李秀梅 王國英 張 文 高美華 張 蓓 沈若武 叢蓓蓓

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，青島 266071)

特應(yīng)性皮炎(Atopic dermatitis，AD)是一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病，具有家族遺傳傾向。AD患者血液中IgE 水平升高，嗜酸性粒細(xì)胞增多。臨床上表現(xiàn)為皮膚干燥、紅斑、丘疹、水皰、滲出，重者可累及全身，常并發(fā)感染［1］。

AD 發(fā)病率較高，兒童發(fā)病率為15%～30%，成人發(fā)病率為2%～10%。在過去的30 年里，AD的發(fā)病率增長了約3 倍，尤其是在工業(yè)化國家，AD的發(fā)病率增長更為明顯［2］。迄今，臨床上沒有有效根治AD 的方法，主要應(yīng)用激素治療，但長期使用激素會(huì)引起較多的副作用。AD 的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，普遍觀點(diǎn)認(rèn)為與Th1/Th2 失衡有關(guān)，在AD 的發(fā)病過程中，Th2 免疫反應(yīng)占主導(dǎo)地位，Th1免疫反應(yīng)下降［3］。眾所周知，Th1 和Th2 具有相互抑制作用，因此，如何提高患者Th1 免疫功能從而抑制其Th2 免疫功能，成為尋找預(yù)防及治療AD 新方法的突破點(diǎn)。

甲殼質(zhì)(Chitin)，又稱聚乙酰氨基葡萄糖，是一種生物高分子聚合物，廣泛存在于無脊椎動(dòng)物的外殼和菌類的細(xì)胞壁中，來源廣泛，產(chǎn)量僅次于纖維素，是自然界第二大有機(jī)物質(zhì)。目前，在醫(yī)用材料上的應(yīng)用研究非常多［4-7］，發(fā)現(xiàn)其具有良好的生物相容性、無生物毒性。近期有報(bào)道1～10 μmol/L 的甲殼質(zhì)顆粒具有誘導(dǎo)機(jī)體Th1 型免疫反應(yīng)、抑制Th2型反應(yīng)的作用［8］，在過敏性哮喘及過敏性腸炎的動(dòng)物模型中，甲殼質(zhì)具有減輕過敏體征、改善局部病變的作用［9］。過敏性哮喘、過敏性腸炎及AD 同屬特應(yīng)性疾病，甲殼質(zhì)這種抗過敏作用是否對AD 同樣有效，目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用小鼠AD 動(dòng)物模型探討甲殼質(zhì)對AD 的形成與發(fā)展的影響，為甲殼質(zhì)用于治療特應(yīng)性皮炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級6～8 周齡BALB/c 雌鼠，體重(20±2)g，共28 只，購自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑及儀器 卵清蛋白(Ovalbumin，A5503，V 級)購自美國Sigma 公司，甲殼質(zhì)(Chitin)、刀豆蛋白A(ConA)、紅細(xì)胞裂解液(R1010)、ELISA 試劑盒購自上海索萊寶公司，氫氧化鋁［Al(OH)3］購自天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，胎牛血清購自北京全式金生物技術(shù)有限公司(Lot#60416)，RPMI1640 購自上海拜力生物科技有限公司HyClone 公司(SH30809.01B)。Olympus BX50 PM-CBAD 顯微照相裝置，Hitachi 低溫離心機(jī)，雷杜PT-6100 酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立 小鼠隨機(jī)分為3 組:對照組(8 只)、模型組(10 只)、甲殼質(zhì)組(10 只)。三組動(dòng)物在第0、5 天分別進(jìn)行腹腔注射，模型組腹腔注射卵清蛋白(OVA)液0.2 ml［含20 μg OVA 和2 mg Al(OH)3］，甲殼質(zhì)組注射OVA 與甲殼質(zhì)的混合液0.2 ml(含20 μg OVA 和25 μg 甲殼質(zhì))，正常對照組注射等量生理鹽水。從第12 天開始，每天給小鼠進(jìn)行灌胃直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，正常對照組和模型組每日灌胃0.2 ml 生理鹽水，甲殼質(zhì)組每日灌胃0.2 ml 甲殼質(zhì)懸液(3 mg/d)。從第15 天開始，小鼠背部皮膚外用OVA 進(jìn)行皮膚激發(fā)，方法參考文獻(xiàn)［10］，簡述如下:用電動(dòng)剃須刀將小鼠背部皮膚剃光，將浸有100 μl 0.1%OVA 溶液的1 cm2大小的四層紗布敷在模型組及甲殼質(zhì)組小鼠背部，外用膠帶貼緊，對照組小鼠用浸有生理鹽水的紗布外敷。1 周后將紗布取下，中間休息2 周，于第36 天重復(fù)皮膚激發(fā)1 周，第43 天處死動(dòng)物(圖1)，心臟取血，分離血清用于抗體測定。背部激發(fā)部位皮膚取材，置于10%福爾馬林液中固定。取脾臟進(jìn)行脾細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2.2 甲殼質(zhì)顆粒的制備 將購得的甲殼質(zhì)粉末放入研缽中研磨，過1250 目不銹鋼網(wǎng)篩，得到≤10 μm 的甲殼質(zhì)小顆粒。將得到的甲殼質(zhì)小顆粒以10 mg/ml 懸于生理鹽水中，5 600 r/min 離心10 min，棄上清，得到1～10 μm 的甲殼質(zhì)顆粒［11，12］。

1.2.3 皮膚組織的標(biāo)本制備及病理學(xué)觀察 小鼠背部取材的皮膚組織用10%福爾馬林溶液固定，經(jīng)酒精梯度脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片，用蘇木精-伊紅(HE)染色及甲苯胺藍(lán)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠炎癥處皮膚的病理變化。比較各組小鼠皮膚表皮層與真皮層的厚度變化，在高倍鏡下計(jì)數(shù)浸潤的炎性細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)變化。

1.2.4 脾細(xì)胞培養(yǎng) 無菌條件下取小鼠脾臟，分別將各組小鼠的脾臟混合［13］，置于200 目不銹鋼濾網(wǎng)，用注射器內(nèi)芯輕輕碾碎研磨，RPMI1640 培養(yǎng)液沖洗濾過，收集脾細(xì)胞懸液［14］。1 000 r/min，離心5 min，棄上清。加RPMI1640 吹打，分散細(xì)胞。加入3 倍于RPMI1640 液體量的紅細(xì)胞裂解液，靜置5 min。1 000 r/min，離心5 min，棄上清。用滅菌的PBS 緩沖液沖洗細(xì)胞兩次，1 000 r/min，離心5 min，棄上清。再次加PBS 緩沖液，取10 μl 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為5～10 ml，1 000 r/min，離心3 min，棄上清。最后加入含10%小牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液(血清5 ml，雙抗500 μl，加RPMI1640 定容至50 ml)，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。24 h 后加入藥物刺激，各組小鼠脾細(xì)胞分三個(gè)處理組，ConA 刺激組［5 μg/(ml·well)］，OVA刺激組［50 μg/(ml·well)］，chitin 刺激組［100 μg/(ml·well)］，每個(gè)處理組設(shè)置3 個(gè)平行孔進(jìn)行培養(yǎng)。孵育72 h，1 000 r/min，5 min 離心，收集細(xì)胞上清液，置-20℃冰箱保存用于細(xì)胞因子檢測。

圖1 AD 動(dòng)物模型的建立Fig.1 Establishment of AD murine model

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 采用ELISA 法檢測血清總IgE、總IgG2a、OVA-特異性IgE 水平及脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-12、IFN-γ 細(xì)胞因子的水平。操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，在450 nm 波長測定吸光度(OD)值，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。本實(shí)驗(yàn)所有結(jié)果均以±s 表示，實(shí)驗(yàn)組之間用t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲殼質(zhì)減輕AD 小鼠背部皮膚的炎癥病理變化 經(jīng)過腹腔注射OVA 及背部皮膚外用OVA 激發(fā)實(shí)驗(yàn)，模型組小鼠背部皮膚肉眼觀察可見明顯紅斑、肥厚及脫屑，正常對照組小鼠皮膚未見明顯異常，而甲殼質(zhì)組小鼠背部皮膚增厚較輕。顯微鏡下觀察，對照組小鼠的皮膚結(jié)構(gòu)規(guī)則，皮膚厚度正常，真皮層無明顯炎癥細(xì)胞浸潤。模型組小鼠表皮及真皮均明顯不規(guī)則增厚，真皮層纖維組織增多且有大量的炎癥細(xì)胞浸潤。甲殼質(zhì)組表皮與真皮的增厚程度、炎癥細(xì)胞的浸潤程度均介于對照組與模型組之間(圖2)。與模型組比較，甲殼質(zhì)組小鼠真皮中的炎細(xì)胞浸潤總數(shù)明顯減少(圖3A)，差異顯著(P＜0.05);嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖3B)。甲苯胺藍(lán)染色顯示，模型組小鼠皮膚全層內(nèi)肥大細(xì)胞數(shù)量明顯增多，與對照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)，較多肥大細(xì)胞胞膜不完整，有脫顆粒現(xiàn)象。甲殼質(zhì)組小鼠皮膚全層浸潤的肥大細(xì)胞數(shù)量比模型組減少，差異顯著(P＜0.01)(圖4)。

圖2 小鼠背部皮膚組織病理學(xué)變化(HE 染色，10×10)Fig.2 Pathological changes of mice back skin (HE staining，10×10)

圖3 小鼠背部皮膚炎細(xì)胞浸潤數(shù)量Fig.3 Skin infiltration of inflammatory cells

圖4 小鼠皮膚組織中肥大細(xì)胞的分布(甲苯胺藍(lán)染色，10×10)Fig.4 Distribution of mast cells in mice skin (O-toluidine blue staining，10×10)

圖5 小鼠血清中抗體水平Fig.5 Serum levels of antibodies in mice

圖6 OVA 刺激脾細(xì)胞后培養(yǎng)液中IL-4、IL-12 和IFN-γ 的水平Fig.6 Cytokine levels produced by cultured spleen cells challenged with OVA

圖7 甲殼素刺激脾細(xì)胞后培養(yǎng)液中IL-12 和IFN-γ 的水平Fig.7 Levels of IL-12 and IFN-γ produced by cultured normal mice splenocyte challenged with chitin

2.2 甲殼質(zhì)降低了AD 小鼠血清中IgE 水平，提高了IgG2a 水平 為了觀察AD 小鼠Th1 型和Th2 型抗體水平的變化，動(dòng)物模型建成后，取小鼠心臟血液檢測血清中IgE 和IgG2a 水平。反復(fù)腹腔注射及皮膚外用OVA 刺激后，模型組小鼠血清中總IgE 和OVA 特異性IgE 水平明顯升高，與對照組比較有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)(圖5A、B)，甲殼質(zhì)組小鼠血清中總IgE 和OVA 特異性IgE 水平與模型組相比均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，P＜0.001)(圖5A、B)。另外，甲殼質(zhì)組小鼠血清總IgG2a 水平明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)(圖5C)。

2.3 甲殼質(zhì)提高脾細(xì)胞IFN-γ 水平，降低IL-4 水平 為了檢測長期應(yīng)用甲殼質(zhì)灌胃能否誘導(dǎo)AD 小鼠產(chǎn)生Th1 型細(xì)胞因子，抑制Th2 型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在動(dòng)物模型建成后，取各組小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并在培養(yǎng)液中加OVA 進(jìn)行刺激，收集培養(yǎng)液上清，用ELISA 法測定IL-4、IL-12 及IFN-γ 蛋白水平。與模型組相比，甲殼質(zhì)組脾細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4明顯降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相反，甲殼質(zhì)組脾細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12 及IFN-γ 均比模型組高，其中IFN-γ 水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(圖6)。

在正常對照組小鼠的脾細(xì)胞培養(yǎng)體系中分別加入甲殼質(zhì)和ConA 進(jìn)行體外刺激，結(jié)果顯示甲殼質(zhì)體外刺激組，與ConA 刺激組相比，IL-12 的水平有所增高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而IFN-γ 顯著增高(P ＜0.001)(圖7)。

3 討論

特應(yīng)性皮炎(Atopic dermatitis，AD)因其逐漸上升的高發(fā)病率、臨床特效療法的缺乏及部分患者最終發(fā)展成過敏性哮喘、過敏性腸炎已引起全球臨床醫(yī)生及科研工作者的重視。AD 患者免疫系統(tǒng)Th1/Th2 失衡，以Th2 型免疫反應(yīng)為主［3］。眾所周知，Th1 與Th2 型免疫反應(yīng)相互抑制，因此，誘導(dǎo)AD 患者的Th1 型反應(yīng)從而起到抑制AD 患者Th2 型免疫反應(yīng)，達(dá)到預(yù)防及治療AD 的目的成為此研究領(lǐng)域的一個(gè)熱門方向，其中，尋找合適的Th1 誘導(dǎo)劑是該領(lǐng)域的關(guān)鍵。本研究利用OVA 誘導(dǎo)的小鼠AD模型，探討了甲殼質(zhì)對AD 的調(diào)節(jié)作用，研究結(jié)果證實(shí)甲殼質(zhì)能夠誘發(fā)AD 小鼠產(chǎn)生Th1 型細(xì)胞因子，抑制AD 的Th2 型免疫反應(yīng)，減輕AD 皮膚炎癥，為開發(fā)甲殼質(zhì)的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)在Spergel 試驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上［10］，改進(jìn)了建立AD 動(dòng)物模型的方法，先行小鼠腹腔注射OVA 致敏小鼠，后在小鼠背部外用OVA 激發(fā)小鼠的皮膚過敏反應(yīng)。動(dòng)物模型組在OVA 皮膚激發(fā)兩周后，出現(xiàn)皮膚增厚，真皮內(nèi)大量炎細(xì)胞浸潤，包括較多的嗜酸性粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞浸潤，血清IgE 顯著增高，其組織病理學(xué)及血清學(xué)改變均符合AD 動(dòng)物模型的特點(diǎn)［1］。

在利用OVA 進(jìn)行動(dòng)物模型建立的同時(shí)，給予小鼠甲殼質(zhì)腹腔注射及長達(dá)四周時(shí)間的甲殼質(zhì)灌胃(甲殼質(zhì)組)，發(fā)現(xiàn)甲殼質(zhì)能夠減輕AD 小鼠背部皮膚的炎癥，改善皮膚的病理組織變化，特別是減少真皮內(nèi)浸潤的嗜酸性粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞的數(shù)量，降低血清中IgE 的水平，說明甲殼質(zhì)具有調(diào)節(jié)改善AD的作用。

為了進(jìn)一步探討甲殼質(zhì)改善AD 的作用機(jī)制，本研究進(jìn)行了小鼠脾細(xì)胞的體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)系統(tǒng)中加入甲殼質(zhì)，結(jié)果顯示甲殼質(zhì)能夠刺激正常小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-12 及INF-γ，這與Strong 等［9］報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，說明甲殼質(zhì)在體外能夠誘導(dǎo)正常小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生Th1 細(xì)胞因子。若用OVA 刺激培養(yǎng)的脾細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)甲殼質(zhì)組小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12和IFN-γ 水平明顯高于模型組，說明甲殼質(zhì)在體內(nèi)能夠誘導(dǎo)AD 小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生Th1 型細(xì)胞因子，這種作用被甲殼質(zhì)組小鼠產(chǎn)生較高水平的IgG2a 進(jìn)一步證實(shí)。根據(jù)Th1 與Th2 型免疫反應(yīng)相互抑制的原理，甲殼質(zhì)誘導(dǎo)的Th1 型細(xì)胞因子能夠抑制OVA 誘導(dǎo)的Th2 型免疫反應(yīng)，從而降低AD 小鼠的血清IgE水平，減輕局部皮膚的炎癥反應(yīng)。

不同直徑大小的甲殼質(zhì)顆粒在機(jī)體中的作用不同，有報(bào)道直徑＞100 μm 的甲殼質(zhì)顆粒不起作用，直徑在40～70 μm 的甲殼質(zhì)顆粒引起炎癥反應(yīng)，而直徑在1～10 μm 的甲殼質(zhì)顆粒能夠調(diào)節(jié)呼吸系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)［8，15］。本研究結(jié)果證實(shí)了1～10 μm 的甲殼質(zhì)顆粒對過敏性炎癥反應(yīng)有調(diào)節(jié)作用。甲殼質(zhì)在AD 動(dòng)物模型中的調(diào)節(jié)作用與以往報(bào)道的甲殼質(zhì)在哮喘動(dòng)物模型、腸炎動(dòng)物模型中的作用相似［13，16］。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示甲殼質(zhì)通過誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th1 型細(xì)胞因子抑制AD 的Th2 型免疫反應(yīng)，從而起到緩解AD 皮膚炎癥的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為今后甲殼質(zhì)應(yīng)用于臨床預(yù)防治療過敏性疾病提供了科學(xué)依據(jù)。

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