馬 倩 蒲 燕 袁文清 呂路線 杜志敏 李萬里 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，新鄉(xiāng) 453003)

抑郁癥是一種常見的心境障礙，心境低落與其處境不相稱，嚴(yán)重者可出現(xiàn)自殺念頭和行為［1］。盡早預(yù)防，中、西藥對于抑郁癥都有一定的治療效果，心底無私天地寬，生命比欲望更重要，耐心開導(dǎo)患者，使患者明白一個(gè)正常的大腦比財(cái)富更重要，只有懂得這個(gè)道理，才能真正配合大夫治好抑郁癥，更能讓患者能夠更加珍惜生命，使得患者的身體和心理得到康復(fù)［2］?；颊叽竽X生化活性物質(zhì)的紊亂是抑郁癥發(fā)病的重要因素。目前的研究表明特定的藥物可能導(dǎo)致或加重抑郁癥，有些激素及類激素的活性物質(zhì)具有改變情緒的作用。在抑郁癥發(fā)生的眾多假說中，“單胺假說”處于主導(dǎo)地位。多數(shù)抗抑郁藥物可以提高腦組織突觸內(nèi)一種或多種單胺神經(jīng)遞質(zhì)的水平［3］。從中草藥、純植物藥中尋找毒性低、療效高的抗抑郁新藥已成為近年國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。香菇多糖(Lentinan，LNT)能夠刺激免疫細(xì)胞的成熟、分化和增殖，改善宿主機(jī)體平衡，達(dá)到恢復(fù)或提高宿主細(xì)胞對淋巴因子、激素及其他生物活性因子的反應(yīng)性作用;LNT 還有抗腫瘤的作用，能誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素，具有抗病毒能力，另外LNT 還具有抗氧化、抗衰老、降血糖等多種生物學(xué)作用［4，5］。本文通過觀察LNT 對慢性應(yīng)激抑郁模型小鼠行為，海馬組織內(nèi)5-HT1A 受體表達(dá)，MDA 含量，SOD 活力以及血清中TNF-α 和IL-6 含量的影響，探討LNT 抗抑郁癥的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取健康成年昆明種小鼠40 只，雄性，體質(zhì)量(20±2)g，SPF 級(鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，許可證號SCXK(豫)2010-002，自由進(jìn)食，用1%蔗糖水喂養(yǎng)3 d，迫使動(dòng)物改變其原來的飲水習(xí)慣。第4 天，進(jìn)行24 h 禁水不禁食，第5 天再次給予1%蔗糖水4 h，測1%蔗糖水偏嗜度。根據(jù)1%蔗糖水偏嗜度和體重隨機(jī)分成4 組，即正常對照組(Normal controls group，NG)、模型對照組(Model control group，MG)、LNT 劑量組(L-LNT，2.5 mg/kg;H-LNT，5.0 mg/kg)。每日1 次，在每天造模實(shí)驗(yàn)開始前1 h 灌胃給藥，連續(xù)給藥28 d。各實(shí)驗(yàn)組均按1.0 ml/100 g 體重給藥。

1.2 主要試劑 辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗，總SOD 活性檢測試劑盒，(NBT 法)脂質(zhì)氧化(MDA)檢測試劑盒等(碧云天生物技術(shù)研究所);注射用LNT(南京綠葉思科藥業(yè)有限公司);TNF-α、IL-6 ELASA 檢測試劑盒(上海研域生物科技有限公司);兔抗5-HT1A 受體(Santa 公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 小鼠慢性應(yīng)激抑郁模型的制造 參照文獻(xiàn)［6］。應(yīng)用輕度不可預(yù)見性的慢性應(yīng)激模型，并加以改良。正常對照組，不給刺激，飲食飲水正常。而模型組及實(shí)驗(yàn)干預(yù)組配合孤養(yǎng)，禁食、禁水(24 h)，并接受不可預(yù)知的應(yīng)激刺激，項(xiàng)目包括:噪聲5 min，強(qiáng)光頂部照射并熱烘5 min，電擊足底(電壓36 V，5 s×5，間隔20 s)，斜籠喂養(yǎng)(24 h)，夾尾3 s×5(間隔20 s)，冰水游泳4℃，5 min，50 ml 塑料離心管中制動(dòng)30 min、禁水24 h，禁食24 h 等，在28 d 的實(shí)驗(yàn)中，每天每只動(dòng)物隨機(jī)僅給予一種刺激，經(jīng)過編排使得5 d 內(nèi)的刺激項(xiàng)目不重復(fù)并且不可預(yù)知。

1.3.2 陌生環(huán)境攝食實(shí)驗(yàn) 禁食動(dòng)物在一個(gè)陌生的環(huán)境中會(huì)產(chǎn)生類似焦慮的沖突反應(yīng)，抗焦慮藥物可使動(dòng)物的沖突反應(yīng)降低，表現(xiàn)為開始吃食的潛伏期縮短?？挂钟魟┞越o藥時(shí)，在此模型上表現(xiàn)出同樣的行為學(xué)活性，但急性給藥沒有此行為活性。實(shí)驗(yàn)時(shí)，在頂部開放的塑料盒(80×80×50)cm3底部鋪約1.0 cm 厚的鋸末，中間均勻擺放15 個(gè)同樣大小的食塊。動(dòng)物禁食24 h 后，放入試驗(yàn)裝置，計(jì)算動(dòng)物開始吃食的潛伏期，吃食的判定標(biāo)準(zhǔn)是動(dòng)物開始咀嚼食物，而不是僅僅嗅食或擺弄食物。以吃食的潛伏期作為參數(shù)判定藥物的行為活性。實(shí)驗(yàn)中測試環(huán)境不同于飼養(yǎng)環(huán)境，測試環(huán)境的光線強(qiáng)度大于飼養(yǎng)環(huán)境，每次應(yīng)從同一位置、同一方向放入小鼠。

1.3.3 強(qiáng)迫游泳應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 在建模第29 天，將小鼠放入水中15 min，誘導(dǎo)無助狀態(tài)。小鼠強(qiáng)迫游泳所用水缸高25 cm，直徑18 cm，水深12 cm，水溫25℃。在建模后第30 天，將小鼠放入水中8 min，記錄后4 min 內(nèi)累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。不動(dòng)是指小鼠在水中停止掙扎，或呈漂浮狀態(tài)，僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部浮在水面，身體沒有全身運(yùn)動(dòng)。

1.3.4 腦組織樣本制備 用10% 水合氯醛350 mg/kg ip 麻醉小鼠，然后將小鼠斷頭處死，迅速在冰上剝離腦組織，于預(yù)冷的PBS 冰水中清洗，正中矢狀面切開，冰臺(tái)上剝離一側(cè)海馬，精密稱重，加入9倍預(yù)冷的0.01 mol/L PBS 制備10%海馬組織勻漿，之后1 600 r/min 離心10 min 取上清用于后續(xù)測定。樣品制備步驟宜在冰浴中進(jìn)行操作，置于-85℃冰箱中備用。剝離另一側(cè)腦組織置4%多聚甲醛溶液固定24 h，用蔗糖溶液4℃梯度脫水:先10%蔗糖沉底后再用15% 蔗糖12 h，20% 蔗糖12 h，最后用30%蔗糖12 h。用錫紙包好置于-70℃冰箱保存待測。

1.3.5 蛋白定量測定 用碧云天BCA 蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量，按說明操作。

1.3.6 ELISA 實(shí)驗(yàn) 檢測血清TNF-α、IL-6 的含量，采用酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。用酶標(biāo)儀在450 nm 波長下測定吸光度(OD 值)，計(jì)算樣品濃度。

1.3.7 SOD 酶活性檢測 SOD 水平測定采用黃嘌呤氧化酶法測定，試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計(jì)的蛋白使用量，適當(dāng)稀釋樣品。根據(jù)說明進(jìn)行操作。

1.3.8 脂質(zhì)氧化(MDA)含量的測定 MDA 水平測定采取硫代巴比妥比色法(TBA 法)測定，根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.3.9 Western blot 海馬組織勻漿提取蛋白，取總蛋白(50 μg)的在12% SDS-PAGE 凝膠上電泳，采用免疫蛋白印記(Western blot)技術(shù)檢測5-HT1A 受體表達(dá)水平，經(jīng)ImageJ 5.0 軟件處理灰度值并進(jìn)行評價(jià)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量資料以±s 表示，采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用LSD 法進(jìn)行組間兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 LNT 對慢性應(yīng)激小鼠陌生環(huán)境攝食潛伏期的影響 經(jīng)過造模后的1、3、5 d 的實(shí)驗(yàn)觀察，MG 小鼠在陌生環(huán)境中攝食潛伏期顯著延長，給予LNT 干預(yù)后，能夠縮短慢性應(yīng)激導(dǎo)致小鼠在陌生環(huán)境中攝食潛伏期的延長，L-LNT 的5 d 以及H-LNT 的1、3、5 d與Model 組相比差別有顯著性(P ＜0.05 或P ＜0.01)，見表1。

2.2 LNT 對抑郁模型小鼠應(yīng)激游泳不動(dòng)時(shí)間的影響 經(jīng)過造模后的1、3、5 d 的實(shí)驗(yàn)觀察，Model 小鼠在水中應(yīng)激游泳不動(dòng)時(shí)間顯著延長，給予LNT 干預(yù)后，能夠顯著縮短慢性應(yīng)激導(dǎo)致小鼠在水中應(yīng)激游泳不動(dòng)時(shí)間的延長，L-LNT 的5 d 以及H-LNT 的3 d，5 d 與Model 組相比差別有顯著性(P＜0.05 或P＜0.01)，見表2。

2.3 小鼠海馬5-HT1A 受體表達(dá) 與正常對照NG組相比，模型組小鼠海馬中5-HT1A 受體表達(dá)水平明顯減少(P＜0.01)，給予不同劑量LNT 后5-HT1A受體表達(dá)增強(qiáng)，與模型MG 組相比，增強(qiáng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著意義(P＜0.05 或P＜0.01)，見圖1。

2.4 LNT 對小鼠海馬SOD、MDA 含量的影響 慢性應(yīng)激刺激后，與NG 組相比MG 組SOD 含量顯著降低(P＜0.01)，LNT干預(yù)組SOD有所升高，與MG組相比H-LNT 組升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(P ＜0.01);與NG 組相比MG 組MDA 含量顯著升高(P＜0.01)，LNT 干預(yù)組MDA 含量有下降趨勢，與MG 組相比H-LNT 組下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(P ＜0.05)，見表3。

表1 陌生環(huán)境攝食潛伏期(±s，n=10，s)Tab.1 Strange environment feeding latency(±s，n=10，s)

表1 陌生環(huán)境攝食潛伏期(±s，n=10，s)Tab.1 Strange environment feeding latency(±s，n=10，s)

Note:Vs NG，1)P＜0.01;vs MG，2)P＜0.05，3)P＜0.01.

表2 小鼠應(yīng)激游泳不動(dòng)時(shí)間(±s，n=10，s)Tab.2 Stress non swimming time(±s，n=10，s)

表2 小鼠應(yīng)激游泳不動(dòng)時(shí)間(±s，n=10，s)Tab.2 Stress non swimming time(±s，n=10，s)

Note:Vs NG，1)P＜0.01;vs MG，2)P＜0.05，3)P＜0.01.

表3 LNT 對慢性應(yīng)激小鼠模型小鼠海馬SOD、MDA 含量的影響(±s，n=10)Tab.3 Effect of LNT on content of SOD，MDA in hippocampus of mice(±s，n=10)

表3 LNT 對慢性應(yīng)激小鼠模型小鼠海馬SOD、MDA 含量的影響(±s，n=10)Tab.3 Effect of LNT on content of SOD，MDA in hippocampus of mice(±s，n=10)

Note:Vs NG，1)P＜0.01，2)P＜0.05，vs MG，3)P＜0.01.

圖1 LNT 對小鼠海馬5-HT1A 受體表達(dá)的影響Fig.1 Effect of LNT on expression of 5-HT1A receptor in hippocampus of mice

圖2 LNT 對小鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平的影響Fig.2 Effect of LNT on serum level of TNF-α and IL-6 in mice

2.5 LNT 對抑郁模型小鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平的影響 給予慢性應(yīng)激刺激后，模型組小鼠血清中TNF-α 和IL-6 明顯增多，給予不同劑量LNT 后血清中TNF-α 和IL-6 明顯減少(P ＜0.05 或P ＜0.01)，見圖1、2。

3 討論

香菇多糖(Lentinan，LNT)的免疫調(diào)節(jié)作用是其生物活性的重要基礎(chǔ)。LNT 具有典型的T 細(xì)胞激活劑的功能，促進(jìn)白細(xì)胞介素的產(chǎn)生，還能促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的功能，目前已經(jīng)被認(rèn)為是一種特殊免疫增強(qiáng)劑。有抗腫瘤活性。在體內(nèi)能使脾臟和腹腔的NK 細(xì)胞活性增強(qiáng)，誘生細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其活性與白細(xì)胞介素類或干擾素誘導(dǎo)劑有協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)表明慢性應(yīng)激導(dǎo)致的自發(fā)活動(dòng)減少，小鼠平均游泳不動(dòng)時(shí)間延長，模型組均較對照組顯著增加，LNT 能顯著改善慢性應(yīng)激導(dǎo)致的游泳不動(dòng)時(shí)間的延長，結(jié)合陌生環(huán)境攝食的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，慢性應(yīng)激導(dǎo)致小鼠在陌生環(huán)境中平均攝食潛伏期顯著延長，給予LNT 可顯著縮短平均攝食潛伏期，表明LNT 在此抑郁模型上具有抗抑郁活性，抑郁癥的研究離不開有效動(dòng)物模型的建立，國內(nèi)外已有學(xué)者分別用糖皮質(zhì)激素、孤養(yǎng)、電誘導(dǎo)、藥物誘導(dǎo)、嗅球切除、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方法來構(gòu)建抑郁癥動(dòng)物模型。通過CUMS 模型有效模擬了人們在日常生活中所遇到的不良環(huán)境［7］。有藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明［8］，隨著5-HT 再攝取抑制劑的使用，患者血清中5-HT 的濃度增高，患者的軀體僵直及運(yùn)動(dòng)遲緩得到改善，但是藥物治療的起效出現(xiàn)延遲，這表示該種機(jī)制僅為抑郁癥發(fā)病機(jī)制的一部分，這些變化可能反映血清素代謝的大腦突觸的改變。而神經(jīng)可塑性機(jī)制的存在，一定程度上解釋了這種效應(yīng)延遲現(xiàn)象。我們的研究證實(shí):模型小鼠出現(xiàn)海馬內(nèi)5-HT 含量及5-HT1A 受體表達(dá)降低，LNT干預(yù)后5-HT 含量升高及5-HT1A 受體表達(dá)增強(qiáng)有助于緩解抑郁癥的癥狀。

MDA 含量升高能使細(xì)胞膜變性、壞死，使DNA發(fā)生突變、斷裂、交鏈，并使SOD 的生物活性降低。近來研究表明，大腦在損傷的過程中，神經(jīng)細(xì)胞膜不飽和脂肪酸被氧化將產(chǎn)生大量的自由基，造成細(xì)胞生物膜損傷，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，最終將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、退行性病變，并進(jìn)一步引起大腦損傷連鎖反應(yīng)的惡性循環(huán)。海馬在大腦中作為邊緣系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu)，在情緒形成、學(xué)習(xí)記憶以及內(nèi)臟活動(dòng)調(diào)節(jié)等諸多方面均發(fā)揮著重要作用。在抑郁癥發(fā)病中海馬起著重要的作用，有研究表明抑郁癥患者的海馬結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯萎縮，海馬CA3 區(qū)出現(xiàn)細(xì)胞層次減少、細(xì)胞損傷、細(xì)胞器破壞等［9］。內(nèi)環(huán)境是細(xì)胞與外界交流的橋梁。本研究表明慢性應(yīng)激可導(dǎo)致小鼠海馬MDA水平增高，SOD 活力降低，與對照組相比差異有顯著性。LNT 干預(yù)治療組與模型組比較，海馬組織MDA 水平降低，SOD 活力增高。慢性應(yīng)激導(dǎo)致小鼠抑郁癥的病理生理變化中，氧化與抗氧化的失衡是至關(guān)重要的因素之一。LNT 可使小鼠腦組織中的氧自由基得到清除，使得海馬組織細(xì)胞受自由基攻擊損傷的程度減輕，其作用機(jī)制可能在于它抑制了氧自由基的釋放，同時(shí)增強(qiáng)SOD 的活性及SOD 對氧自由基的清除作用，促進(jìn)了體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡，從而保護(hù)細(xì)胞膜，減輕腦損傷。

神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)發(fā)生的改變在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，有證據(jù)表明，血-腦屏障是可滲透的細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞，并且傳入神經(jīng)，例如迷走神經(jīng)，調(diào)解外周炎性過程和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的通信。有研究表明慢性不可預(yù)見性刺激所致抑郁小鼠血清中TNF-α 和IL-6 含量明顯增多，5-HT 的水平與TNF-α 和IL-6 表達(dá)的水平相互拮抗，在慢性不可預(yù)見性刺激下，誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞可合成并分泌IL-6 和TNF-α 等細(xì)胞因子，IL-6 有可能直接刺激下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸，而HPA 軸功能亢進(jìn)在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［10］。有報(bào)道香菇多糖可在免疫應(yīng)答的主要部分保持不變的情況下，減少急性炎癥反應(yīng)的基因表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫減少有害的反應(yīng)等效果。本文觀察到對于應(yīng)激模型動(dòng)物，中小劑量的香菇多糖可能表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)作用，這一點(diǎn)與國外有關(guān)報(bào)道一致［11］。

推測LNT 干預(yù)后5-HT 含量升高及5-HT1A 受體表達(dá)增強(qiáng)有助于體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡，進(jìn)而使單胺遞質(zhì)改變并通過作用于免疫細(xì)胞，抑制細(xì)胞因子過度表達(dá)，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，從而保護(hù)細(xì)胞膜，減輕腦損傷，最終產(chǎn)生抗抑郁治療作用。

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