李曉楠 姬會(huì)春 周 燏 鄭 璐 劉軍權(quán) 朱月華

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院西院 中煤五公司職工醫(yī)院，徐州 221006)

漢黃芩素是唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的主要活性化合物之一。許多研究發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抗炎、抗病毒、神經(jīng)保護(hù)和抗腫瘤作用。用CD3 單克隆抗體和多種細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(CD3AK 細(xì)胞)是已知最有效的抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞之一。劉軍權(quán)等［1］報(bào)道，用CD3 單抗和多細(xì)胞因子聯(lián)合活化的殺傷細(xì)胞對(duì)SGC-7901、SW-1990 和SW-1116 細(xì)胞殺傷活性明顯高于常規(guī)的細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞(CIK 細(xì)胞)。本研究在預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素不僅對(duì)肝癌細(xì)胞有直接抑制作用，還能提高CD3AK細(xì)胞增殖和增強(qiáng)殺傷肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 的功能。但漢黃芩素對(duì)提高CD3AK 細(xì)胞增殖和功能的具體機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬用不同濃度的漢黃芩素對(duì)人CD3AK 細(xì)胞和肝癌細(xì)胞株進(jìn)行體外誘導(dǎo)試驗(yàn)，以研究其可能機(jī)制。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可為漢黃芩素的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 漢黃芩素(BetA)(美國(guó)Sigma 公司，純度﹥99%);人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721(上海細(xì)胞生物研究所);四甲基偶氮唑藍(lán)(Methlthiazolyl tetrazolium，MTT)和二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide DMSO)(Sigma 公司);淋巴細(xì)胞分離液(中國(guó)科學(xué)院血液病研究所);IL-1α、IL-2、IL-18(廈門特寶生物公司);IL-15 和IL-21(購(gòu)自R＆D 公司);CD3 單抗(上海免疫研究所);CD28 單抗(蘇州大學(xué)生物技術(shù)研究所);IFN-γ 購(gòu)于Abender 公司;胰蛋白酶、RPMI1640、小牛血清(均購(gòu)自Gibco 公司);人AB 血清(徐州市血站);PerCP-Cy5.5 標(biāo)記的CD3、FITC 標(biāo)記的CD56、PE 標(biāo)記的穿孔素(Pore-forming protein，PFP)、顆粒酶B (Granzyme B，GrB)、APC 標(biāo)記的CD107a (聯(lián)科生物有限公司);兔抗人ERK1/2 單克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)CST 公司);乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(日本世諾臨床診斷制品株式會(huì)社);垂直式電泳裝置、電轉(zhuǎn)移槽(北京希亞克技術(shù)有限公司);BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);ST-360 酶標(biāo)儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司);Encore 自動(dòng)生化分析儀(北京希亞克技術(shù)有限公司;熒光倒置顯微鏡TE2000-S(日本Nikon 公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司);流式細(xì)胞儀分析軟件CellQuest，每個(gè)標(biāo)本分析細(xì)胞數(shù)≥1×104。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人CD3AK 細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 取健康供者外周血10 ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞(1 500 r/min，離心15 min)，取單個(gè)核細(xì)胞層用生理鹽水洗滌3 次(1 800 r/min，8 min/次)，用RPMI 1640 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為5×108L-1，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶15 ml，同時(shí)加入相應(yīng)的細(xì)胞因子(IL-1α 10 μg/L、rhIL-2 5×104U/L、CD3 mAb 1 mg/L、IL-15 20 μg/L、IL-18 10 μg/L、IL-21 10 μg/L 和CD28 mAb 10 mg/L)，置37℃、50 ml/L CO2環(huán)境培養(yǎng)，每2 d 半量換培養(yǎng)基(含相應(yīng)的細(xì)胞因子)1 次，并調(diào)整細(xì)胞密度為5×108L-1。收集培養(yǎng)7 d 的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 不同濃度的漢黃芩素對(duì)CD3AK 細(xì)胞增殖的測(cè)定 將培養(yǎng)成功的CD3AK 細(xì)胞配成2×107L-1細(xì)胞懸液加入96 孔板，每孔180 μl，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的漢黃芩素(濃度分別至0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.1、6.25、12.5、25、50、100 mg/L)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h;在培養(yǎng)結(jié)束前4 h 每孔加入CCK-8 10 μl，繼續(xù)分別培養(yǎng)2、4、6 h 后在酶標(biāo)儀450 nm 處檢測(cè)各孔吸光值(OD)，并記錄結(jié)果。

1.2.3 漢黃芩素對(duì)肝癌細(xì)胞株生長(zhǎng)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721 細(xì)胞配成3×107L-1的細(xì)胞懸液加入96 孔板，每孔180 μl，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組;將培養(yǎng)板放入37℃、50 ml/L 培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的漢黃芩素(濃度分別至0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.1、6.25、12.5、25、50、100 mg/L)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h;在培養(yǎng)結(jié)束前4 h 加入MTT 20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去上清，加入DMSO 150 μl，使甲瓚完全溶解，于酶標(biāo)儀495 nm 處檢測(cè)各孔吸光值(OD)記錄結(jié)果。細(xì)胞抑制率IR(%)=(對(duì)照OD 值)-(實(shí)驗(yàn)OD 值)/(對(duì)照OD)×100%。相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.4 FCM 檢測(cè)漢黃芩素作用后的CD3AK 細(xì)胞中GrB、IFN-γ、PFP、CD107a 的表達(dá) 根據(jù)用CCK-8方法對(duì)漢黃芩素作用CD3AK 細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇終濃度分別為0.2、0.8、3.1、12.5、50 mg/L 的漢黃芩素進(jìn)行CD3AK 細(xì)胞誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。收集經(jīng)藥物誘導(dǎo)48 h 和CD3AK 細(xì)胞，洗滌1 次后將細(xì)胞調(diào)整密度為1×1010L-1，取其100 μl 細(xì)胞懸液加入PerCPCy5.5 標(biāo)記的CD3 抗體20 μl，室溫避光孵育30 min，PBS 洗滌，加入100 μl 破膜劑A，室溫避光孵育15 min，PBS 洗滌，加入100 μl 破膜劑B，同時(shí)分別在試管中加入anti-GrB-PE 和anti-PFP-PE 各5 μl，設(shè)置同型對(duì)照抗體管，共同孵育15 min，PBS 洗滌后，加入PBS 500 μl，流式細(xì)胞儀檢測(cè)GrB 和PFP百分?jǐn)?shù);另取經(jīng)漢黃芩素作用后的CD3AK 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×1010L-1，取100 μl 細(xì)胞懸液，加入PerCP-Cy5.5 標(biāo)記的CD3 抗體20 μl，室溫避光孵育30 min，PBS 洗滌，加入APC 標(biāo)記的鼠抗人anti-CD107a 5 μl，同時(shí)設(shè)同型對(duì)照抗體管，流式細(xì)胞儀術(shù)測(cè)定CD3AK 細(xì)胞中CD107a 的百分?jǐn)?shù)。

1.2.5 檢測(cè)漢黃芩素作用后的CD3AK 細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 殺傷活性 按劉軍權(quán)等［2］方法，取經(jīng)不同濃度漢黃芩素誘導(dǎo)48 h 后的CD3AK 細(xì)胞配成2×109L-1，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期靶細(xì)胞SMMC-7721配成2×108L-1的細(xì)胞懸液，用RPMI1640 培養(yǎng)基洗滌3 遍，將效靶細(xì)胞按10 ∶1比例混合，以500 r/min離心5 min，置37℃、50 ml/L CO2孵箱中孵育6 h后，輕輕混勻細(xì)胞，再以1 500 r/min 離心10 min。收集上清液在全自動(dòng)生化分析儀(Olympus AU1000)340 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定光密度(A)。相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。殺傷活性(%)=(A 實(shí)驗(yàn)組-A 效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組)/(A 靶細(xì)胞最大釋放組-A 靶細(xì)胞自然釋放組)×100%。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)漢黃芩素作用前后CD3AK細(xì)胞p-ERK 表達(dá)的變化 取培養(yǎng)7 d 的CD3AK 細(xì)胞，配成5×108L-1細(xì)胞懸液，分別接種于6 孔板，3 ml/孔，加入漢黃芩素(終濃度分別至50、12.5、3.2、0.8 和0.2 mg/L)，同時(shí)設(shè)置不加漢黃芩素對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，加細(xì)胞裂解液500 μl 裂解細(xì)胞，提取蛋白，F(xiàn)orlin 檢測(cè)蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉2 h，一抗孵育:加入新鮮配制的1 ∶500 稀釋鼠抗人p-ERK1/2 抗體，置于4℃冰箱過(guò)夜;二抗孵育:加入1 ∶1 000 稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗鼠IgG，將濾膜浸入NBT/BCIP 顯色液，終止反應(yīng)后取出條帶晾干，ODSEEY 上機(jī)掃描。用Image J 圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.7 侵襲實(shí)驗(yàn)(Invasion assay) 按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為對(duì)照組和50、12.5、3.2、0.8、0.2 mg/L 漢黃芩干預(yù)組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721 細(xì)胞，調(diào)整密度為1.0×108L-1，吸取200 μl 細(xì)胞懸液加入24 孔侵襲小室(transwell chambers)的上室，下室緩慢加入500 μl 培養(yǎng)基，37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h，取出小室用RPMI1640 洗滌3 次，用棉球擦去上室面的細(xì)胞，下室面用無(wú)水乙醇固定10 min，PBS 漂洗后用0.1%的結(jié)晶紫染色10 min，PBS 漂洗3 次。顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)transwell 小孔的細(xì)胞，觀察5 個(gè)視野并拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。侵襲抑制率(IR)=(1-實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.8 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)(Wound healing assay) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞SMMC-7721 用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)SMMC-7721 細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)到90% 時(shí)，用200 μl 的移液器槍頭，在培養(yǎng)板每孔中央的縱軸方向劃痕，吸去原培養(yǎng)基，用RPMI1640 培養(yǎng)基洗2次，去除劃痕區(qū)的漂浮細(xì)胞。每孔加入10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)5 ml，然后分別加入終濃度為50、12.5、3.2、0.8、0.2 mg/L 漢黃芩素，37℃、50 ml/L CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育，在培養(yǎng)0、24、48 h 時(shí)分別于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞融合生長(zhǎng)情況并拍照，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)均以±s 表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物誘導(dǎo)前后CD3AK 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及純度檢測(cè) CD3AK 細(xì)胞經(jīng)不同濃度漢黃芩素誘導(dǎo)后，顯微鏡下可見(jiàn)CD3AK 細(xì)胞體積增大，成圓形或橢圓形，胞膜光滑，細(xì)胞數(shù)量增多，部分形成集落，F(xiàn)CM檢測(cè)此濃度下CD3AK 細(xì)胞表型，顯示CD3+CD56+比率達(dá)30.5%，結(jié)果見(jiàn)圖1、2。

2.2 漢黃芩素對(duì)CD3AK 細(xì)胞增殖的影響 CD3AK 細(xì)胞經(jīng)不同濃度漢黃芩素誘導(dǎo)后，其細(xì)胞增殖率出現(xiàn)明顯變化，在0.025～25 mg/L 濃度范圍內(nèi)，漢黃芩素能明顯促進(jìn)CD3AK 細(xì)胞增殖，漢黃芩素濃度為3.2 mg/L 時(shí)細(xì)胞增殖率最明顯，與對(duì)照組(0 mg/L)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.3 MTT 法檢測(cè)漢黃芩素對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 經(jīng)濃度為0.8～100 mg/L 漢黃芩素作用72 h 后的SMMC-7721 細(xì)胞與對(duì)照組比較均有明顯的抑制作用，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖1 培養(yǎng)前后顯微鏡下CD3AK 細(xì)胞形態(tài)(×400)Fig.1 Morphology of human CD3AK cells under microscope after Wogonin induced 48 h (×400)

圖2 PBMC 培養(yǎng)前后CD3AK 細(xì)胞表型分析Fig.2 Phenotype analysis of human CD3AK cells after Wogonin-induced

圖3 漢黃岑素對(duì)CD3AK 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of Wogonin on proliferation of CD3AK cells

圖4 不同濃度漢黃岑素對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of Wogonin on proliferation of SMMC-7721

2.4 漢黃芩素對(duì)CD3AK 細(xì)胞顆粒酶B、穿孔素和CD107a 表達(dá)的影響 經(jīng)0.4～50 mg/L 漢黃芩素作用48 h 后的CD3AK 細(xì)胞，其顆粒酶B、穿孔素及CD107a 的表達(dá)均有所上調(diào)。當(dāng)漢黃芩素濃度為3.2 mg/L 時(shí)，顆粒酶B、穿孔素及CD107a 分別為76.9%、30.5%和83.6%，顯著高于對(duì)照組(分別為65.4%、25.1%和75.3%)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1、圖5。

2.5 漢黃芩素對(duì)CD3AK 細(xì)胞殺傷肝癌SMMC-7721細(xì)胞活性的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，濃度為0.2～6.2 mg/L 漢黃芩素作用48 h 后的CD3AK 細(xì)胞，對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞的殺傷活性顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在3.2 mg/L 時(shí)殺傷活性達(dá)最高(60.4%)，與對(duì)照組(漢黃芩素為0 mg/L)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。漢黃芩素濃度高于6.2 mg/L 時(shí)，殺傷活性隨濃度增高逐漸降低，當(dāng)濃度為25 mg/L 時(shí)，可抑制CD3AK 細(xì)胞對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞的殺傷活性(P＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖6。

表1 漢黃芩素對(duì)CD3AK 細(xì)胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達(dá)的影響Tab.1 Effect of Wogonin on expression of GrB，PFP and CD107a

圖5 3.2 mg/L 漢黃芩素誘導(dǎo)后CD3AK 細(xì)胞顆粒酶、穿孔素和CD107a 的表達(dá)Fig.5 Expression of perforin，GrB and CD107a of CD3AK cells induced by 3.2 mg/L Wogonin

2.6 漢黃芩素對(duì)CD3AK 細(xì)胞ERK1/2 表達(dá)的影響不同濃度漢黃芩素作用48 h 后的CD3AK 細(xì)胞其ERK1/2 蛋白表達(dá)較對(duì)照組均有所上調(diào)，濃度在12.5～0.8 mg/L 時(shí)，ERK1/2 蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組，以3.2 mg/L 最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖7、8。

2.7 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)(Wound healing assay) 經(jīng)濃度為50、12.5、3.2、0.8、0.2 mg/L 漢黃芩素誘導(dǎo)48 h后，肝癌細(xì)胞SMMC-7721 的融合率以3.2 mg/L 時(shí)最低，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他漢黃芩濃度組誘導(dǎo)的SMMC-7721 融合率也較對(duì)照組低。結(jié)果見(jiàn)圖9。

2.8 侵襲實(shí)驗(yàn)(Invasion assay) 經(jīng)濃度為50、12.5、3.2、0.8、0.2 mg/L 漢黃芩素誘導(dǎo)48 h 后，肝癌細(xì)胞SMMC-7721 通過(guò)transwell 小孔細(xì)胞數(shù)以漢黃芩素濃度為12.5 mg/L 時(shí)最低;濃度在12.5～0.8 mg/L 時(shí)，細(xì)胞穿過(guò)率也低于對(duì)照組，各漢黃芩素誘導(dǎo)組SMMC-7721 細(xì)胞穿過(guò)率與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，藥物誘導(dǎo)的各組侵襲抑制率均低于對(duì)照組。結(jié)果見(jiàn)圖10。

圖6 經(jīng)漢黃芩素誘導(dǎo)后的CD3AK 細(xì)胞對(duì)SMMC-7721殺傷活性Fig.6 Cytotoxicity of CD3AK cells treated by Wogonin

圖7 漢黃芩素誘導(dǎo)48 h 后CD3AK 細(xì)胞ERK1/2 的表達(dá)Fig.7 Expression of ERK1/2 induced by Wogonin for 48 h

圖8 漢黃芩素誘導(dǎo)48 h 后CD3AK 細(xì)胞ERK1/2 的表達(dá)Fig.8 Expression of ERK1/2 after treated by Wogonin for 48 h

圖9 3.2 mg/L 漢黃芩素誘導(dǎo)后SMMC-7721 細(xì)胞融合結(jié)果比較Fig.9 Wound healing assay result of SMMC-7721 after treated by 3.2 mg/L Wogonin

圖10 12.5 mg/L 漢黃芩素誘導(dǎo)后SMMC-7721 細(xì)胞穿過(guò)率結(jié)果比較Fig.10 Invasion assay result of SMMC-7721 treated by 12.5 mg/L Wogonin

3 討論

肝癌是指肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤，是惡性程度及轉(zhuǎn)移率很高的腫瘤之一，其發(fā)病率位居各種腫瘤的第5 位［3］。漢黃芩素是唇形科植物黃芩主要的活性化合物之一，存在于植物的根莖中，屬于黃酮類化合物，在體內(nèi)和體外都具有顯著抗炎、抗病毒、神經(jīng)保護(hù)和抗腫瘤作用。國(guó)內(nèi)外許多研究發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素具有顯著抑制人卵巢癌細(xì)胞A2780、人肝癌細(xì)胞SK-HEP-1、人乳腺癌細(xì)胞等的作用;另外應(yīng)用腫瘤致死劑量的漢黃芩素對(duì)正常免疫細(xì)胞無(wú)沒(méi)有毒性;動(dòng)物試驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)，漢黃芩素對(duì)荷載腫瘤的動(dòng)物有效治療劑量對(duì)動(dòng)物無(wú)毒副作用［4-8］。因此對(duì)漢黃芩素的進(jìn)一步研究具有重要意義。目前國(guó)內(nèi)外少有應(yīng)用漢黃芩素提高CD3AK 細(xì)胞殺傷肝癌細(xì)胞研究的報(bào)道。也無(wú)應(yīng)用漢黃芩素提高免疫效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤敏感性的研究。為此本課題從漢黃芩素抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)分子(細(xì)胞遷移、Ezrin蛋白等)、漢黃芩素提高CD3AK 細(xì)胞增殖和殺傷腫瘤活性的作用機(jī)理及漢黃芩素提高CD3AK 細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞殺傷敏感性等途徑進(jìn)行系列研究。

CD3AK (anti-CD3 antibody induced activated killer cells)是指在體外用抗人CD3 單克隆抗體和IL-2 等細(xì)胞因子激活的殺傷細(xì)胞。CD3AK 細(xì)胞是以CD3+CD8+T 為主的異質(zhì)群細(xì)胞，有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、在體內(nèi)分泌細(xì)胞因子能力強(qiáng)以及臨床應(yīng)用安全性高及低毒副作用等優(yōu)勢(shì)［9-13］，已成為腫瘤細(xì)胞免疫治療的重要效應(yīng)細(xì)胞之一。在免疫原性強(qiáng)的腫瘤病人體外培養(yǎng)的CD3AK 細(xì)胞中可有一定數(shù)量的腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒T 細(xì)胞。

PFP 是一種糖蛋白，能以鈣離子依賴方式在靶細(xì)胞膜上形成穿孔素管狀通道，進(jìn)而導(dǎo)致靶細(xì)胞滲透性溶解破壞［14］。GraB 是具有天冬氨酸酶活性的絲氨酸蛋白酶，它能夠通過(guò)caspase 依賴途徑、不依賴caspase 的胞質(zhì)途徑及直接入核途徑殺傷靶細(xì)胞［15］。CD107a 分子是抗原特異性細(xì)胞活化以后的脫顆粒過(guò)程密切相關(guān)蛋白，是殺傷性T 細(xì)胞脫顆粒以后，細(xì)胞溶解性顆粒的胞膜與T 細(xì)胞膜融合的證據(jù)［16］。本研究FCM 結(jié)果顯示，濃度為0.8～3.2 mg/L 的漢黃芩素作用后，CD3AK 細(xì)胞表面的PFP、GraB 和CD107a 的表達(dá)率均明顯高于對(duì)照組(P ＜0.05)，提示上述濃度的漢黃芩素能夠上調(diào)細(xì)胞PFP 和GraB 的表達(dá)，當(dāng)漢黃芩素濃度為50 mg/L時(shí)，PFP 的表達(dá)率低于對(duì)照組(P＜0.05)，提示高濃度的漢黃芩素能夠下調(diào)CD3AK 細(xì)胞的功能。本實(shí)驗(yàn)表明，濃度為0.2～6.2 mg/L 的漢黃芩素作用CD3AK 細(xì)胞48 h 后，對(duì)肝癌SMMC-7721 細(xì)胞株細(xì)胞的殺傷活性隨著漢黃芩素濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，濃度為3.2 mg/L 時(shí)達(dá)峰值，大于6.2 mg/L 時(shí)，其殺傷活性呈下降趨勢(shì)，提示漢黃芩素對(duì)CD3AK細(xì)胞的作用存在濃度窗現(xiàn)象。

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)是ERK 家族的重要成員，其活化形式是磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)，通常認(rèn)為ERK 磷酸化代表ras/raf/MAPK 信號(hào)通路的活化。胞外刺激可經(jīng)G 蛋白受體、生長(zhǎng)因子受體和酪氨酸蛋白激酶受體，經(jīng)Ras-Raf-MEK-ERK 級(jí)聯(lián)信號(hào)激活ERK，通過(guò)影響下游效應(yīng)分子的活性，在細(xì)胞的活化、增殖和凋亡中起著重要作用［17，18］。我們的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素濃度在12.5～0.8 mg/L 時(shí)，ERK1/2 蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，提示漢黃芩素能夠上調(diào)細(xì)胞中p-ERK1/2的表達(dá)，考慮為漢黃芩素激活細(xì)胞的ras/raf/MAPK 信號(hào)通路，進(jìn)而引起CD3AK 細(xì)胞的增殖。當(dāng)漢黃芩素濃度達(dá)50 mg/L 時(shí)，細(xì)胞p-ERK1/2 蛋白的表達(dá)量較0.15～10 mg/L 時(shí)低，考慮為高濃度的漢黃芩素對(duì)CD3AK 細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，可能為p-ERK1/2 與CD3AK 細(xì)胞凋亡有關(guān)。漢黃芩素影響CD3AK 細(xì)胞增殖和體外殺傷活性的具體機(jī)制目前尚不清楚，推測(cè)可能與胞內(nèi)信號(hào)通路的異?；罨嘘P(guān)。T 細(xì)胞活化時(shí)信號(hào)傳遞由T 細(xì)胞表面抗原識(shí)別受體(T cell receptor，TCR)介導(dǎo)，外來(lái)信號(hào)經(jīng)受體及相關(guān)蛋白傳遞給胞內(nèi)的蛋白酪氨酸激酶，此后啟動(dòng)三條下游信號(hào)途徑:一為磷脂酶 C-γ1(PhospholipaseC-γ1，PLC-γ1)介導(dǎo)的信號(hào)途徑，二為Ras-MAPK 途徑，三為共刺激分子介導(dǎo)的磷酸肌醇激酶-3(PI3K)輔助信號(hào)途徑。這3 條途徑中都存在一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié):活化信號(hào)要依靠激活的ZAP-70 磷酸化接頭蛋白LAT 和SLP-76 進(jìn)行進(jìn)一步的傳遞。有研究發(fā)現(xiàn)，LAT 經(jīng)酪氨酸激酶活化后，與SLP-76 通過(guò)Gads 結(jié)合成復(fù)合體，募集連接PLCγ1、Vav、PI3K、Itk 以及Sos 等多種重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子，形成以LAT 為核心的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體，激活T細(xì)胞活化信號(hào)傳導(dǎo)的下游途徑(磷酯酰肌醇途徑和Ras-MAPK 途徑)。ERK1/2 位于胞漿內(nèi)，其信號(hào)通路被認(rèn)為是經(jīng)典的絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路，一旦被激活，能迅速穿過(guò)核膜并通過(guò)磷酸化反應(yīng)調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子的活性，引起特定蛋白的表達(dá)或活性改變，與細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、炎癥、應(yīng)激和病毒的感染復(fù)制等過(guò)程密切相關(guān)［19-21］。這些研究顯示轉(zhuǎn)錄因子NF-AT、AP-1、NF-κB 可能是ERK1/2 信號(hào)通路影響T 淋巴細(xì)胞活化、增殖、凋亡等生物學(xué)行為的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

CD3AK 細(xì)胞是腫瘤治療的免疫效應(yīng)細(xì)胞之一，具有廣闊應(yīng)用前景。細(xì)胞免疫治療的療效的關(guān)鍵是能否培養(yǎng)出高度免疫活性的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞。因此如何獲得足夠數(shù)量并具有高細(xì)胞毒活性的效應(yīng)細(xì)胞已成為CD3AK 細(xì)胞治療成功的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)漢黃芩素能激活ERK1/2 信號(hào)通路促進(jìn)CD3AK 細(xì)胞增殖，并通過(guò)提高免疫效應(yīng)細(xì)胞的顆粒酶B、穿孔素及CD107a 的表達(dá)提高其殺傷活性。同時(shí)漢黃芩素還能直接抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721 生長(zhǎng)，減少SMMC-7721 細(xì)胞的遷移率，減緩SMMC-7721 細(xì)胞生長(zhǎng)融合時(shí)間。這些結(jié)果為漢黃芩素的臨床應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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