鄒倩蕾 張國俊 鄭雅靜 張會杰 王瑞芳 王 俠 宋向鳳 王 輝

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院，新鄉(xiāng) 453003)

隨著人們生活方式和生活習慣的改變，全世界范圍內(nèi)肥胖相關(guān)疾病的發(fā)病率逐年增高［1］。WHO已將肥胖定位為一種重要的疾病，它已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題。肥胖伴隨的局部及全身慢性低度炎癥狀態(tài)已經(jīng)得到研究者的廣泛認可［2，3］。但目前關(guān)于炎癥的發(fā)生機制還未完全闡明。研究顯示，肥胖的脂肪組織內(nèi)有多種免疫細胞的聚集［4］。T 淋巴細胞是適應(yīng)性免疫的主要細胞，根據(jù)功能和產(chǎn)生的細胞因子的不同，T 細胞可分為CD4+T 細胞和CD8+T 細胞，而CD4+T 細胞又分為Th1、Th2 和Th17 細胞［5，6］。本研究通過高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠建立肥胖模型，探討脂肪組織內(nèi)Th1、Th2 和Th17 細胞的變化規(guī)律，為肥胖癥及其相關(guān)疾病的機制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 C57BL/6 雄性小鼠購于北京維通利華公司;動物高脂飼料購于美國Research Diets Inc，含60%脂肪熱能;小鼠TNF-α ELISA 試劑盒、Th1、Th2和Th17 細胞流式檢測試劑盒購于美國BD 公司;膠原酶Ⅱ購于Sigma 公司。

1.2 高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肥胖模型的建立 5 周齡的雄性C57BL/6 小鼠常規(guī)飼養(yǎng)在清潔級動物房，保持溫度在22℃～26℃，濕度40%～60%，隨意自由飲水和進食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后將小鼠隨機分為2組，高脂組(HFD，給予高脂飼料)和對照組(NFD，給予標準飼料)，喂養(yǎng)16 周，每天觀察，每周稱重。

1.3 血脂及葡萄糖的測定 高脂飲食16 周后眼球采血分離血漿，用全自動生化分析儀檢測總膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和血糖(GLU)的含量。

1.4 內(nèi)臟脂肪含量和免疫器官指數(shù)的測定 高脂飲食16 周后，頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，游離附睪墊脂肪組織和腎周脂肪組織，稱取重量，計算內(nèi)臟脂肪系數(shù):附睪墊脂肪濕重/體重，腎周脂肪濕量/體重;同時剪取脾臟和胸腺，稱重并計算指數(shù):脾臟重量/體重，胸腺重量/體重。

1.5 脂肪組織內(nèi)細胞的分離及流式測定 取小鼠附睪墊脂肪組織，剪碎后加入1 mg/ml 的Ⅱ型膠原酶，37℃消化2 h，1 000 r/min 離心10 min 后取沉淀中的細胞，用PBS 洗滌2 次后加入RPMI1640 完全培養(yǎng)液(10% 胎牛血清)，同時加入PMA(終濃度100 ng/ml)、Ionomycin(終濃度1 μg/ml)和TPI，37℃培養(yǎng)5 h，分別用CD4、CD8、CD3、Th1、Th2、Th17 抗體孵育后進行流式檢測。

1.6 血清TNF-α 的測定 采用ELISA 試劑盒測定血清中TNF-α 的含量，操作按說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食對小鼠體重及體重增加的影響 高脂飲食16 周后小鼠的體重從(19.9±0.20)g 增加到(48.4±3.28)g，而對照組小鼠體重從(19.8±0.62)g增加到(32.0±1.42)g，高脂組小鼠體重平均增加了(28.2±2.50)g，對照組小鼠平均增加了(12.2±1.46)g，兩組之間對比有顯著的統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。

2.2 高脂飲食對小鼠體內(nèi)脂肪含量的影響 與正常對照組相比，高脂飲食16 周的小鼠附睪脂肪重量是對照組的4.8 倍左右，腎周脂肪重量是對照組的6.7 倍左右，脂肪指數(shù)也顯著不同，脾臟指數(shù)有增大的趨勢，胸腺指數(shù)有縮小的趨勢，但兩組間未見顯著差別(圖1)。

2.3 高脂飲食對小鼠脂代謝的影響 由圖2 可知，高脂飲食16 周后小鼠血清中CHOL、TG、HDL 和LDL 含量較對照組均明顯增高，但TG 增加相對較少，HDL/LDL 比值無明顯變化。

2.4 高脂飲食對小鼠附睪墊脂肪組織內(nèi)T 淋巴細胞的影響 高脂飲食16 周后小鼠脂肪組織內(nèi)CD3+、CD4+和CD8+T 淋巴細胞數(shù)均較對照組有所增高，其中CD8+T 淋巴細胞增多最顯著，進一步分析CD4+T 淋巴細胞的亞群組成比例發(fā)現(xiàn)，高脂飲食組小鼠脂肪組織內(nèi)Th1 和Th17 T 淋巴細胞與對照組相比顯著增多，而Th2 細胞未見顯著差別(圖3)。

圖1 高脂飲食對小鼠內(nèi)臟脂肪含量的影響Fig.1 Effect of high fat diet on mice visceral fat

圖2 高脂飲食對小鼠血脂水平的影響Fig.2 Effect of high fat diet on mice blood lipids

2.5 高脂飲食對小鼠血清中血糖和TNF-α 產(chǎn)生的影響 高脂飲食16周后小鼠外周血血糖水平達到(10.10± 0.58)mmol/L，顯著高于對照組的(6.4±0.44)mmol/L，同樣TNF-α 的水平也比對照組明顯增高，是對照組的4.7 倍［(23.24±7.38)pg/ml vs(109.36±16.41)pg/ml］，差異具有統(tǒng)計學意義。

圖3 高脂飲食對小鼠附睪脂肪組織內(nèi)T 淋巴細胞的影響Fig.3 Effect of high fat diet on T lymphocyte in mice epididymal fat tissue

表1 T 細胞亞群及TNF-α 與體重、內(nèi)臟脂肪指數(shù)、葡萄糖和膽固醇的相關(guān)性分析Tab.1 Analysis on correlation between T cell subsets，TNF-α and body weight (BW)，cholesterol (GHOL)，Glucose(GLU)，epididymis fat index (EFI)and perirenal fat index (PFI)

2.6 各指標間的相關(guān)性分析 綜合以上結(jié)果，我們對肥胖的指標、血脂和T 細胞亞群變化做了相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠脂肪中CD4+T 細胞、CD8+T 細胞、Th1、Th17、TNF-α 與體重、附睪脂肪指數(shù)、腎周脂肪指數(shù)、血中總膽固醇、葡萄糖均呈極顯著的正相關(guān)(表1)。

3 討論

目前肥胖已經(jīng)成為現(xiàn)代社會影響人類健康的重要因素之一，越來越多的研究證明許多疾病與肥胖密切相關(guān)，如Ⅱ型糖尿病、心臟病、脂肪肝、動脈粥樣硬化、癌癥等，因此對肥胖的研究已經(jīng)成為研究熱點［7，8］。高脂飲食誘導(dǎo)肥胖是常用的肥胖動物模型，本研究中，我們首先用高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6雄性小鼠建立肥胖動物模型，結(jié)果顯示高脂飲食16周后，小鼠的體重和血脂與對照組相比顯著升高，平均體重是對照組的1.5 倍，增加的體重是普通飲食組的2.3 倍。體重的增加主要出現(xiàn)在內(nèi)臟脂肪和皮下脂肪的增多，一般認為，內(nèi)臟脂肪在疾病的發(fā)生中扮演了重要角色［9］。我們的結(jié)果顯示了高脂組的附睪脂肪墊重量、腎周脂肪重量以及與體重之比明顯高于正常對照組，說明高脂飲食可誘導(dǎo)小鼠內(nèi)臟脂肪的增加，引起腹型肥胖的發(fā)生。

肥胖伴隨的局部及全身慢性低度炎癥狀態(tài)是多種疾病發(fā)生的重要原因［10］。脂肪組織內(nèi)有多種免疫細胞的聚集，如巨噬細胞、中性粒細胞、T 細胞、B細胞、NKT 細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞等等［11，12］。隨著肥胖的發(fā)生，這些免疫細胞的種類和數(shù)量均發(fā)生了變化，如巨噬細胞由M2 型轉(zhuǎn)變成M1型［13］。T 淋巴細胞是適應(yīng)性免疫應(yīng)答的主要細胞，具有很大的異質(zhì)性。在2009 年有三個小組分別在遺傳性肥胖小鼠模型和高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠中證明了脂肪組織中浸潤的T 細胞對胰島素抵抗起著關(guān)鍵的作用［14-16］。我們在高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖模型中沒有檢測到免疫器官胸腺和脾臟指數(shù)的改變，同時外周血中的T 淋巴細胞也未發(fā)生顯著的改變，但用流式檢測到了附睪墊脂肪組織內(nèi)T 淋巴細胞的異常情況，CD3+、CD4+和CD8+T 淋巴細胞數(shù)均較普通飲食組有所增高，其中CD8+T 淋巴細胞增多最顯著，這和之前的研究一致［17，18］。CD4+T 細胞根據(jù)功能和產(chǎn)生的細胞因子的不同又分為Th 細胞和Treg 細胞，Th 細胞又分為Th1 細胞、Th2 細胞和Th17 細胞，我們進一步分析CD4+T 淋巴細胞的亞群組成比例變化，發(fā)現(xiàn)高脂飲食組脂肪組織內(nèi)出現(xiàn)Th1 和Th17 T 淋巴細胞極化現(xiàn)象。有研究提示，Th1 和Th17 細胞通過產(chǎn)生IL-1、IL-6 和TNFα 和RANTES 增強巨噬細胞的前炎癥功能，促進脂肪組織炎癥，而Th2 通過調(diào)節(jié)巨噬細胞使其分化為抗炎的M2 細胞而抑制炎癥的發(fā)生［19］。隨著肥胖的進展，脂肪組織內(nèi)T 淋巴細胞的增多早于巨噬細胞［15］，這提示T 細胞亞群的改變或再分布可能影響巨噬細胞的功能，從而誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生。

總之，我們的研究證明了高脂飲食可以誘導(dǎo)小鼠腹型肥胖的發(fā)生，增加脂肪組織內(nèi)CD3+、CD4+和CD8+T 淋巴細胞數(shù)量，使CD4+T 細胞朝向Th1 和Th17 方向極化，這為肥胖誘導(dǎo)局部炎癥的發(fā)生提供了理論基礎(chǔ)。

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