復(fù)3 次，扣干，各孔分別加顯色劑A、B 各50 μl，搖床混勻，封板，37℃孵育15 min，各孔分別加終止液50 μl，空白孔調(diào)零，450 nm 波長下測各孔吸光度，記錄結(jié)果，并依此結(jié)果將入選患者分為HBeAg(+)組與HBeAg(-)組。

分別取50 μl 上述PMNs 懸液和血清置于含50 μl SDS 裂解液的離心管中，混勻，沸水浴15 min，冰浴冷卻5 min，12 000 r/min 離心3 min，取上清液2 μl 與10 μl 2×SuperReal PreMix、6.8 μl RNase-Free ddH2O 以及上下游HBV-DNA 引物各0.6 μl 混合，點動離心收集反應(yīng)液后置于Bio-Rad 熒光定量PCR-iQ5 擴增儀上95℃15 min，95℃10 s，55℃30 s，72℃32 s，共40 個循環(huán)，檢測PMNs 內(nèi)HBVDNA，并依此結(jié)果將入選患者分為HBV DNA(+)組及HBV DNA(-)組。

1.3.4 SABC 法免疫細(xì)胞化學(xué)染色 取PMNs 細(xì)胞懸液涂片，待干燥后冰丙酮固定15 min;新鮮配制3% H2O2溶液中室溫浸泡30 min，新鮮ddH2O 沖洗3 min×3 次;滴加50 μl 5% BSA，37℃孵育30 min后甩去多余液體;滴加50 μl 一抗(1 ∶400 稀釋)，4℃過夜后37℃孵育1 h;PBS 洗3 min×3 次。滴加50 μl 生物素化的二抗IgG，37℃孵育30 min;PBS 洗3 min×3 次，滴加50 μl SABC，37℃孵育30 min，PBS洗5 min×3 次;DAB 顯色:取1 ml 雙蒸水，加試劑盒中A、B、C 試劑各1 滴，混勻后每孔加100 μl，室溫顯色5 min。雙蒸水洗滌，5 min×3 次;Mayor 蘇木素復(fù)染30 s 左右，自來水及Na2HPO4溶液中各2 min;75%、85%、95% 和100% 無水乙醇下分別脫水3 min，干燥后中性樹膠封片。其中陰性對照中用PBS代替一抗，陽性對照由LifeSpan BioSciences 公司提供。

1.3.5 SABC 染色結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn) 以細(xì)胞涂片染色呈黃色作為陽性標(biāo)準(zhǔn)，參照Shimizu 等［7］判斷標(biāo)準(zhǔn)，分別按染色深度及分布進(jìn)行光鏡分析并記分。根據(jù)細(xì)胞染色強度可分為4 級:0 分為陰性，藍(lán)色;1分為弱陽性，淺黃色;2 分為中度陽性，黃色;3 分為重度，棕黃色;根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)占視野總細(xì)胞數(shù)的比例分為0 分為＜10%、1 分為10%～30%、2 分為31%～60%、3 分為＞60%，共4 級，最終評分值=陽性細(xì)胞比例評分值×染色程度評分值，總評分標(biāo)準(zhǔn):小于3 分者為(-);3 至6 分者為(+);大于6 分者為(++)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間采用卡方檢驗或Fisher 確切概率法，P＜0.05 被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01 為差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。規(guī)定檢驗水準(zhǔn)α=0.05;若總體有差異，修正檢驗水準(zhǔn)α=0.016 7，進(jìn)一步進(jìn)行各個變量不同表達(dá)的兩兩比較，α＜0.016 7 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用GraphPad Prism 5 進(jìn)行CXCL8及其受體CXCR1、CXCR2 mRNA 表達(dá)與血清ALT、CXCL8 之間相關(guān)性分析并作圖。相關(guān)性分析:0＜| r |≤0.3 為微弱相關(guān)，0.3 ＜| r |≤0.5 為低度相關(guān)，0.5 ＜| r |≤0.8 為顯著相關(guān)，0.8 ＜| r |≤1為高度相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 PMNs 純度、活度檢測結(jié)果 瑞氏染色鏡檢見獲檢PMNs 邊界清晰，胞漿豐富，核分3～5 葉，葉與葉間有細(xì)絲相連，提示所提取純化的PMNs 典型，可滿足后續(xù)實驗要求。見圖1。

2.2 SABC 細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果 SABC 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，CXCL8 主要位于PMNs 胞漿中，CXCR1、CXCR2 多見于胞漿和胞膜上，其中HBeAg(+)者CXCL8、CXCR1 免疫著色較深，而CXCR2 免疫著色較淺;PMNs 內(nèi)HBVDNA (+)者CXCL8、CXCR1 免疫著色亦較深，而CXCR2 免疫著色亦較淺(見圖2、3)。

圖1 中性粒細(xì)胞瑞氏染色Fig.1 Result of neutrophils with Wright's staining

圖2 HBeAg(+)及HBeAg(-)者CXCL8、CXCR1 和CXCR2 染色結(jié)果(×1 000)Fig.2 Immunocytochemistry of CXCL8，CXCR1 and CXCR2 in HBeAg(+)and HBeAg(-)(×1 000)

圖3 HBV DNA(+)及HBV DNA(-)者CXCL8、CXCR1和CXCR2 染色結(jié)果(×1 000)Fig.3 Immunocytochemistry of CXCL8，CXCR1 and CXCR2 in HBV DNA(+)and HBV DNA(-)(×1 000)

圖4 血清CXCL8 以及PMNs 內(nèi)CXCL8、CXCR1/2 mRNA 與ALT 的相關(guān)性Fig.4 Correlation of CXCL8 in serum and mRNA of CXCL8，CXCR1/2 in PMNs with ALT

表1 慢性乙肝患者PMNs CXCL8 表達(dá)Tab.1 Expression of CXCL8 in PMNs of CHB

表2 慢性乙肝患者PMNs CXCR1 表達(dá)Tab.2 Expression of CXCR1 in PMNs of CHB

2.2 慢性乙肝患者外周血PMNs 內(nèi)CXCL8 表達(dá)如表1 所示，42 例慢性乙肝患者PMNs 內(nèi)HBV DNA(+)組和HBV DNA(-)組中CXCL8 陽性率分別為100%(13/13)和93.1%(27/29)，而HBeAg(+)與HBeAg(-)組CXCL8 陽性率分別為100%(17/17)和92.0%(23/25)，HBeAg(+)組與HBeAg(-)組以及HBV DNA(+)與HBV DNA(-)組之間CXCL8 的表達(dá)均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

2.3 慢性乙肝患者外周血PMNs 內(nèi)CXCR1 表達(dá)如表2 所示，42 例慢性乙肝患者外周血PMNs 中HBV DNA(+)組和HBV DNA(-)組CXCR1 的陽性率分別為100% (13/13)和79.31% (23/29)，而HBeAg(+)與HBeAg(-)組CXCR1 的陽性率分別為94.12%(16/17)和80.00%(20/25)，HBeAg(+)組與HBeAg(-)組以及HBV DNA(+)與HBV DNA(-)組之間CXCR1 的表達(dá)均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。

2.4 慢性乙肝患者外周血PMNs 內(nèi)CXCR2 表達(dá)如表3 所示，42 例慢性乙肝患者外周血PMNs 中HBV DNA 的檢出率為30.95%(13/42)，其中HBV DNA(+)組和HBV DNA(-)組CXCR2 的陽性率分別為53.85%(7/13)和48.28%(14/29)，而HBeAg(+)與HBeAg(-)組CXCR1 的陽性率分別為52.94%(9/17)和48.00%(12/25)，HBeAg(+)組與HBeAg(-)組以及HBV DNA(+)與HBV DNA(-)組之間CXCR2 的表達(dá)水平均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表3 慢性乙肝患者PMNs CXCR2 表達(dá)Tab.3 Expression of CXCR2 in PMNs of CHB

2.5 慢性乙肝患者血清CXCL8 以及外周血PMNs內(nèi)CXCL8 及其受體CXCR1、CXCR2 表達(dá)與ALT 的關(guān)系 對比觀察患者血清CXCL8 表達(dá)與ALT 水平的相互關(guān)系，r=0.859，提示兩者具有高度相關(guān)性;而CXCL8 mRNA 表達(dá)與ALT 水平顯著相關(guān)(r=0.688)。進(jìn)一步分析CXCR2 mRNA、CXCR2 mRNA與ALT 水平的相互關(guān)系，結(jié)果顯示CXCR1 mRNA與ALT 水平顯著相關(guān)(r=0.585)，而CXCR2 mRNA與ALT 水平無明顯相關(guān)性(r=0.088)，如圖4 示。

3 討論

CXCL8 亦稱IL-8，又稱嗜中性粒細(xì)胞因子，可由外周血淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等產(chǎn)生，是炎癥性疾病的重要介質(zhì)，常與局部組織的炎細(xì)胞浸潤相一致［8］。CXCR1 和CXCR2 是CXCR 家族中的兩個重要成員，主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD56+NK 細(xì)胞、神經(jīng)血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞、腸道表皮細(xì)胞等。CXCR1 和CXCR2 擁有共同配體CXCL8，因此，當(dāng)CXCL8 與CXCR1/2 結(jié)合的時候，CXCR1/2 通過與之偶聯(lián)的G 蛋白，激活下游級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［9，10］，參與局部和全身炎癥反應(yīng)。

慢性乙型肝炎是HBV 感染機體后以局部單核-巨噬細(xì)胞浸潤為主的慢性病變［11］，HBV 感染機體后一方面可誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生CXCL8［12］，另一方面作用于單核巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6［13］，促進(jìn)單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生CXCL8，提示慢性乙肝患者CXCL8 水平與肝細(xì)胞損傷程度密切相關(guān)［14］。通常認(rèn)為，中性粒細(xì)胞在抗病毒感染中不能發(fā)揮主要作用，但本文研究發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者高水平的CXCL8、CXCR1，高水平的CXCL8 與其特異性受體CXCR1、CXCR2 相互作用，可募集更多的中性粒細(xì)胞至肝臟，肝竇內(nèi)皮間隙可允許小靜脈中的PMNs與瀕死的肝細(xì)胞直接接觸，從而參與肝臟的炎性損傷和組織修復(fù)。

細(xì)胞免疫化學(xué)染色法是根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的特點，檢測細(xì)胞內(nèi)某種多肽、蛋白質(zhì)及膜表面抗原和受體等大分子物質(zhì)分布的常用方法。SABC 細(xì)胞免疫化學(xué)染色法以親和素為橋聯(lián)，具有三級級聯(lián)放大作用，較以往SP 法具有更高的靈敏性，且染色背景也更清晰［15］。本文采用該法觀察42 例慢性乙肝患者外周血PMNs 中CXCL8、CXCR1 及CXCR2表達(dá)，結(jié)果顯示CXCL8 彌漫性分布于PMNs 胞漿內(nèi)，CXCR1 及CXCR2 彌漫性分布于PMNs 的胞漿及胞膜上，且CXCL8 和CXCR1 在慢性乙肝患者外周血PMNs 染色程度與患者HBeAg 表達(dá)及病毒載量呈正相關(guān)，當(dāng)患者體內(nèi)HBeAg(+)時，體內(nèi)病毒復(fù)制活躍，HBeAg 作為分泌型的小分子多肽刺激外周血PMNs，使其活化并分泌CXCL8、表達(dá)相應(yīng)受體CXCR1、CXCR2，其中以CXCR1 表達(dá)更明顯，此可能CXCR1 與CXCL8 有較高親和性有關(guān);高表達(dá)CXCR1 的中性粒細(xì)胞又與CXCL8 特異性結(jié)合，趨化吸引更多中性粒細(xì)胞至局部病灶，參與乙肝慢性化免疫損傷的病理過程。HBV DNA 是反映體內(nèi)病毒復(fù)制的直接指標(biāo)，HBV DNA(+)提示體內(nèi)病毒復(fù)制活躍，部分病毒顆粒從破損的肝細(xì)胞釋放入血，與外周血PMNs 相互作用，使CXCR1 表達(dá)上調(diào)，而CXCR2 并未明顯上調(diào)，提示CXCR2 在耐受HBV 慢性感染及感染后的損傷修復(fù)起重要作用。但中性粒細(xì)胞CXCR2 過低表達(dá)不利于感染后的損傷修復(fù)，Weinger 等［16］研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)CXCR2 的中性粒細(xì)胞可降低病毒特異性T 細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的積聚，促進(jìn)病毒復(fù)制，增加死亡率，而應(yīng)用CXCR1、CXCR2阻斷劑可減少病毒感染及其病理損傷。

通常而言，細(xì)胞免疫化學(xué)著色程度與靶抗原含量呈正相關(guān)。42 例慢性乙肝患者外周血PMNs 中，CXCL8 表達(dá)陽性率為95.2%(40/42)，其中強表達(dá)和弱表達(dá)分別為40.5% (17/42)和54.8% (23/42);CXCR1 表達(dá)陽性率為85.7%(36/42)，其中強表達(dá)和弱表達(dá)分別為35.7%(15/42)和50%(21/42);CXCR2 表達(dá)陽性率為50%(21/42)，其中強、弱表達(dá)分別為9.5%(4/42)和40.5%(17/42)，提示慢性乙肝患者外周血PMNs 中，以CXCL8 及CXCR1 表達(dá)升高為主，CXCR2 表達(dá)相對較弱，此可能與CXCR1、CXCR2 差異表達(dá)有關(guān)，前者以介導(dǎo)炎癥損傷為主，后者主要參與損傷后組織修復(fù)。當(dāng)CXCR1 大量表達(dá)，一部分CXCR1 可形成二聚體，此可作為一種強效CXCR2 受體激動劑，誘導(dǎo)CXCR2表達(dá)，促進(jìn)組織修復(fù)［17］。

肝臟是人體重要的免疫器官，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)是反映肝臟代謝功能的重要指標(biāo)。當(dāng)HBV 在體內(nèi)持續(xù)復(fù)制，可致肝組織損傷、肝細(xì)胞破壞，此時，ALT 可從受損的肝細(xì)胞胞漿中釋放入血，使血清ALT 水平升高［18］。本文采用GraphPad Prism 5 分析實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者血清CXCL8 及CXCL8 mRNA 均與ALT 明顯相關(guān)(r=0.859，P＜0.01;r=0.688)，提示無論從CXCL8的血清游離水平還是基因轉(zhuǎn)錄水平均與ALT 水平具有較好的一致性，與Wu 等［19］報道類似，似可作為反映肝臟炎癥損傷的輔助指標(biāo)。CXCR1、CXCR2主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，IL-8 是其共同配體，其表達(dá)水平是反映免疫細(xì)胞活化的重要標(biāo)志［20］。本文研究發(fā)現(xiàn)CXCR1 mRNA與ALT 水平有一定相關(guān)性(r=0.585)，而CXCR2 mRNA 與ALT 無明顯相關(guān)性(r=0.088)，提示CXCR1、CXCR2 與IL-8 相互結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用不完全一致，前者側(cè)重參與乙肝慢性化免疫病理損傷，而后者可能促進(jìn)損傷后組織修復(fù)。

綜上所述，中性粒細(xì)胞作為一種重要的非特異性免疫細(xì)胞，其可通過分泌CXCL8 和表達(dá)CXCR1、CXCR2 途徑參與慢性乙肝的炎性損傷和修復(fù)。SABC 細(xì)胞免疫化學(xué)染色法具有較高的特異性和靈敏性，可定位觀察CXCL8、CXCR1、CXCR2 在PMNs中的表達(dá)，其著色程度與患者HBeAg 表達(dá)、HBV DNA 載量密切相關(guān);高表達(dá)CXCR1 的中性粒細(xì)胞又與CXCL8 相互作用，趨化吸引更多中性粒細(xì)胞至病灶，參與乙肝慢性化免疫損傷的病理過程，而CXCR2 似可參與患者慢性化過程，促進(jìn)損傷后組織修復(fù)，CXCL8 似可作為反映肝臟炎癥損傷的輔助指標(biāo)。

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