李衛(wèi)霞 周 猛 任宏艷 曹 萌 王立新 (東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，南京 210009)

腫瘤來源的自噬小體(Tumor derived-autophagosomes，TDA)作為腫瘤抗原的有效載體，能誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答［1］。用蛋白酶體抑制劑、自噬誘導(dǎo)劑處理細(xì)胞后分離得到的自噬小體中含有較多短壽蛋白及核糖體錯誤編碼產(chǎn)品［2］。腫瘤細(xì)胞表面MHCⅠ類分子遞呈肽段通常來源于短壽蛋白和核糖體錯誤編碼蛋白［3］，因而DC 依賴CLEC9A 及其配體能有效識別TDA 并加工處理TDA 抗原，最終交叉提呈TDA 抗原并誘導(dǎo)CD8+T 細(xì)胞的活化［4］。研究證實TDA 與可溶性蛋白抗原或完整的腫瘤細(xì)胞相比，能誘導(dǎo)更強(qiáng)的T 細(xì)胞應(yīng)答［1］。

B 細(xì)胞是重要的抗體分泌細(xì)胞，抗體作為機(jī)體抗感染的有效屏障，在疫苗的研究中具有重要作用［5-8］。因而對TDA 刺激B 細(xì)胞應(yīng)答，并誘導(dǎo)B 細(xì)胞分泌抗體的研究也顯得尤為重要。但是TDA 能否增強(qiáng)B 細(xì)胞表面MHC 以及共刺激分子的表達(dá)，并最終刺激抗體的分泌作用還不清楚。本文通過比較TDA 與細(xì)胞裂解液對B 細(xì)胞的體外刺激作用，證實TDA 在體外能更有效地刺激B 細(xì)胞的增殖、活化，并促進(jìn)B 細(xì)胞分泌IgM。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗選用C57BL/6 雌性小鼠，6～8 周齡，體重18～20 g，購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心;Hep1-6 和B16F10 細(xì)胞株，購自上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所;RPMI1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司;胎牛血清購自Hyclone 公司;Bradford 蛋白檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司;LPS 購自Sigma Aldrich 公司;CFSE、CD43 抗體偶聯(lián)磁珠分選試劑盒購自Invitrogen 公司;熒光標(biāo)記抗體APC-B220 購自BD Bioscience 公司;PEB220、FITC-H2-Kb、FITC-I-Ab、PE-CD40 體及PECD86 購自eBioscience 公司;IgM 檢測試劑盒購自美國Jackson Immuno-Research 公司。

1.2 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)及TDA、細(xì)胞裂解液制備 Hep1-6 和B16F10 細(xì)胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。待細(xì)胞貼壁良好，密度適中后，按照Li［9］的方法，提取細(xì)胞上清中的TDA，保存于-20℃;收集生長狀態(tài)良好的貼壁細(xì)胞，PBS 洗滌3 次，PBS 重懸，37℃～-20℃反復(fù)凍融6次，裂解細(xì)胞，以Bradford 法測定TDA 和細(xì)胞裂解液中總蛋白的含量。

1.3 透射電子顯微鏡鑒定TDA 的形態(tài) 將收集Hep1-6 細(xì)胞和TDA 用2.5%戊二醛固定，送至南京軍區(qū)總醫(yī)院電鏡室進(jìn)行冰凍切片，電鏡觀察TDA 的大小、形態(tài)。

1.4 TDA 體外刺激脾臟B 細(xì)胞的增殖 取野生型C57BL/6 小鼠脾細(xì)胞，5 μmol/L CFSE 標(biāo)記細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，48孔板培養(yǎng)，2×106個細(xì)胞/孔，每孔分別加入10 μg/ml TDA、10 μg/ml 細(xì)胞裂解液、10 μg/ml LPS，并以完全培養(yǎng)液(CM)作為對照，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱孵育第5 天收集細(xì)胞，并用PE-B220 抗體染色，流式細(xì)胞儀檢測B220+細(xì)胞CFSE 的衰減。

1.5 TDA 刺激脾臟B 細(xì)胞活化作用檢測 取野生型C57BL/6 小鼠脾細(xì)胞，CD43 抗體偶聯(lián)磁珠分離B 細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，48 孔板培養(yǎng)，2×106個細(xì)胞/孔，每孔分別加入10 μg/ml TDA、10 μg/ml 腫瘤細(xì)胞裂解液，并以完全培養(yǎng)液(CM)作為對照，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱共孵育，第3 天收集細(xì)胞，用APC-B220和FITC-H2-Kb、FITC-I-Ab、PE-CD40 以及PE-CD86抗體染色。流式細(xì)胞儀檢測B220+細(xì)胞表面MHC 類分子及共刺激分子的表達(dá)。第7 天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用ELISA 方法檢測上清中總IgM 的水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 使用GraphPad Prism5.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以±s 表示，組間差異比較采用t 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤細(xì)胞在自然狀態(tài)下能分泌自噬小體 為證實腫瘤細(xì)胞在自然生長過程中能分泌自噬小體，我們收集自然生長狀態(tài)Hep1-6 腫瘤細(xì)胞及培養(yǎng)上清，差速離心法分離上清中的自噬小體。電鏡觀察發(fā)現(xiàn):正常腫瘤細(xì)胞中有少量具有雙層膜結(jié)構(gòu)囊泡狀自噬小體存在，且細(xì)胞培養(yǎng)上清中收集到大量的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，平均直徑在100～1 000 nm 不等(見圖1A、C)。為募集更多的自噬小體，我們通過加入萬柯阻斷短壽蛋白的降解，雷帕霉素誘導(dǎo)自噬小體的生成，并分離上清中的自噬小體，電鏡觀察結(jié)果顯示:藥物誘導(dǎo)后腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)含有大量具有雙層膜結(jié)構(gòu)的小體，且細(xì)胞培養(yǎng)上清中同樣收集到大量平均直徑在100～1 000 nm 的自噬小體(見圖1B、D)。提示:腫瘤細(xì)胞在自然生長狀態(tài)下能夠釋放自噬小體，且通過加入萬柯、雷帕霉素等藥物后，能更加有效地募集大量的自噬小體。

圖1 電鏡檢測腫瘤細(xì)胞來源自噬小體(TDA)結(jié)構(gòu)Fig.1 Tumors-derived autophagosomes (TDA)were detected by transmission electron microscopy

2.2 TDA 體外刺激B 細(xì)胞的增殖 為檢測腫瘤細(xì)胞來源的自噬小體(TDA)刺激B 細(xì)胞增殖的作用，我們將野生型C57BL/6 小鼠脾細(xì)胞用CFSE 標(biāo)記，然后分別與10μg/mlTDA、細(xì)胞裂解液、LPS共孵育5 d，收集細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果顯示，與CM 組相比，用TDA 與細(xì)胞裂解液均能顯著刺激B 細(xì)胞的增殖(CM 組為1.4%，TDA 組為28.6%，細(xì)胞裂解液組為4.4%，LPS 刺激組為41.6%)，且TDA 組B 細(xì)胞的增殖比率顯著高于細(xì)胞裂解液刺激組(見圖2)。提示:TDA 作為一種顆粒性抗原載體能有效地誘導(dǎo)小鼠脾臟B 細(xì)胞的增殖。

2.3 TDA 體外刺激B 細(xì)胞的活化 B 細(xì)胞的活化狀態(tài)可根據(jù)B 細(xì)胞表面活化標(biāo)志MHC、CD86、CD40的表達(dá)來判定［10，11］。為檢測TDA 刺激小鼠脾臟B細(xì)胞的活化作用，我們將TDA 和同樣蛋白濃度細(xì)胞裂解液分別與脾臟細(xì)胞共孵育3 d，流式細(xì)胞儀檢測B220+細(xì)胞表面MHCⅠ、Ⅱ類分子及共刺激分子CD40 和CD86 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與細(xì)胞裂解液刺激組相比，TDA 刺激顯著上調(diào)了B220+細(xì)胞表面MHCⅠ、Ⅱ類分子及CD40、CD86 共刺激分子的表達(dá)(見圖3)。提示:TDA 體外能刺激B 細(xì)胞的活化。

2.4 TDA 體外刺激B 細(xì)胞分泌IgM B 細(xì)胞是重要的抗體分泌細(xì)胞。為檢測TDA 刺激小鼠脾臟B細(xì)胞分泌抗體作用，我們用Hep1-6 和B16F10 來源的TDA 及其細(xì)胞裂解液分別刺激小鼠的脾臟細(xì)胞。第7 天取細(xì)胞培養(yǎng)上清，用ELISA 法檢測上清中的總IgM 的含量。結(jié)果顯示:與CM 組相比，兩種不同來源的TDA和細(xì)胞裂解液均能促進(jìn)脾臟細(xì)胞分泌IgM，且兩種不同來源的TDA 刺激脾臟細(xì)胞分泌IgM 的水平均顯著高于細(xì)胞裂解液刺激組(P ＜0.05);而兩種不同來源的TDA 刺激脾臟細(xì)胞分泌IgM 的水平則無明顯差異(P＜0.05)(見圖4A)。

圖2 TDA 體外刺激B 細(xì)胞的增殖作用檢測Fig.2 Detection of B cells proliferation stimulated by TDA in vitro

為進(jìn)一步檢測TDA 能否在體外直接活化B 細(xì)胞并誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生，我們將磁珠分選脾臟B 細(xì)胞分別與Hep1-6 和B16F10 來源的TDA 或腫瘤細(xì)胞裂解液共孵育，同時用細(xì)胞裂解液刺激組作為對照。結(jié)果顯示:在無輔助細(xì)胞如DCs、Mφ 存在的情況下，兩種不同來源的TDA 和細(xì)胞裂解液均能刺激純化的B 細(xì)胞分泌IgM，且TDA 刺激純化B 細(xì)胞分泌IgM 水平顯著高于腫瘤細(xì)胞裂解液刺激組(P ＜0.05)(見圖4B)。提示:腫瘤細(xì)胞來源的TDA 能有效刺激B 細(xì)胞分泌IgM。

圖3 TDA 體外刺激B 細(xì)胞表達(dá)MHC 和共刺激分子檢測Fig.3 Expression of MHC and co-stimulated molecules of B cells were stimulated by TDA in vitro

圖4 不同細(xì)胞來源的TDA 體外刺激B 細(xì)胞分泌IgM 作用檢測Fig.4 IgM secretion of B cells was induced by TDA-derived from different tumor cells in vitro

3 討論

自噬是以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)自噬小體為特征的一系列細(xì)胞“自我消化”過程［12-14］，貫穿于正常細(xì)胞生長發(fā)育和生理病理過程。研究表明，自噬過程中胞漿中可溶性蛋白和變性壞死的細(xì)胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)包裹形成自噬小體，其大小在300～900 nm之間［15，16］。本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞通過蛋白酶體抑制劑和自噬誘導(dǎo)劑處理后腫瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi)含有大量的泡狀結(jié)構(gòu)的自噬小體，該種自噬小體與腫瘤細(xì)胞自然生長狀態(tài)下釋放的自噬小體在大小形態(tài)方面并無顯著差異。

TDA 作為抗原交叉遞呈的有效載體，與完整腫瘤細(xì)胞抗原和可溶性蛋白質(zhì)抗原相比，能誘導(dǎo)更強(qiáng)CD8+T 細(xì)胞的增殖［17，18］。本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞來源TDA 與裂解液中的可溶性蛋白質(zhì)抗原相比，能更有效地誘導(dǎo)脾臟B 細(xì)胞的增殖、活化。TDA 具有多種未知的抗原表位，與多肽或可溶性蛋白相比能誘導(dǎo)更有效的免疫應(yīng)答［19］。同時，體外用TDA 刺激純化B 細(xì)胞時，同樣能有效地刺激B 活化并分泌IgM，表明TDA 能以非T 細(xì)胞依賴的方式刺激B 細(xì)胞活化分泌抗體。進(jìn)一步將TDA 刺激混合脾臟細(xì)胞中B 細(xì)胞的IgM 的分泌水平與純化的B 細(xì)胞進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)TDA 刺激的脾臟混合細(xì)胞分泌IgM 的水平明顯高于純化B 細(xì)胞組，表明TDA 刺激脾臟混合細(xì)胞中B 細(xì)胞的活化可能有其他細(xì)胞起了輔助作用，具體情況仍需進(jìn)一步研究。我們的研究發(fā)現(xiàn)TDA 在體外刺激B 細(xì)胞能導(dǎo)致IgM 的水平顯著增高，而IgG 的水平并未見變化，同時無論用TDA 體外刺激脾細(xì)胞或純化的B 細(xì)胞，均未見腫瘤抗原特異性抗體的產(chǎn)生。該結(jié)果表明TDA 雖然體外能刺激B 細(xì)胞的活化并分泌IgM，但不能導(dǎo)致抗體親和力成熟和記憶性B 細(xì)胞的形成。

Li 等［4］研究證實，DC 通過CLEC9A 受體介導(dǎo)的方式內(nèi)化并加工、提呈TDA 抗原，誘導(dǎo)T 細(xì)胞活化。B 細(xì)胞除作為抗體分泌細(xì)胞外，還作為專職抗原遞呈細(xì)胞(APC)在特定條件下發(fā)揮交叉遞呈抗原的作用［20］，而B 細(xì)胞攝取、加工并提呈TDA 抗原的作用及其作用方式還不清楚。

本文研究表明，TDA 在體外能有效地刺激B 細(xì)胞的增殖、活化，并促進(jìn)B 細(xì)胞分泌IgM。TDA 誘導(dǎo)B 細(xì)胞增殖、活化的分子機(jī)制，以及B 細(xì)胞作為APC 加工提呈TDA 抗原的作用及機(jī)制有待深入研究。

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