劉雨晴 尹寶靚 姚毅波 王子兵③ (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院腫瘤科,新鄉(xiāng) 453003)
長期以來,腫瘤疫苗是免疫治療領(lǐng)域研究的重要內(nèi)容之一,然而臨床或臨床前的試驗結(jié)果顯得不甚理想[1]。為了最大限度提高癌癥疫苗的療效,目前大多數(shù)研究致力于選擇合適的腫瘤抗原、優(yōu)化抗原肽與提高抗原提呈細(xì)胞及T 細(xì)胞之間的相互作用和阻斷腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制機(jī)制[2-4]。然而,作為疫苗的重要組成成分之一的佐劑卻沒有引起足夠的重視。到目前為止,人們?nèi)匀徊磺宄[瘤疫苗療效不佳的原因是否與佐劑使用不當(dāng)有關(guān)。在本項研究中,我們發(fā)現(xiàn)腫瘤疫苗研究中最常用的IFA 能夠誘導(dǎo)一群具有免疫抑制作用的髓樣細(xì)胞。
1.1 小鼠和細(xì)胞系 BALB/c 小鼠(6~8 周)購自維通利華(北京)。所有小鼠均飼養(yǎng)于中科院生物物理研究所SPF 級動物房。TSA 細(xì)胞系來自BALB/c 小鼠,用含10% NCS 的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。
1.2 流式細(xì)胞檢測 用兩片載玻片磨脾,用PBS懸起,用金屬網(wǎng)過濾,用紅細(xì)胞裂解液裂解,將得到的細(xì)胞沉淀重懸于含2%小牛血清的PBS 溶液中,4℃,1 500 r/min 離心5 min,收集細(xì)胞;加入熒光標(biāo)記的抗體溶液,冰上避光孵育30 min;FACS Buffer洗去多余的抗體,將細(xì)胞重懸于300 μl FACS Buffer中;FACSCalibur 檢測樣品熒光。
1.3 CD11b+細(xì)胞分離 分離CD11b+細(xì)胞時,將5×106~6×106個脾細(xì)胞懸于PBS,然后與5 μg生物素化的Anti-CD11b mAb 共同孵育15 min。用PBS 洗滌兩次后與鏈酶親和素磁珠4℃孵育15 min。然后用MiniMACS 柱分離CD11b+細(xì)胞。
1.4 細(xì)胞增殖能力分析 將正常小鼠的脾細(xì)胞鋪到96 孔板上,用Con A 作為刺激源,然后加入PBS或IFA 注射后第7、14 和21 天時從對照小鼠(PBS處理)或IFA 處理小鼠脾臟中分離的CD11b+細(xì)胞培養(yǎng)。72 h 后向各孔中加入四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT),在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,去掉上清,向各孔中加入二甲基亞砜。495 nm 處讀取吸光度值。結(jié)果以相對OD 值進(jìn)行計算,其計算方法是:每個孔檢測值/不含CD11b+細(xì)胞孔的平均OD 值。
1.5 細(xì)胞因子檢測 將TSA 腫瘤細(xì)胞用γ 射線照射,然后免疫小鼠,14 d 之后制備脾單細(xì)胞懸液,以2 × 106/孔的濃度鋪到24 孔板上,然后向各個孔中加入照射的TSA 細(xì)胞進(jìn)行刺激(與脾細(xì)胞的比例為1 ∶40)。為了評價CD11b+細(xì)胞對IFN-γ 分泌量的影響,在上述體系中分別加入4 × 105個PBS 或IFA注射后第14 天時取得的對照組小鼠或IFA 免疫小鼠的CD11b+細(xì)胞。培養(yǎng)3、5 和7 d 后,使用ELISA試劑盒檢測上清中的IFN-γ 量。收集上清,檢測細(xì)胞因子IFN-γ 的分泌量。
2.1 IFA 可誘導(dǎo)CD11b+細(xì)胞產(chǎn)生 根據(jù)我們以前的研究,單次注射CFA 可誘使小鼠脾臟增大,脾細(xì)胞總數(shù)增加[5]。對大顆粒細(xì)胞進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),IFA處理的小鼠脾臟中CD11b+細(xì)胞明顯增多。對這群細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),大多數(shù)CD11b+細(xì)胞都表達(dá)Gr-1 分子,并且Gr-1 分子的熒光強(qiáng)度明顯小于對照組(圖1)。
2.2 CD11b+細(xì)胞低表達(dá)MHCⅠ類分子 我們接著比較了PBS 處理組和IFA 處理組CD11b+細(xì)胞的分子表型區(qū)別。與正常小鼠,相比接受IFA 處理的小鼠脾臟中CD11b+細(xì)胞上CD80、CD69、CD54、CD106和CD11c 的表達(dá)沒有明顯不同(結(jié)果未顯示),但組織相容性抗原復(fù)合物分子H2-Kd的表達(dá)明顯降低(圖2)。
圖1 IFA 處理的小鼠脾臟中CD11b+細(xì)胞增多Fig.1 Increased CD11b+ cells in spleen of IFAtreated mice
圖2 IFA 誘導(dǎo)的CD11b+細(xì)胞MHCⅠ類分子表達(dá)水平降低Fig.2 Low level expression of MHCⅠmolecule in IFAinduced CD11b+ cells
圖3 IFA 誘導(dǎo)的CD11b+細(xì)胞抑制T 細(xì)胞增殖Fig.3 IFA-induced CD11b+ cells inhibit T cell proliferation
圖4 IFA 誘導(dǎo)的CD11b+細(xì)胞抑制IFN-γ 的產(chǎn)生Fig.4 IFA-induced CD11b+ cells inhibit IFN-γ production
2.3 CD11b+細(xì)胞抑制T 細(xì)胞增殖 為了確定IFA誘導(dǎo)的CD11b+細(xì)胞是否直接影響T 細(xì)胞增殖,將制備好的正常小鼠來源的脾細(xì)胞與IFA 誘導(dǎo)的CD11b+細(xì)胞共同孵育,并使用Con A 作為T 細(xì)胞增殖的刺激劑。結(jié)果顯示,與對照組相比,IFA 誘導(dǎo)的CD11b+細(xì)胞提示能夠明顯抑制T 細(xì)胞增殖(圖3)。
2.4 CD11b+細(xì)胞抑制T 細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ IFN-γ主要是血源性細(xì)胞分泌[6,7],與腫瘤的排斥密切相關(guān)。將從TSA 細(xì)胞免疫后小鼠分離的脾細(xì)胞與從PBS 或IFA 免疫小鼠分離的CD11b+細(xì)胞共同培養(yǎng),然后用照射后的TSA 細(xì)胞作為刺激原進(jìn)行刺激。培養(yǎng)第5 天和第7 天檢測發(fā)現(xiàn),TSA 免疫脾細(xì)胞(主要是T 細(xì)胞)能產(chǎn)生大量的IFN-γ。當(dāng)加入IFA 誘導(dǎo)的CD11b+細(xì)胞后,免疫脾細(xì)胞分泌IFN-γ 的量大大減少。這些結(jié)果表明,CD11b+細(xì)胞能夠抑制IFNγ 的產(chǎn)生。
佐劑是腫瘤疫苗的重要組成部分。然而,佐劑是怎樣影響疫苗的治療效果還不是很清楚。前期的研究發(fā)現(xiàn),完全弗氏佐劑(CFA)和IFA 均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生CD11b+細(xì)胞,并且CFA 誘導(dǎo)的這群細(xì)胞能夠通過抑制T 細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ 和促進(jìn)T 細(xì)胞凋亡而發(fā)揮免疫抑制作用,但沒有對IFA 誘導(dǎo)的該群細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的研究[5]。本項研究發(fā)現(xiàn),IFA 誘導(dǎo)的CD11b+細(xì)胞同樣具有免疫抑制功能。這些發(fā)現(xiàn)有助于解釋使用弗氏佐劑的腫瘤疫苗為什么臨床效果總是不佳,從而強(qiáng)調(diào)了腫瘤主動免疫治療時佐劑選擇的重要性。
IFA 誘導(dǎo)的CD11b+細(xì)胞與腫瘤誘導(dǎo)的骨髓來源的抑制性細(xì)胞(MDSC)有許多共同特征。例如,它們都表達(dá)CD11b 和Gr-1[8,9]。然而,它們之間仍有一些差異存在。表型上,CD11b+細(xì)胞較少表達(dá)MHC Ⅰ類分子。在功能上,CD11b+細(xì)胞抑制Con A誘導(dǎo)的T 細(xì)胞增殖,抑制腫瘤抗原誘導(dǎo)的T 細(xì)胞分泌IFN-γ。關(guān)于抑制機(jī)制仍需要更多的研究證實。
我們的發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義。其中一點就是體內(nèi)阻斷CD11b+的生成或者功能可能會阻斷疫苗中弗氏佐劑的破壞作用。有意思的是,體外已有研究證明干擾其功能可減輕腫瘤誘導(dǎo)的MDSC 對T細(xì)胞的抑制作用、恢復(fù)T 細(xì)胞功能和部分恢復(fù)抗腫瘤免疫效果[10]。這一結(jié)果指出了一種可以改善腫瘤免疫效果的方法。
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