劉雨晴 尹寶靚 姚毅波 王子兵③ (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院腫瘤科，新鄉(xiāng) 453003)

長期以來，腫瘤疫苗是免疫治療領(lǐng)域研究的重要內(nèi)容之一，然而臨床或臨床前的試驗結(jié)果顯得不甚理想［1］。為了最大限度提高癌癥疫苗的療效，目前大多數(shù)研究致力于選擇合適的腫瘤抗原、優(yōu)化抗原肽與提高抗原提呈細(xì)胞及T 細(xì)胞之間的相互作用和阻斷腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制機(jī)制［2-4］。然而，作為疫苗的重要組成成分之一的佐劑卻沒有引起足夠的重視。到目前為止，人們?nèi)匀徊磺宄[瘤疫苗療效不佳的原因是否與佐劑使用不當(dāng)有關(guān)。在本項研究中，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤疫苗研究中最常用的IFA 能夠誘導(dǎo)一群具有免疫抑制作用的髓樣細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 小鼠和細(xì)胞系 BALB/c 小鼠(6～8 周)購自維通利華(北京)。所有小鼠均飼養(yǎng)于中科院生物物理研究所SPF 級動物房。TSA 細(xì)胞系來自BALB/c 小鼠，用含10% NCS 的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 流式細(xì)胞檢測 用兩片載玻片磨脾，用PBS懸起，用金屬網(wǎng)過濾，用紅細(xì)胞裂解液裂解，將得到的細(xì)胞沉淀重懸于含2%小牛血清的PBS 溶液中，4℃，1 500 r/min 離心5 min，收集細(xì)胞;加入熒光標(biāo)記的抗體溶液，冰上避光孵育30 min;FACS Buffer洗去多余的抗體，將細(xì)胞重懸于300 μl FACS Buffer中;FACSCalibur 檢測樣品熒光。

1.3 CD11b+細(xì)胞分離 分離CD11b+細(xì)胞時，將5×106～6×106個脾細(xì)胞懸于PBS，然后與5 μg生物素化的Anti-CD11b mAb 共同孵育15 min。用PBS 洗滌兩次后與鏈酶親和素磁珠4℃孵育15 min。然后用MiniMACS 柱分離CD11b+細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞增殖能力分析 將正常小鼠的脾細(xì)胞鋪到96 孔板上，用Con A 作為刺激源，然后加入PBS或IFA 注射后第7、14 和21 天時從對照小鼠(PBS處理)或IFA 處理小鼠脾臟中分離的CD11b+細(xì)胞培養(yǎng)。72 h 后向各孔中加入四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去掉上清，向各孔中加入二甲基亞砜。495 nm 處讀取吸光度值。結(jié)果以相對OD 值進(jìn)行計算，其計算方法是:每個孔檢測值/不含CD11b+細(xì)胞孔的平均OD 值。

1.5 細(xì)胞因子檢測 將TSA 腫瘤細(xì)胞用γ 射線照射，然后免疫小鼠，14 d 之后制備脾單細(xì)胞懸液，以2 × 106/孔的濃度鋪到24 孔板上，然后向各個孔中加入照射的TSA 細(xì)胞進(jìn)行刺激(與脾細(xì)胞的比例為1 ∶40)。為了評價CD11b+細(xì)胞對IFN-γ 分泌量的影響，在上述體系中分別加入4 × 105個PBS 或IFA注射后第14 天時取得的對照組小鼠或IFA 免疫小鼠的CD11b+細(xì)胞。培養(yǎng)3、5 和7 d 后，使用ELISA試劑盒檢測上清中的IFN-γ 量。收集上清，檢測細(xì)胞因子IFN-γ 的分泌量。

2 結(jié)果

2.1 IFA 可誘導(dǎo)CD11b+細(xì)胞產(chǎn)生 根據(jù)我們以前的研究，單次注射CFA 可誘使小鼠脾臟增大，脾細(xì)胞總數(shù)增加［5］。對大顆粒細(xì)胞進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，IFA處理的小鼠脾臟中CD11b+細(xì)胞明顯增多。對這群細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)CD11b+細(xì)胞都表達(dá)Gr-1 分子，并且Gr-1 分子的熒光強(qiáng)度明顯小于對照組(圖1)。

2.2 CD11b+細(xì)胞低表達(dá)MHCⅠ類分子 我們接著比較了PBS 處理組和IFA 處理組CD11b+細(xì)胞的分子表型區(qū)別。與正常小鼠，相比接受IFA 處理的小鼠脾臟中CD11b+細(xì)胞上CD80、CD69、CD54、CD106和CD11c 的表達(dá)沒有明顯不同(結(jié)果未顯示)，但組織相容性抗原復(fù)合物分子H2-Kd的表達(dá)明顯降低(圖2)。

圖1 IFA 處理的小鼠脾臟中CD11b+細(xì)胞增多Fig.1 Increased CD11b+ cells in spleen of IFAtreated mice

圖2 IFA 誘導(dǎo)的CD11b+細(xì)胞MHCⅠ類分子表達(dá)水平降低Fig.2 Low level expression of MHCⅠmolecule in IFAinduced CD11b+ cells

圖3 IFA 誘導(dǎo)的CD11b+細(xì)胞抑制T 細(xì)胞增殖Fig.3 IFA-induced CD11b+ cells inhibit T cell proliferation

圖4 IFA 誘導(dǎo)的CD11b+細(xì)胞抑制IFN-γ 的產(chǎn)生Fig.4 IFA-induced CD11b+ cells inhibit IFN-γ production

2.3 CD11b+細(xì)胞抑制T 細(xì)胞增殖 為了確定IFA誘導(dǎo)的CD11b+細(xì)胞是否直接影響T 細(xì)胞增殖，將制備好的正常小鼠來源的脾細(xì)胞與IFA 誘導(dǎo)的CD11b+細(xì)胞共同孵育，并使用Con A 作為T 細(xì)胞增殖的刺激劑。結(jié)果顯示，與對照組相比，IFA 誘導(dǎo)的CD11b+細(xì)胞提示能夠明顯抑制T 細(xì)胞增殖(圖3)。

2.4 CD11b+細(xì)胞抑制T 細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ IFN-γ主要是血源性細(xì)胞分泌［6，7］，與腫瘤的排斥密切相關(guān)。將從TSA 細(xì)胞免疫后小鼠分離的脾細(xì)胞與從PBS 或IFA 免疫小鼠分離的CD11b+細(xì)胞共同培養(yǎng)，然后用照射后的TSA 細(xì)胞作為刺激原進(jìn)行刺激。培養(yǎng)第5 天和第7 天檢測發(fā)現(xiàn)，TSA 免疫脾細(xì)胞(主要是T 細(xì)胞)能產(chǎn)生大量的IFN-γ。當(dāng)加入IFA 誘導(dǎo)的CD11b+細(xì)胞后，免疫脾細(xì)胞分泌IFN-γ 的量大大減少。這些結(jié)果表明，CD11b+細(xì)胞能夠抑制IFNγ 的產(chǎn)生。

3 討論

佐劑是腫瘤疫苗的重要組成部分。然而，佐劑是怎樣影響疫苗的治療效果還不是很清楚。前期的研究發(fā)現(xiàn)，完全弗氏佐劑(CFA)和IFA 均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生CD11b+細(xì)胞，并且CFA 誘導(dǎo)的這群細(xì)胞能夠通過抑制T 細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ 和促進(jìn)T 細(xì)胞凋亡而發(fā)揮免疫抑制作用，但沒有對IFA 誘導(dǎo)的該群細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的研究［5］。本項研究發(fā)現(xiàn)，IFA 誘導(dǎo)的CD11b+細(xì)胞同樣具有免疫抑制功能。這些發(fā)現(xiàn)有助于解釋使用弗氏佐劑的腫瘤疫苗為什么臨床效果總是不佳，從而強(qiáng)調(diào)了腫瘤主動免疫治療時佐劑選擇的重要性。

IFA 誘導(dǎo)的CD11b+細(xì)胞與腫瘤誘導(dǎo)的骨髓來源的抑制性細(xì)胞(MDSC)有許多共同特征。例如，它們都表達(dá)CD11b 和Gr-1［8，9］。然而，它們之間仍有一些差異存在。表型上，CD11b+細(xì)胞較少表達(dá)MHC Ⅰ類分子。在功能上，CD11b+細(xì)胞抑制Con A誘導(dǎo)的T 細(xì)胞增殖，抑制腫瘤抗原誘導(dǎo)的T 細(xì)胞分泌IFN-γ。關(guān)于抑制機(jī)制仍需要更多的研究證實。

我們的發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義。其中一點就是體內(nèi)阻斷CD11b+的生成或者功能可能會阻斷疫苗中弗氏佐劑的破壞作用。有意思的是，體外已有研究證明干擾其功能可減輕腫瘤誘導(dǎo)的MDSC 對T細(xì)胞的抑制作用、恢復(fù)T 細(xì)胞功能和部分恢復(fù)抗腫瘤免疫效果［10］。這一結(jié)果指出了一種可以改善腫瘤免疫效果的方法。

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